Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

Resumen

Este protocolo describe un método fácil para extraer y fraccionar transcripciones de tejidos vegetales sobre la base del número de ribosomas unidos. Permite una estimación global de la actividad de traducción y la determinación del estado de traducción de ARNm específicos.

Resumen

La traducción del ARNm a proteína es un proceso biológico fundamental y altamente regulado. El perfil de polisomas se considera un estándar de oro para el análisis de la regulación traslacional. El método descrito aquí es una forma fácil y económica de fraccionar polisomas a partir de diversos tejidos vegetales. Se realiza un degradado de sacarosa sin necesidad de un creador de degradados mediante la congelación secuencial de cada capa. A continuación, los extractos citosólicos se preparan en un tampón que contiene cicloheximida y cloranfenicol para inmovilizar los ribosomas citosólicos y cloroplásticos a ARNm y se cargan en el gradiente de sacarosa. Después de la centrifugación, se recogen seis fracciones directamente desde la parte inferior hasta la parte superior del gradiente, sin perforar el tubo de ultracentrifugación. Durante la recolección, la absorbancia a 260 nm se lee continuamente para generar un perfil de polisomas que proporciona una instantánea de la actividad traslacional global. A continuación, las fracciones se agrupan para preparar tres poblaciones de ARNm diferentes: los polisomas, ARNm unidos a varios ribosomas; los monosomas, ARNm unidos a un ribosoma; y ARNm que no están unidos a los ribosomas. A continuación, se extraen los ARNm. Este protocolo ha sido validado para diferentes plantas y tejidos, incluyendo plántulas y plantas adultas de Arabidopsis thaliana, hojas de Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersecum y Oryza sativa.

Introducción

La síntesis de proteínas es un proceso esencial y energéticamente costoso en todas las células ^1. En primer lugar, las células deben invertir energía en la producción de la maquinaria de traducción, los ribosomas. Por ejemplo, una célula de levadura dividiendo activamente produce tanto como 2000 ribosomas por minuto. Una producción de este tipo requiere de hasta 60% de la actividad transcripcional total y hasta 90% de la actividad total de empalme de la célula ^2. Además, se requiere energía para la síntesis de aminoácidos, aminoacil-tRNA y enlaces peptídicos. En las plantas, la adición de un aminoácido a un costos de la cadena de péptido de 4,5 ....

Protocolo

1. Preparación de 20 a 50% (p / v) de sacarosa gradientes

Nota: Los gradientes son de 4 capas de sacarosa (50%, 35% y el 2 capas de 20%) en un tubo de ultracentrífuga 13.2 ml. En nuestra experiencia, el vertido de la sacarosa al 20% en dos capas separadas mejora en gran medida la calidad de las preparaciones polisomas.

1. Preparar las soluciones madre. Asegúrese de que todas las soluciones son de RNAsa y DNAsa.
   1. Preparar 10X Solución Salina: mM Tris-HCl pH 8,4 400, KCl 200 mM y MgCl 100 mM _2.
   2. Preparar la solución 2 M de sacarosa: Por 200 ml, se disuelven 137 g de sacarosa en 1X solución salina.

Resultados

En la literatura, los perfiles de polisomas a menudo se muestran a partir de la fracción ligera de la fracción pesada como resultado de la forma en que se recogen los gradientes, es decir, desde la parte superior a la parte inferior. Dado que en el protocolo descrito aquí los gradientes son recogidos desde el fondo hasta la parte superior, los perfiles mostrados comienzan con la fracción pesada (los polisomas) e ir a la fracción ligera (subunidades de ribosomas libres y ARN) (Fig.......

Discusión

El protocolo que presentamos aquí es un método fácil y económico para generar perfiles de polisomas y aislar ARNm asociados a polisomas, ribosomas individuales o libres de ribosomas. En la literatura se describe una amplia gama de diferentes métodos de fraccionamiento de polisomas. El método que hemos descrito aquí se ha optimizado para mantener solo los compuestos necesarios y se ha adaptado para material vegetal. En particular, redujimos la cantidad de detergente¹¹ y agregamos cloranfenicol al tampón para fi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de ultracentrífuga, pared fina, polialómero - 13,2 ml	Beckman Coulter	331372
Tubo de ultracentrífuga, pared fina, polialómero - 38,5 ml	Beckman Coulter	326823
Tubo capilar de vidrio	Drummond Scientific	1-000-1000
Ultracentrífuga	la serie		Beckman Coulter
Optima SW41	Beckman Coulter	331362
Rotor de ultracentrífuga SW32	Beckman Coulter	369650
Bomba peristáltica	Cualquier
tubo de cloruro de polivinilo Tygon R3607	Fisher Scientific	070534-22	Tubo de cloruro de polivinilo, 2,29 mm
Colector de fracciones Modelo 2110	Bio-Rad	731-8120
Cubeta UV	Hellma	170.700-QS	Cubeta de flujo continuo de cuarzo
Espectrofotómetro UV	Varian	Cary50	Leer cada 0,0125 seg
Todos los productos químicos	Solo cualquier		uso Grado de biología molecular Mezcla
sales basales de Murashige y Skoog (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Agua libre de ARNasa	Cualquier
placa de Petri	Fisher Scientific	10083251
Octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol, ramificado (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Acrilamida lineal (portador de acrílico)	ThermoFischer scientific	AM9520	portador de precipitación de ARN
OriginPro 8	OriginLab		Software de análisis