Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

Resumen

Las lesiones renales efectuados desde nefrotóxicos, que incluyen medicamentos que van desde antibióticos a los agentes quimioterapéuticos, pueden dar lugar a trastornos complejos cuya patogénesis se conoce por completo. Este protocolo se muestra cómo el pez cebra se puede utilizar para el modelado de la enfermedad de estas condiciones, que se pueden aplicar a la identificación de medidas renoprotective.

Resumen

Los riñones son susceptibles al daño causado por la exposición a los productos químicos que se filtran desde el torrente sanguíneo. Esto puede conducir a una lesión de órganos asociada con una rápida disminución de la función y el desarrollo del síndrome clínico conocido como lesión renal aguda (IRA) renal. Los agentes farmacológicos utilizados para tratar las circunstancias médicas que van desde la infección bacteriana con el cáncer, cuando se administra individualmente o en combinación con otros fármacos, pueden iniciar AKI. El pez cebra son un modelo animal útil para estudiar los efectos químicos sobre la función renal in vivo, ya que forman un riñón embrionario compuesta de unidades funcionales de nefrones que se conservan con los vertebrados superiores, incluidos los humanos. Además, el pez cebra puede utilizarse para realizar cribados genéticos y químicos, que proporcionan oportunidades para dilucidar los aspectos celulares y moleculares de AKI y desarrollar estrategias terapéuticas tales como la identificación de moléculas nefroprotectores. Aquí, demostramos como la microinyección en elembrión de pez cebra puede ser utilizado como un paradigma para estudios nefrotoxina.

Introducción

AKI es una pérdida abrupta de la función renal que puede conducir a consecuencias devastadoras para la salud ^1. AKI es un problema importante de la salud en todo el mundo debido a su alta incidencia de aproximadamente el 20% de los pacientes hospitalizados, con tasas aún mayores de 30-50% en los casos de cuidados críticos y los ancianos, y las tasas de mortalidad de 50-70% ^1-3. Desafortunadamente, la prevalencia de la LRA ha ido en aumento y se prevé que agravar más durante la próxima década, debido en parte a la diversidad de factores que pueden inducir lesión renal aguda, que incluyen el estrés post-operatorio, la isquemia, y la exposición a nefrotoxinas tales como antibióticos y fármacos quimioterapéuticos ^4.

AKI implica daño celular súbita en el riñón, que se producen comúnmente en las nefronas, que son las unidades funcionales esenciales, y se componen de un filtro de sangre y un túbulo segmentado que drena la orina en los conductos colectores centrales ^1. Cuando un número significativo de nefronas sondañado durante AKI, los efectos inmediatos incluyen una interrupción en el aclaramiento de residuos de la circulación, y el flujo de fluido reducida o abrogada través de nefronas debido a la obstrucción de las células muertas y moribundas ^1. Con el tiempo, la obstrucción tubular puede conducir a la degeneración de las nefronas enteras, lo que reduce de forma permanente de la función renal ^1. Alteraciones fisiológicas en el riñón siguientes AKI también implican complejos eventos inflamatorios que pueden conducir a la cicatrización crónica ^1.

A pesar de estos resultados, las nefronas tienen cierta capacidad para someterse a la regeneración después de la IRA que reconstituye el ^5,6 epitelio tubular. Si bien ha habido una comprensión cada vez mayor de la regeneración molecular nefrona, los mecanismos sigue siendo difícil en muchos aspectos y fuese necesario prolongar la investigación ^7. El grado en que los resultados de AKI en el daño renal permanente También se desconoce. La investigación actual sugiere el potencial regenerativo para el riñón es elmás alta después de los casos menos graves de AKI, mientras que los episodios más pronunciados o repetidas conducen a la enfermedad renal crónica (ERC) y culminar en la enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) que requiere el trasplante o diálisis ^8,9 para salvar vidas. Además, las personas que ya sufren de enfermedad renal crónica corren un riesgo aún mayor de contraer un episodio grave de lesión renal aguda ^8,9. Tomados en conjunto, está claro que continuó la investigación básica y clínica es vital para entender, tratar y prevenir la IRA.

La investigación con modelos animales ha sido fundamental en la apreciación de la progresión de las alteraciones locales y ambientales que se producen durante AKI ^10. Para ampliar esta comprensión, así como desarrollar nuevas terapias, el modelo animal de pez cebra se ha empleado en una variedad de maneras ^11,12. Las nefronas del riñón pez cebra, tanto en el embrión y de adultos, muestran un alto grado de conservación con mamíferos ^13-16. Además, la lesión epitelial nefrona en zebrafish se asemeja al proceso en los vertebrados superiores, por lo que la destrucción local de células tubulares es seguida por la proliferación intratubular y el restablecimiento de la arquitectura de nefronas ^17-19. En el embrión, sin embargo, grandes daños túbulo de las nefrotoxinas tales como cisplatino está asociada con letalidad ^20,21. En comparación, el pez cebra adultos sobreviven AKI y exhiben capacidades regenerativas de fondo en el riñón. Por ejemplo, tras la exposición a la gentamicina antibiótico aminoglucósido, pez cebra regenerar daño epitelial túbulo y crecer nuevas unidades de nefrones, así ^22-24. Si bien estos estudios AKI gentamicina inducida han proporcionado valiosa información, la comprensión de daño renal de diversas nefrotoxinas sigue siendo fundamental para apreciar los efectos y la respuesta a los diferentes tipos de daños ^25.

El embrión de pez cebra, debido a su tamaño, la transparencia y la trazabilidad genética, tiene muchos beneficios para los estudios nefrotoxina ^{25, donde se utiliza el método de microinyección 20,21 para administrar la molécula (s) para su investigación. Nefronas están formados por 24 h después de la fecundación (HPF) y empiezan a filtrar la sangre en aproximadamente un 48 HPF 26,27. Por lo tanto, la rápida formación y la función del riñón embrionario facilita el análisis experimental. Sin embargo, el proceso de microinyección tiene desafíos técnicos y no puede haber una curva de aprendizaje para el dominio de la técnica. En este artículo de vídeo, se describe cómo realizar microinyecciones y proporcionar sugerencias para solucionar problemas con el fin de mejorar la tasa de éxito de las inyecciones.}

Protocolo

Los procedimientos para trabajar con embriones de pez cebra que se describen en este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Notre Dame.

1. Preparación de soluciones

1. Hacer una solución 50x social de los medios de embriones E3 mezclando 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g _{de CaCl2,} y 9,95 g _MgSO4 en 5 litros de agua destilada, y se almacena a temperatura ambiente.
2. Para el cultivo de los embriones de pez cebra, se diluye la solución de 50x social de E3 del medio de impresión de embrión a una solución de trabajo 1x con agua destilada, a continuación, añadir 200 l de 0,05% de azul de metileno para cada 1 l de 1x E3 para actuar como un fungicida, y almacenar a RT.
3. Hacer una solución de bloqueo de los medios de pigmentación embrión E3 con 0,003% de 1-fenil-2-tiourea (PTU) mediante la combinación de 40 ml de la Bolsa de 50x E3 con 0,06 mg PTU. A continuación, llevar el volumen a un total de 2 L con agua destilada.
4. Se agita la O E3 / PTU / N a temperatura ambiente para obtener el polvo de PTU en la solución. A continuación, almacenar el E3 / PTU por elRT.
   Nota: El E3 / PTU tiene una vida útil de aproximadamente una semana, y las soluciones mayores serán menos eficaces en el bloqueo de desarrollo pigmentación en larvas de pez cebra.
5. Hacer una solución anestésica de 0,2% tricaína (MS-222) mediante la adición de 1 g de tricaína a 500 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,2 con 1 M Tris, pH 9,5.
6. Prepárese para hacer una solución de metilcelulosa al 2% para formación de imágenes mediante la colocación de una solución de 1x E3 (sin azul de metileno), con ^1/10 volumen de 0,2% tricaína añadió a 4 ° C.
   Nota: La solución de metilcelulosa es una solución espesa, clara que se utiliza para estabilizar suavemente embriones vivos para la microscopía. Después se llevan a cabo las manipulaciones de los embriones se pueden lavar en 1x E3 para disolver la metilcelulosa sin herir el animal y permitiendo microscopía en las etapas posteriores en la misma muestra.
7. Cuando se enfría a 4 ° C, se agita la solución 1x E3 / Tricaína vigorosamente en una placa de agitación y añadir poco a poco la cantidad apropiada de metilopolvo de celulosa mientras se continúa agitando vigorosamente. Añadir poco a poco el polvo a la solución para prevenir la formación de agregados insolubles de metilcelulosa.
8. Después de que todo el polvo se mezcla en la solución de metilcelulosa / E3 / tricaína 2%, se agita la solución de compuesto en el 4 ° C habitación fría O / N.
   Nota: La temperatura fría es mejor para disolver completamente el polvo. Si la solución no es clara después de una noche, se agita durante una jornada adicional y / o un segundo O / N.
9. Para eliminar las burbujas de aire de la metilcelulosa 2% / solución / tricaína E3, alícuota de la mezcla en tubos de 1,5 ml y giro a alta velocidad (12.000 xg) a 4 ° C durante 30 minutos o hasta 2 horas.
10. Coloque la solución / E3 / tricaína metilcelulosa al 2% a 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
    Nota: Antes de su uso, las alícuotas deben ser pre-calentado a la temperatura ambiente para trabajar con los especímenes de pez cebra.

2. Preparación de Herramientas

1. Preparar una herramienta de embriones manipulador, que se utiliza para posicionar embriones para la microinyección, uniendo una punta de carga de gel en la punta de una aguja de disección recta 5 ", y asegurar con cinta adhesiva o pegamento.
2. Preparar las agujas de microinyección usando un extractor de aguja, colocando primero un incendio pulido de 10 cm de vidrio de borosilicato con filamento en el instrumento y asegurar el vidrio de borosilicato apretando las asas.
3. Levante el vidrio de borosilicato a la moda agujas finas-cónicos. Utilice los siguientes parámetros: calor 540, tire 245, velocidad 200, 125 y la hora.
4. Pone las agujas dentro de una cápsula de Petri, suspenderlas en una tira de pasta de modelar para proteger las puntas de aguja, y mantener el plato cubierto para evitar la acumulación de polvo.
5. Para terminar la preparación de la aguja para microinyecciones, utilizar un borde de la cuchilla de afeitar o unas pinzas finas para cortar el extremo tirado de la aguja para crear una punta de inyección angular aguda con un diámetro de aproximadamente 0,05 a 0,1 mm.
6. Para hacer que la bandeja de microinyección, preparar una solución / E3 1,5% de agarosa en un 100 ml matraz de Erlenmeyer y disolver la agarosa por calentamiento de la E3 a ebullición en un horno de microondas, dejar enfriar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 min.
7. Verter la solución de agarosa / E3 enfriado en un plato de Petri para hacer una base con una profundidad de aproximadamente 0,5 cm. Cuando esto se ha solidificado verter una segunda capa con una profundidad de aproximadamente 0,3 cm y insertar el molde así embrión prefabricado y permitir que la agarosa solidifique a temperatura ambiente.
   Nota: Al insertar el molde dentro de la capa / E3 agar superior, colocando el molde en el agar en un ángulo para disminuir el número de burbujas de aire.
8. Cuando toda la bandeja de microinyección se ha puesto, levantar el embrión prefabricada así moldear a cabo lentamente y con cuidado utilizando un scoopula, a continuación, llenar el recipiente con solución E3 y se almacena a 4 ° C.

3. Preparación de embriones

1. Configurar tanques de apareamiento de pez cebra mediante la colocación de separadores en las cámaras de apareamiento y se llenan de agua del sistema.
2. Colocar un pez en cada lado del divisor sran que cada cámara de acoplamiento contiene una hembra y un macho de pescado y cubrimos cada cámara de apareamiento.
3. A la mañana siguiente, quitar los separadores para permitir el desove.
4. Compruebe el pescado después de aproximadamente 30 minutos, y después de la devolución de los adultos al acuario, recoger sus embriones haciendo pasar el agua del tanque de apareamiento a través de una herramienta colador de alambre de malla fina.
5. Invertir el colador sobre una placa de Petri y enjuague con E3 para recoger los embriones.
6. Incubar los embriones a 28,5 ° CO / N.
7. Cuando los embriones han alcanzado la fase de 24 a 26 somite ^26, se decanta la mayoría de los medios de comunicación E3 y luego dechorionate mediante la adición de 100 l de 50 mg / ml de pronasa a cada placa de embriones e incubando la placa a temperatura ambiente (23 ° C) durante aproximadamente 15 min.
   Nota: Se tarda aproximadamente 24-25 horas desde el momento de la fecundación de los embriones para llegar a la etapa 24-26 somite si se recogen en la forma descrita y se incubaron O / N a 28,5 ° C.
8. Llenar el recipiente conE3 y luego girar suavemente para desalojar a los chorions de los embriones.
9. Decantar el E3 / pronasa y enjuagar el recipiente con 25 ml de E3 fresco. Repita el paso de enjuague para eliminar toda la pronasa.
10. Para bloquear el desarrollo de la pigmentación, se decanta el E3 y reemplazar con 25 ml de frescas E3 / PTU cuando los embriones han llegado a las 24 horas después de la fecundación.
    Nota: Para los experimentos que abarca varios días, en lugar de la solución E3 / PTU por medio nuevo una vez al día para mantener el plato limpio.

4. La microinyección de solución nefrotoxina

1. En el día de la inyección, preparar la solución nefrotoxina deseado junto con el vehículo de control apropiado.
2. Vortex o mezclar suavemente para asegurar el fármaco (s) es / son en solución, la comprobación de los lados del tubo y la parte superior de la columna de agua.
   Nota: Las soluciones nefrotoxina puedan estar preparados para contener trazas de dextrano conjugado con fluorescencia para monitorizar la eficacia de microinyección y también evaluar la depuración renal en subseqtiempo uente apunta ^20,28.
3. Cargar una aguja de microinyección adornado con 2-3 ~ l de la nefrotoxina enroscando una punta de carga de gel fino en la parte posterior de la aguja y la suspensión de la aguja en posición vertical con un trozo de cinta para permitir que la solución para llenar la punta de la aguja recortado por la gravedad.
4. Una vez que la punta de la aguja está lleno, asegurar la aguja cargada en el micromanipulador.
5. Probar el volumen microinyección mediante la colocación de una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos de micrómetro e inyectar en el aceite para evaluar el tamaño de gota. Un volumen de inyección de 500 pl tiene un diámetro de 0,1 mm.
6. Retire el plato de embriones a partir de la incubadora, y anestesiar mediante la adición de aproximadamente 5 ml de 0,2% tricaína al plato embrión.
7. Para asegurar la anestesia completa, toque suavemente embrión con la punta de la herramienta de embriones manipulador. La falta de movimiento indica suficiente anestesia.
8. Después de la anestesia con éxito, la transferencia de los embriones al molde de inyección con una transfpipeta er.
9. Maniobra de cada embrión en un pozo diferente del molde colocando la cabeza en la zona más profunda del pozo de tal manera que el tronco se apoya a lo largo de la depresión y la cola se pega a salir de la depresión.
10. Insertar la aguja se introduce en el micromanipulador y la posición de la punta de la aguja junto a un embrión.
11. Suavemente inserte la aguja en el recipiente de la cola moviendo el joystick hacia adelante y presione el pedal de pie para entregar la microinyección.
    Nota: El éxito de la inyección se puede medir observando el líquido entrar en circulación. Además, co-inyección de la nephrotoxicant con dextrano conjugado con fluorescencia permite al investigador para verificar la inyección con éxito después del procedimiento.
12. Tire suavemente hacia atrás en el joystick para extraer la aguja del embrión.
13. Después de la inyección, la transferencia de los embriones a un plato limpio y enjuague para eliminar el Tricaína y reemplazar con fresco E3 / PTU.
14. Incubar el embrión hasta el punto de tiempo deseado para evaluars morfología, que puede ser documentada por la fotografía en los medios de montaje metilcelulosa, o un proceso para el análisis experimental como se desee.
    Nota: Recuperación de embriones debe ser evaluado para determinar el porcentaje de individuos con edema, que comúnmente se indica lesión renal.

Resultados

Una estación de microinyección configurar incluye un estereomicroscopio, micromanipulador y regulador de presión (Figura 1A). La transiluminación de la placa de inyección es preferible para ver las muestras durante este procedimiento (Figura 1B). Preparación de la aguja de inyección consiste en tirar el vidrio de borosilicato apropiado, seguido de la preparación del borde con el corte y finalmente de vuelta a cargar la aguja. De manera óptima, la punta d...

Discusión

Un número diverso de agentes terapéuticos se han asociado con AKI ^29. Ha habido avances en la investigación significativo en la comprensión el daño inducido por muchos compuestos individuales, tales como la gentamicina aminoglucósido ³⁰ y el cisplatino quimioterapéutico ampliamente utilizado ^31,32. Algunos cambios patológicos implicados en estas condiciones, sin embargo, siguen siendo objeto de estudio en curso. Uno de los retos emergentes sigue siendo la comprensión de cómo múltiples fá...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro de sodio	AB01915 Cloruro
potasio	AB01652		bioanalítico americano
Cloruro de calcio	AB00366		bioanalítico americano
N-feniltiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
3-aminobenzoato de etilo (tricaína)	Fluka Analytical	A5040
Vidrio de borosilicato	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Tirador de micropipetas Flaming/Brown	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Sulfato de magnesio	Sigma-Aldrich	M7506
Azul de metileno	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Placas de Petri Diposables, Estériles, Corning:
60 mm x 15 mm	VWR	25373-085
100 mm x 15 mm	VWR	25373-100
( bandeja de microinyección) 150 mm x 15 mm	VWR	25373-187
Incubadora de baja temperatura	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Pinza de microdisección	Roboz Surgical Instruments Co.	Micrómetro RS-5010
	Ted Pella, Inc.	2280-24

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