Artículo de método

Seguimiento de preparación y 3D de dispositivos catalíticos de natación

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DOI:

10.3791/54247

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1 de julio de 2016

 ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, University of Sheffield

En este artículo

Resumen

Se presenta un método para preparar coloides de Janus catalíticamente activos que pueden "nadar" en fluidos y determinar sus trayectorias 3D.

Resumen

Informamos de un método para preparar coloides de Janus catalíticamente activos que "nadan" en fluidos y describimos cómo determinar su movimiento 3D utilizando microscopía de fluorescencia. Un método comúnmente implementado para que los coloides catalíticamente activos produzcan un movimiento mejorado es a través de una distribución asimétrica del catalizador. En este caso, esto se logra mediante el recubrimiento por rotación de una capa dispersa de coloides poliméricos fluorescentes sobre un sustrato plano y plano, y luego utilizando la deposición direccional de vapor de platino para recubrir a la mitad la superficie coloidal expuesta, creando una estructura "Janus" de dos caras. A continuación, los coloides de Janus se vuelven a suspender del sustrato plano en una solución acuosa que contiene peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno sirve como combustible para el catalizador de platino, que se descompone en agua y oxígeno, pero solo en un lado del coloide. La asimetría da como resultado gradientes que producen un movimiento mejorado, o "natación". Se utiliza un microscopio de fluorescencia, junto con una cámara de vídeo, para registrar el movimiento de los coloides individuales. El centro de la emisión fluorescente se encuentra utilizando el análisis de imágenes para proporcionar una coordenada x e y para cada fotograma del vídeo. Mientras se mantiene fija la posición focal del microscopio, la emisión de fluorescencia del coloide produce un patrón de anillo concéntrico característico que se somete a análisis de imagen para determinar la posición z relativa de las partículas. De esta manera, se obtienen trayectorias 3D para el coloide de natación, lo que permite medir con precisión la velocidad de natación y detectar fenómenos físicos como la gravitaxis, que pueden sesgar el movimiento de los coloides.

Introducción

Dispositivos de natación catalíticos son de pequeña escala, los coloides sin ataduras capaces de generar de forma autónoma el movimiento en entornos fluidos. 1,2 Estos dispositivos están atrayendo interés significativo la investigación, ya que tienen el potencial de permitir nuevas e interesantes funciones tales como la administración de fármacos, 3 laboratorio en un chip de transporte 4 y remediación ambiental. 5 un ejemplo ampliamente estudiados son catalíticos nadadores "Janus". 6 Estas partículas deben su nombre a que tiene dos lados distintos, o caras (Janus es un doble rostro dios romano). Un lado es catalíticamente activo y capaz de realizar una reacción de descomposición, mientras que la otra es inerte. En presencia de moléculas de combustible disueltos adecuados, la reacción química asimétrica resultante crea gradientes alrededor de los coloides que puede producir un movimiento a través de la auto-diffusiophoresis / electroforesis. 7

Caracterizar el movimiento de estos objetos en rápido movimiento es cha llenging y muchas observaciones experimentales hasta la fecha se han limitado a 2D. Sin embargo, las aplicaciones posibles son propensos a explotar la capacidad catalítica dispositivos de natación para moverse a través de soluciones a granel en 3D. 8 Para hacer frente a esto, aquí se describe un protocolo que permite trayectorias 3D precisas para dispositivos de natación que se determinen. Este método se basa en la interpretación de las estructuras de anillo producidos por fuera de los coloides de Foco Fluorescente observados con un objetivo de foco fijo, 9 y es fácil de aplicar usando microscopios no modificadas convencionales. Al describir claramente este método aquí, otros investigadores en este campo se beneficiarán al ser capaces de acceder a dicha información 3D. Esto ayudará a los futuros puntos de vista en las características del movimiento de los dispositivos de natación. Evidencia de este potencial está dada por el reciente informe de los dispositivos de natación siendo dirigido por gravedad, 10,11 comportamiento que pueden ser más fácilmente visualizada a través de la aplicación de seguimiento 3D. 11

ove_content "> Este documento también documenta claramente un método para la fabricación de dispositivos de natación de partículas catalíticas Janus, que serán de mayor beneficio para estandarizar los métodos a través de los grupos de investigación existentes que investigan estos dispositivos, y, además, guiar a los nuevos investigadores interesados ​​en la fabricación e investigación de dispositivos de natación.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes antes de su uso. El peróxido de hidrógeno se usa en este protocolo es perjudicial, y la evolución de gas de oxígeno cuando se expone al platino plantea un riesgo de explosión. Use todos los controles de seguridad adecuados durante este protocolo, incluidos los controles de ingeniería durante la manipulación de soluciones de peróxido (campana de humos) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio).

1. Hacer catalítica Janus Partículas

  1. Prepare el substrato de lámina de vidrio
    1. Limpiar un portaobjetos de microscopio estándar no utilizado en el lavado secuencial durante unos minutos cada uno en agua desionizada (DI), solución de descontaminación vidrio y el agua DI. A continuación, lavar con un 70:30 v: v mezcla de etanol: agua DI, y finalmente secar en una corriente de aire / nitrógeno limpio.
    2. Examine el portaobjetos de vidrio bajo un microscopio para verificar que la superficie esté limpia y libre de evidencia de contaminación por partículas. Repita el paso 1.1.1 si es necesario.
  2. Preparar dispersión coloidal para la deposición
    1. Pipeta de 10 l de solución acuosa de coloides de Stock fluorescente (10% en peso.) En 990 l de etanol. Ajustar los volúmenes según sea necesario en función de la concentración de la solución madre utilizada para llegar a 0,1% en peso aproximadamente suspensión coloidal.
    2. mezcla de vórtice durante 10 segundos.
  3. Capa de la vuelta dispersión coloidal sobre el sustrato portaobjetos de vidrio
    1. Equipar una recubridora de rotación con el portaobjetos de vidrio limpio. Llenar una punta de pipeta con 100 l de la solución coloidal diluida preparada anteriormente. revestidor programa de centrifugado para ejecutar un 30 seg, 2.000 rpm ciclo. Iniciar la recubridora de rotación, y cuando a la velocidad pipetear de forma continua la solución preparada en el centro de la placa de vidrio de hilatura.
    2. Retire portaobjetos de vidrio de la recubridora de rotación, volver al microscopio óptico y verificar que una dispersión uniforme de los coloides separados sobre todo que no se tocan cubre la región central of el portaobjetos de vidrio.
  4. Se evaporan al vacío de metal platino sobre coloide portaobjetos de vidrio decorado
    1. Insertar el portaobjetos de vidrio recubierto de coloide en un evaporador de metal. Asegúrese de que el coloide decorado lado se enfrenta a la fuente de evaporación. Instalar una fuente de evaporación de metal platino y depositar 15 nm de platino metálico.
      Nota: Después de la deposición de metal, las muestras deben almacenarse en una atmósfera inerte.

2. "Natación" partículas Janus

  1. Volver a suspender Janus Coloides en una solución que contiene peróxido
    1. Cortar un cuadrado de 1 x 1 cm de tejido del cristalino, y amortiguar el final con 10 l de agua DI. Mantenga con pinzas, y frotar suavemente a lo largo de la superficie del coloide decorado portaobjetos de vidrio recubierto de platino (este paso elimina físicamente los coloides del sustrato).
    2. Inserte el tejido objetivo en 1,5 ml de agua desionizada y agitar manualmente vigorosamente durante 30 segundos en un tu selladaser. Eliminar el tejido objetivo.
    3. Pipeta de 1 ml de la solución coloidal en un nuevo envase que contiene, llenos de 1 ml de 30% w / v H solución madre 2 O 2. Mezclar suavemente las soluciones, y luego se coloca en un baño ultrasónico a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de otro periodo de incubación de 25 minutos sin agitación.
      PRECAUCIÓN: Esta solución puede evolucionar de oxígeno; no selle.
    4. Seco de 100 l de la solución coloidal acuosa restante en un microscopio electrónico de barrido (SEM) de código auxiliar para permitir la verificación SEM de la estructura de coloide Janus. 14
  2. Preparar cubeta de análisis
    1. Añadir un adicional de 1 ml de agua DI a la solución incubada que contiene coloides de peróxido y de platino recubierto de llegar a una fuerza de combustible adecuado (10%) para permitir la propulsión rápido.
      Nota: Las etapas de incubación anteriores se llevaron a cabo en concentraciones de combustible concentración más alta para limpiar la superficie del catalizador de platino.
    2. Llenar un lovolumen w cubeta de vidrio de cuarzo rectangular con la solución incubada. entrar holgadamente una tapa de empuje hacia dentro.
      PRECAUCIÓN: Riesgo de explosión - no utilice un tapón de rosca.

3. Observación Microscópica

  1. Localiza partícula de interés
    1. Cargar la cubeta en un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo adecuado (por ejemplo, 20X) y excitar emisión de fluoróforo utilizando una combinación adecuada de filtros (excitación 450 a 490 nm, emisión> 515 nm).
    2. buscar manualmente los coloides fluorescentes dentro de la cubeta.
      Nota: Ajuste de la densidad coloide mientras se mantiene la concentración de peróxido puede ser requerida. Por ejemplo, se recomienda la dilución si la densidad coloidal es alta, y numerosas burbujas de oxígeno que producen flujos están presentes. Una concentración en volumen de coloides de aproximadamente 0,003% es un punto de partida recomendado.
    3. Optimizar la configuración óptica para un seguimiento 3D: en condiciones de iluminación adecuadas, in centrarse coloides aparecerá objetos circulares como afilados. Sin embargo, como la propulsión mueve los coloides en y fuera del plano focal de un tamaño distintivo cambio de anillo brillante centrada alrededor de la esfera se observará, esto se utiliza para determinar la coordenada z para permitir el seguimiento 3D.
  2. Grabar video
    1. Antes de iniciar la captura de vídeo, enfocar el microscopio de modo que la partícula de interés produce un anillo concéntrico, con la partícula "en" la posición de enfoque. No mueva el plano de enfoque durante la captura de vídeo.
    2. Grabar videos de partículas de interés. Usar duraciones de vídeos 30 seg con velocidades de cuadro por encima de 30 Hz para permitir la reconstrucción detallada trayectoria.
  3. Reconstrucción de la trayectoria 3D
    1. Calibre del eje z
      1. Hacer un peso de 2%. solución de goma gellan en agua que contiene una suspensión de partículas Janus fluorescentes a 60 ° C, en lugar de una cubeta equivalente ala utilizada anteriormente, y dejar solidificar para formar una muestra gelificado transparente rígido que contiene coloides estáticos fijos.
      2. Centrarse en un único coloide fija usando las mismas condiciones de iluminación seleccionados anteriormente, ahora grabar una serie de imágenes fijas como el Z-foco se eleva por los desplazamientos conocidos relativos a este plano.
      3. Determinar el radio del anillo en cada posición de enfoque conocido 11.
        Nota: Este es todavía más eficiente realizado mediante el uso de un algoritmo de análisis de imágenes que se puede aplicar como un proceso por lotes para toda la calibración marcos, y videos. Un enfoque típico implica suavizar la imagen, de umbral para identificar una ubicación aproximada del centro de los objetos ', y después la localización de los x reales y las coordenadas Y del centro del anillo mediante la medición de la distancia entre picos de intensidad a cada lado del anillo. La distancia radial media de los picos de intensidad del centro del anillo a continuación se puede encontrar. 11 Esto permite que tanto el radio de la brillante un anillod coordenada que se determine con precisión sub-pixel xy. Por la localización de la x, y, z de posición de una esfera Janus fija en la goma gellan 30 micras desde el plano focal, en una secuencia de tiempo de las imágenes, las partículas pueden estar situados con un error de ± 25 nm a lo largo de cada eje. El error se puede atribuir a ruido en las imágenes. La relación señal a ruido y por lo tanto, la exactitud de los algoritmos de localización depende de la intensidad de la luz de fluorescencia detectada. Cuando una esfera Janus está lejos del plano focal su intensidad se vuelve demasiado débil para rastrear con precisión que, por ejemplo, para un diámetro de 4,8 micras coloide un z-gama de alrededor de 200 micras es posible. Un método no algorítmica alternativa es usar la medición manual sencillo de x, y centro y el radio, sin embargo, esto reducirá la precisión.
      4. Trazar una curva de calibración para relacionar el radio de z-posición y complete a una función apropiada (por ejemplo, la ecuación cúbica) para permitir la interpolación. 11
    2. Calibrar x, eje y
      1. Grabar una imagen fija imagen de microscopio óptico de una retícula de calibración espacial utilizando las mismas condiciones de microscopio elegidos en el punto 3.2.
      2. Medir la dimensión "en píxeles" de un objeto cuando se conoce el tamaño real de la imagen de la retícula de calibración espacial y usar esto para establecer un factor de conversión a píxeles micras para el plano x, y de la imagen.
    3. reconstruir la trayectoria
      1. Determinar las coordenadas x e y y radio para cada trama de la secuencia de vídeo como se describe en 3.3.1.3, utilice la función que se encuentra en 3.3.1.4 para convertir radio en z, y el factor de calibración se encuentra en 3.3.2.2 para convertir x e y coordenadas de píxeles en micras. Este procedimiento resultará en un precisos x, y, z de coordenadas para la ubicación partículas de propulsión como una función de tiempo. 11 Este procedimiento se puede implementar utilizando un algoritmo, o de forma manual.
      2. Determinar la derivada propiedades como la velocidad promedio para cuantificar la magnitud de la natación catalítica observada.

Resultados

La figura 1 muestra una dispersión típica de los coloides en un portaobjetos de vidrio limpio antes de depositar el platino. La Figura 2 muestra la imagen SEM de un típico retrodispersada para un medio de platino recubierto de Janus nadador, en este modo de formación de imágenes de la región recubierta de platino produce contraste brillante. La capa de platino hemisférica deseada es evidente. La figura 3 muestra el aspecto de un fluorescente típica Janus nadador en condiciones de iluminación óptimas fijos en la goma gellan. El nadador aparece como una característica anillo simétrico, y es el radio del anillo que se puede utilizar para determinar la posición z de la relación coloide a la posición de enfoque. La Figura 4 muestra secciones transversales representativas de la distribución de intensidad de brillo radial que se utiliza en combinación con algoritmos de análisis de imagen para localizar con precisión el centro y el radio aparente del coloide. Figura 5 g> contiene una curva de calibración obtenida utilizando una muestra coloidal fija y una etapa z-traducción microscopio calibrado para relacionar tamaño coloidal aparente y la distancia desde la posición de enfoque. Esta curva se ajustó a una función cúbica, que se utiliza para convertir en radio aparente coordenada z. Finalmente, la Figura 6 muestra una x típicos, y, z de trayectoria para un fluorescente nadador partícula Janus.

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Figura 1. óptica de imagen de microesferas de poliestireno 1,9 m de diámetro. Las microesferas se dispersan en un portaobjetos de vidrio limpiado antes de la deposición de platino. La barra de escala representa 40 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. SEM imagen de retrodispersión de un 1,9 m de diámetro microesferas de poliestireno. Las microesferas se muestran después de la deposición de platino. La barra de escala representa 2 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Imágenes de calibración de una esfera de poliestireno fluorescente 4,8 m de diámetro fijo en la goma gellan grabado utilizando un objetivo 20X (0,4 NA). Las distancias por debajo de cada imagen indican la distancia desde el plano focal del objetivo por encima de la esfera. A medida que la imagen se desenfocado 0 micras a 200 micras de la imagen en el foco de un brillante disco cambia a un anillo brillante de, el radio de los cuales depende de ampliación, la sphere tamaño y su distancia del plano focal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. x, y, z procedimiento de rastreo de partículas. Un conjunto de algoritmos de auto-escrito se utiliza para localizar primero el centro (x, y) del anillo brillante mediante la extracción de una serie de líneas verticales y horizontales y efectuar la media mediados punto entre los picos brillantes (a). El radio del anillo se calcula a partir de la intensidad del pico de un ajuste de ranura de los valores grises de píxeles promedio que irradian desde el centro del anillo (b). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. Z coordenada tabla de calibración para las esferas Janus obtenidos midiendo el radio del anillo brillante de esferas fijos en la goma gellan (ver las figuras 3 y 4). La curva de calibración se utiliza por nuestros algoritmos para convertir el radio del anillo se mide a un z- de coordenadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6. Una trayectoria de un dispositivo típico fluorescente Janus esfera natación. Una secuencia de imágenes del dispositivo de natación en movimiento se registró durante un período de 30 segundos a una velocidad de 33 Hz. El (x, y, z) las coordenadas de la trayectoria se obtuvieron mediante la localización del centro brillante anillo (Fifigura 4 (a)) y comparando el radio de oscilación medida a la curva de calibración para cada imagen de la secuencia (Figuras 4 (b) y 5). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Muchas variables en el protocolo de preparación de partículas de platino Janus afectarán las trayectorias observadas. Los parámetros tal como se describe el uso de partículas de 2 micras de diámetro dará velocidades de propulsión en el orden de 10 m por segundo. Si se utilizan partículas más pequeñas, las velocidades aumentarán, mientras que el aumento de tamaño de las partículas disminuirá la velocidad de propulsión. 12 Los detalles del protocolo de evaporación también alterar las trayectorias observadas. En este protocolo actual, se recomienda una distribución dispersa de coloides, junto con la evaporación de metal normal a la orientación de la diapositiva. Estas condiciones dan como resultado estructuras Janus simétricos como se muestra en la Figura 2, que conducen a las trayectorias lineales dentro de los límites de la difusión rotacional browniano. 13 A la inversa, si coloides apretado envasados ​​están sujetos a mirar deposición ángulo, a continuación, la simetría de la tapa Janus puede romperse , para inducir el comportamiento de girar. 14 El partículos producidos aquí muestran el movimiento relativamente isotrópico en las tres dimensiones; Sin embargo, si se utilizan recubrimientos más gruesos, platino o partículas de mayor tamaño, un sesgo hacia arriba o gravitaxis se pueden impartir. 11 Los detalles del almacenamiento de los coloides Janus después de su fabricación también puede afectar las velocidades de nado observados. La superficie de platino limpia de alta energía superficial que emerge de la etapa de evaporación es susceptible a la contaminación superficial por ejemplo, de hidrocarburos, y en tioles particulares. 15

Además, las propiedades de la solución en la que los coloides Janus se resuspenden son críticos para la observación de la propulsión. Las bajas concentraciones de peróxido de resultarán en velocidades más lentas, como la tasa de la reacción de descomposición de movimiento producir reduce. 6 Además, las bajas concentraciones de sales se traducirá en una reducción dramática de la velocidad de propulsión. 7

Una característica clave de los coloides producidos aquí es su neflotabilidad utral, lo que hace que sean adecuadas para el seguimiento 3D. En general, el campo de los dispositivos de natación ha prestado poca atención a los efectos 3D, en parte debido a algunos ejemplos destacados que se realizan a partir de metales densos, haciendo que rápidamente sedimentos, 16 sino también debido a las dificultades y los gastos asociados con la fabricación de las mediciones requeridas. existen inconvenientes claros para algunos métodos de seguimiento 3D establecidos para estos coloides que se mueven rápidamente, por ejemplo, la exploración confocal microscopía láser puede carecer de la resolución temporal para registrar un número suficiente de imágenes para resolver trayectorias. En este contexto, el método que aquí presentamos tiene la ventaja significativa de que sólo requiere un único marco para permitir la estimación de coordenada z, que por lo tanto permite alta velocidad de fotogramas. También, como coordenada z reconstrucción solamente se basa en el contraste relativo de coloide fuera de foco en cuadros individuales, en lugar de la intensidad de fluorescencia absoluta, es resistente a los efectos del temple y parpadeantesen el fluoróforo. Estas ventajas son posibles a expensas de una profundidad reducida de campo sobre el cual reconstrucción trayectoria 3D es posible, y el requisito de coloides que no se solapan bien separados. Esperamos que describe el protocolo permitirá a otros grupos de investigación con un interés en el comportamiento 3D para sus dispositivos de natación para acceder a esta información sin rodeos y con un alto grado de precisión. Está claro que la expansión de la comprensión de estos dispositivos a 3D se abrirá una gama importante de futuros fenómenos interesantes y aplicaciones. Los lectores interesados ​​en más detalles sobre el análisis de trayectoria se dirigen hacia referencia 17 que describe artefactos comunes de los sistemas de propulsión y la forma de garantizar la cuantificación exacta de las velocidades de propulsión.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la beca EPSRC de Aceleración de Carrera EP/J002402/1.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
EvaporadorMoorfield (Reino Unido)Minilab 80 Evaporador de haz de electrones
MicroscopioNikonEclipse LV100
Fuente de luz de fluorescenciaNikonNikon B2A cubo de filtro
ObjetivoNikon20X, 0.45 NA
CubetaHellmacuarzo fundido, 40 x 10 x 1 mm
Mezclador de vórticeIKALab Dancer S2
Recubrimiento giratorioLaurell Technologies Corp.Modelo WS-400BZ-6NPP/Lite
Baño ultrasónicoEumax2 litros
Tejido de lenteWhatman2105 841
Peróxido de hidrógenoSigma-Aldrich31642-1L30 wt%
PlatinoSigma-Aldrich2671710,25 mm, 99,99%
ColoidesMicroesferas Thermo ScientificFluoro-Max PS, d = 1,9  micras
Solución de descontaminación de vidrioFisher ScientificD/0025/15Decon 90
EtanolFisher ScientificE/0600DF/17Etanol
absoluto Agua desionizadaElgaPurelab Sistema de filtración opcional (15 MW)
Goma gellanSigma-AldrichP8169-100G"Phytagel"

Referencias

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