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Artículo de método

Caracterización funcional de macrófagos reguladores que inhiben la inmunidad reactiva al injerto

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DOI:

10.3791/54242

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7 de junio de 2017

 , 
1Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Immunología de Trasplantes, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III

En este artículo

Resumen

Los macrófagos son células plásticas del sistema hematopoyético que tienen un papel crucial en la inmunidad protectora y la homeostasis. En este informe se describen las técnicas in vitro optimizadas para caracterizar fenotípicamente y funcionalmente los macrófagos reguladores infiltrantes del injerto que se acumulan en el órgano trasplantado bajo condiciones tolerógenas.

Resumen

La acumulación de macrófagos en los órganos trasplantados se ha reconocido desde hace tiempo como una característica del rechazo del aloinjerto 1 . Los monocitos inmunogénicos se infiltran en el aloinjerto precoz después del trasplante, montan una respuesta reactiva al injerto contra el órgano trasplantado e inician el rechazo del órgano 2 . Datos recientes sugieren que los macrófagos supresores facilitar el éxito a largo plazo transplante [ 3] y son necesarios para la inducción de la tolerancia al trasplante [ 4] . Esto sugiere un concepto multidimensional de la ontogenia, activación y función de los macrófagos, lo que exige una nueva hoja de ruta para el aislamiento y el análisis de la función de los macrófagos [ 5] . Debido a la plasticidad de los macrófagos, es necesario proporcionar una metodología para aislar y caracterizar los macrófagos, dependiendo del entorno tisular, y definir sus funciones de acuerdo con diferentes escenarios. Aquí, describimosSer un protocolo para la caracterización inmune de macrófagos infiltrados por injerto y los métodos que utilizamos para evaluar funcionalmente su capacidad para inhibir la proliferación de T CD8 + y para promover la expansión de Treg CD4 + Foxp3 + in vitro .

Introducción

Este protocolo describe técnicas in vitro para estudiar la función de los tejidos infiltrados macrófagos aislados de aloinjertos cardíacos, de acuerdo a su capacidad para modular las respuestas de células T. Ampliamente descritos en la literatura, los colorantes de seguimiento de células fluorescentes en combinación con citometría de flujo, son potentes herramientas para estudiar la función supresora de tipos específicos de células in vitro e in vivo. Nuestro protocolo sigue el método del éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) para monitorear la proliferación de linfocitos in vitro .

Cuando una célula marcada con CFSE se divide, su progenie adquiere la mitad del número de moléculas marcadas con carboxifluoresceína [ 6] . La disminución correspondiente en la fluorescencia celular por citometría de flujo puede usarse para evaluar la división celular, monitoreando la capacidad de los macrófagos supresores para modular las respuestas inmunes de las células T. Dado que CFSE es un colorante basado en fluoresceína, es compatible con una brGama de otros fluorocromos, haciéndolo aplicable a la citometría de flujo multicolor. La elección apropiada de fluorocromos para el fenotipado es también importante para evitar la superposición espectral excesiva y la incapacidad para reconocer células positivas para anticuerpos, particularmente con colorantes proteínicos visibles tales como CFSE 7 .

Existen muchas ventajas de usar tintes fluorescentes sobre técnicas alternativas que miden la proliferación celular, tal como el ensayo de incorporación de timidina, que usa timidina radiomarcada (TdR) 8 . Este ensayo utiliza timidina tritiada (3H-TdR) que se incorpora en nuevas cadenas de ADN cromosómico durante la división celular mitótica. Un problema de seguridad asociado con este ensayo es el uso de radioisótopos, puesto que se utiliza un contador beta de centelleo para medir la radiactividad en el ADN recuperado de las células con el fin de determinar el grado de división celular. Metodológicamente, el culo de timidina tritiadaAy no es lo suficientemente flexible como para adaptarse a importantes limitaciones de laboratorio clínico, como un bajo número de células y un análisis tardío después de la tinción. Por el contrario, coloración CFSE se ha demostrado para prevenir la proliferación celular y para interferir con los marcadores de activación crítica, como CD69, HLA-DR y CD25 [ 9] . Por lo tanto, la comprensión de las ventajas y limitaciones de cada metodología, en particular en estudios multicolores en los que se utilizan tintes múltiples para rastrear diferentes tipos de células, es fundamental para obtener resultados precisos y reproducibles.

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Protocolo

En este estudio, los ratones se alojan de acuerdo con las directrices del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y las recomendaciones de la Guía de Servicios de Salud Pública para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todas las técnicas experimentales que involucran el uso de animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Utilización de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina de Mount Sinai.

1. Preparación de los medios

  1. Preparar medio RPMI 1640 completo con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina al 1% (10.000 U / ml) usando L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 5 mM y 0,05 mM 2 Mercaptoetanol.

2. Aislamiento del aloinjerto y suspensión de una sola célula

NOTA: La técnica de trasplante y anastomosis de la arteria pulmonar y la vena cava inferior fue descrita inicialmente por Corry y colaboradores y puede ser visualizada en Liu & KangS = "xref"> 10 , 11 ( Figura 1A ).

  1. Anestesiar un ratón trasplantado con 4-5% de isoflurano en una cámara de inducción. Sacrifícalo por dislocación cervical.
  2. Haga una incisión abdominal de línea media con tijeras estándar y retire el contenido abdominal para localizar la aorta.
    NOTA: El corazón trasplantado estará en el lado derecho de la aorta abdominal receptora ( Figura 1B ).
  3. Extraiga el injerto suavemente con pinzas finas de dientes afilados y colóquelo inmediatamente en medio RPMI helado.
    NOTA: El uso de una tijeras de cirugía para separar el injerto de la aorta puede dañar el injerto y hacer que algunos tejidos sigan adheridos al receptor.
  4. Después de que todos los injertos han sido recolectados, muévalos en una campana de cultivo estéril para el procesamiento de tejidos. Colocar el injerto en una placa de Petri y cortar el tejido en trozos pequeños (1 mm) usando tijeras microcirúrgicas estériles y romas.
  5. Con dientes afilados forcEps, transferir las piezas a un tubo de 50 ml con 5 ml de colagenasa A (0,1 mg / ml de colagenasa en 1x PBS estéril). Incubar durante 1 h en un baño a 37 ° C.
  6. Añadir 5 ml de medio RPMI para neutralizar la colagenasa y transferir la muestra a través de un filtro de 100 μm con la ayuda del émbolo de una jeringa de 1 ml.
  7. Hacer girar la muestra a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
  8. Resuspender el gránulo en 1 mL de tampón de lisis ACK. Mezclar bien e incubar durante 5 min a 4 ° C.
  9. Añadir 1 ml de medio RPMI para neutralizar el tampón de lisis y centrifugar la muestra a 400 xg durante 5 m a 4 ° C.
  10. Resuspender el sedimento celular en 200 μL de medio RPMI y transferirlo a un tubo redondo de polipropileno de 5 ml.
    NOTA: Los tubos de polipropileno soportan menos adherencia. Además, mantener las células a baja temperatura, tales como 4ºC, reduce la adherencia.

3. Aislamiento de los macrófagos infiltrados por injerto utilizando la clasificación de células activada por fluorescenciaEn g

  1. Bloquear la unión específica no deseada sobre las células mieloides mediante el uso de mAb bloqueador del receptor Fc (CD16 / 32 de ratón anti-ratón). Añadir 1-2 μL por muestra, 15 min antes de la tinción superficial.
  2. La tinción con anticuerpo anti-ratón CD11b Percp / Cy5.5 (concentración final de 0,6 μg / μL en medio RPMI), APC / eFluor780 anti-CD45 de ratón (0,6 μg / μl), APC Ly6C anti-ratón (2 μg / μl) Y Ly6G Pe / Cy7 anti-ratón (2 μg / μl). Cubrir los tubos con papel de aluminio para proteger los anticuerpos fluorescentes de la luz e incubar los tubos en el refrigerador a 4 ° C durante 45 min.
    NOTA: Para las compensaciones de una sola mancha, prepare un tubo de control negativo (sin manchas) y tubos con células etiquetadas individualmente con cada uno de los fluorocromos. Para ayudar a establecer la puerta, los controles de isotipo se pueden utilizar especialmente para Ly6C (IgG2a) y Ly6G (IgG2b).
  3. Lavar las células dos veces con medio RPMI y centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuente las células usando azul de tripán y un hemocytometeR y diluir en 1 ml de medio RPMI por 1 x 10 6 células. Antes de ordenar, transfiera las muestras a través de una tapa de tubo de filtro de 5 ml, 70 μm. Añadir DAPI (1 μg / ml) como un marcador de viabilidad celular y proceder a la clasificación.
  4. Debido a que los macrófagos son células sensibles y frágiles, establezca las condiciones de clasificación a 20 psi y utilice un tamaño de boquilla de 100 μm para aislar los macrófagos usando un modo de pureza de 4 vías.
  5. Preparar los tubos de recogida con 1 ml de medio RPMI en un tubo de polipropileno de 5 ml.
  6. Utilizando el software de clasificación, abra el nuevo experimento y seleccione el experimento en blanco con un panel en blanco para definir la configuración.
  7. Establezca una gráfica de puntos que muestre la dispersión frontal (FSC) versus ( vs ) (SSC) y la puerta en todos los leucocitos, excluyendo escombros y agregados con la menor dispersión hacia adelante y hacia el lado. Desde esta puerta principal, cree un nuevo gráfico de puntos que muestre SSC vs. DAPI y gate en celdas DAPI.
    1. En esta población recién cerrada, crear anunciosDe la parcela que muestra CD11b frente a CD45 y puerta sobre los macrófagos y neutrófilos doblemente positivos (CD11b + CD45 + ).
    2. A partir de aquí, crear una trama de puntos final que muestra Ly6C vs Ly6G y puerta de las poblaciones deseables: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - , y Ly6C int Ly6G + ( Figura 2 ].
  8. Después de la clasificación, comprobar la pureza y la viabilidad celular (> 90%) y girar los tubos de recogida a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Contar las células usando azul de tripán y un hemocitómetro y resuspenderlas a la concentración deseada ( por ejemplo, 1 x 10 6 macrófagos / ml) en medio RPMI completo.
  9. Placa de 50 x 10 3 macrófagos por pocillo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos con un volumen final de 100 μl de medio RPMI completo. Dejar las células inalteradas durante al menos 24 h a 37 ° C y 5% de CO 2 .

4. AislamientoN de Células T que Usan Clasificación de Células activadas por Fluorescencia

NOTA: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn es una cepa de ratón knock-in dirigida a X que marca las células que expresan el gen Foxp3 (forkhead box P3) con proteína fluorescente roja monomérica (mRFP).

  1. Anestesiar y sacrificar ratones C57BL / 6 y C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) como se describió previamente en el paso 2.1. Aislar el bazo y los ganglios linfáticos (LN: inguinal, lumbar, axilar, braquial y cervical) y colocarlos rápidamente en medio RPMI helado.
  2. Con el fin de aislar el LN, colocar el ratón en una posición supina, hacer una incisión de la línea media de la parte inferior a la parte superior, cortando con cuidado el peritoneo y separar suavemente la piel aparte. Una vez que se recogen todas las LN inguinales, lumbares, axilares, braquiales y cervicales ( Figura 1C , coloreadas en rojo), se corta el peritoneo y se aísla el bazo en el lado superior izquierdo del intestino.
  3. Desagregar el bazo y LN utilizando un filtro de 100 μm colocadoEncima de un tubo de 50 ml. Utilizando el émbolo de una jeringa de 1 ml, presione suavemente el tejido. Enjuague el filtro con el medio RPMI tantas veces como sea necesario hasta que esté limpio.
    NOTA: El LN y el bazo de cada ratón se pueden agrupar juntos en el mismo tubo.
  4. Girar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
  5. Resuspender el sedimento en 2 ml de tampón de lisis ACK. Mezclar bien e incubar durante 5 min a 4 ° C.
  6. Añadir 2 ml de medio RPMI para neutralizar el tampón de lisis. Girar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
  7. Resuspender el sedimento celular en 200 μl de medio RPMI y transferirlo a un tubo redondo de 5 ml de poliestireno.
  8. Mancha para APC CD4 anti-ratón (0,6 μg / μl) y / o CDC PeCy7 anti-ratón (2 μg / μl). Cubrir los tubos con papel de aluminio para proteger los anticuerpos fluorescentes de la luz, e incubar los tubos en el refrigerador a 4 ° C durante 45 min.
    NOTA: Para compensaciones de una sola mancha, prepare un tubo de control negativo (sin manchas) yTubos con células marcadas individualmente con cada uno de los fluorocromos.
  9. Lavar las células dos veces con medio RPMI y centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuente las células usando azul de tripán y un hemocitómetro.
    NOTA: El colorante CFSE se proporciona en forma de polvo de éster de succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína normalmente en 50 μg. Añadir 18 μL de DMSO a un vial de CFSE para una solución madre final de 5 mM y almacenar a -20 ° C durante varios meses.
  10. Para el etiquetado CFSE, resuspender CD8 células teñidas a una concentración de hasta 10 6 células por ml en PBS a una concentración final de trabajo de 5 μ M CFSE de la solución madre. Incubarlos en un baño a 20 ° C durante 5 min como se ha descrito anteriormente 6 .
    NOTA: (PASO CRÍTICO) Para las células a una concentración baja (≤ 10 6 por ml), es esencial que las células se etiqueten en presencia de proteína añadida para amortiguar los efectos tóxicos de CFSE. Por lo tanto, el PBS puede contener 5% de FBS. Tenga en cuenta que si meDium, los aminoácidos libres pueden disminuir la eficiencia de etiquetado compitiendo por CFSE.
  11. Neutralizar la CFSE con 2 ml de medio RPMI. Girar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Añadir 1 ml de medio RPMI por 1 x 106 células T CD8.
  12. Antes de clasificar, transfiera la muestra a través de un filtro de células de 70 μm en un tapón de tubo de 5 ml. Añadir 50 μl de 1x DAPI (1 μg / ml) como marcador de viabilidad celular y proceder a la clasificación.
    NOTA: 1x significa relación 1: 1 del reactivo con respecto a los demás constituyentes.
  13. Ajustar las condiciones de clasificación a 20 psi y 100 μ m tamaño de la boquilla para aislar doble positivo CD8 + CFSE + T células ( Figura 3A ].
  14. Prepare los tubos de recogida con 1 ml de medio RPMI en un tubo de polipropileno de 5 ml y proceda a ordenar.
  15. Utilizando el software de clasificación, abra el nuevo experimento y seleccione el experimento en blanco con un panel en blanco para definir la configuración.
  16. Para el aislamiento de células T CD4 + , configure un diagrama de puntos queJuega el FSC vs SSC y la puerta de los linfocitos, excluyendo los residuos, así como grandes células granulares, como las células dendríticas.
    1. Desde esta puerta principal, cree un nuevo gráfico de puntos que muestre SSC vs. DAPI y gate en celdas DAPI.
    2. En esta población recién cerrada, crear un gráfico de puntos que muestra SSC vs CD4 para aislar todas las células CD4 + ( Figura 3B ]. Alternativamente, se puede usar un mAb anti-CD3 para asegurar el aislamiento de poblaciones de células T puras.
      NOTA: Una pequeña fracción de todas las células T CD4 + (5-10%) debe ser Foxp3 + mRFP + .
  17. Después de la clasificación, comprobar la pureza y la viabilidad celular (> 90%) y girar los tubos de recogida a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuente las células usando azul de tripán y un hemocitómetro. Resuspender utilizando 1 ml de medio RPMI completo por 2 x 10 6 células T.
  18. Establecer el ensayo de supresión mediante el cultivo de células T con macrófagos previamente ordenados. Placa 10 x 10 4 CD4 + T y 10 x 10 ^ { 4 } CD8 ^ { +} CFSE + en el mismo pocillo en un volumen final de 100 mu l de medio RPMI completo. Incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 96 h.
    NOTA: Se usaron macrófagos y células T en una proporción de 1: 4.
  19. Estimular la división de células T lavando las perlas magnéticas CD3 / CD28 activadoras de células T en 2 ml de PBS antes de usarlas para eliminar el tampón que contiene azida. Añadir 5 μl de perlas de CD3 / CD28 activador de células T de ratón por pocillo.
    NOTA: Las perlas magnéticas son de tamaño similar a las células presentadoras de antígeno y están acopladas a mAb anti-CD3 y anti-CD28, ofreciendo un método sencillo para la activación y expansión de células T.

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Resultados

Los resultados representativos muestran la estrategia de bloqueo descrita en el protocolo anterior. Los resultados también muestran el análisis de la actividad de proliferación de células T después del co-cultivo con macrófagos infiltrados por injerto. La capacidad de supresión in vitro de subconjuntos de macrófagos se analizó en la Figura 4 . Los resultados indican que los Ly6C lo Ly6G - macrófagos obtenidos de receptores tolerados son sup...

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Discusión

Este protocolo describe los métodos que utilizamos para inmunocaracterizar los subgrupos de células mieloides infiltrantes al injerto en un modelo murino experimental de trasplante cardíaco, que también es aplicable a otros tejidos en diferentes modelos experimentales murinos. Clasificación de células de baja presión a 20 psi fue el método preferido para aislar un buen rendimiento de los subconjuntos de células puras. Mantener la pureza de cada subconjunto mieloide es crítico para establecer resultados concluyentes de l...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Reconocemos las contribuciones técnicas de los Centros de Investigación de Citometría de Flujo, Microcirugía y Bio-repositorio / Patología de la Excelencia en Investigación en el Monte Sinaí. Este trabajo fue apoyado por la Acción COST BM1305: Acción para Enfocar y Acelerar las Terapias Tolerogénicas Celulares (A FACTT), los fondos de desarrollo del Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute, Ministerio de Ciencia e Innovación SAF2013-48834-R y SAF2016-80031-R Jo

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
10% FBSLife Technologies26140-079
1,000x 2-mercaptoetanolLife Technologies21985023
100x Pluma/EstreptococoLife Technologies15140122
100x L-glutaminaLife Technologies25030081
100x No Aminoácidos esencialesCorning25025039
1 M tampón HEPES Corning25060CL
100 mM Piruvato de sodioThermoScientificSH30239.01
Penicilina/EstreptavidinaThermoScientific15140122
colágeno ARoche70381322
DPBS (sin calcio& magnesio)Corning21031CV
70 y micro; m Filtro de célulasFisher22363548
tampón de lisis ACKLife TechnologiesA10492-01
DAPISigma32670-5mg-F
CFSE-FITCInvitrogenC34554
Dynabeads Ratón Activador de células T CD3/CD28Life Technologies11452D
96 pozo  Placa inferior en UCorning353077
Anticuerpos anti-Ly6C-APC
eBioscience175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7Biolegend127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5eBioscience45011282
anti-CD45-APC/Cy7eBioscience47045182
anti-CD4-APCeBioscience17004181
anti-CD8-P/ Cy7eBioscience25008181
LSRII Citómetro de flujoBD Bioscience
FACSDiva SoftwareBD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J El Laboratorio Jackson008374
C57BL/6El Laboratorio Jackson000664
Balb/cEl Laboratorio Jackson000651

Referencias

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