Artículo de método

Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

DOI:

10.3791/54252

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8 de octubre de 2016

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1Centre for Cardiovascular Science, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2Department of Bioengineering and Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Research Laboratory of Electronics and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 5Stem Cell Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6Department of Orthopaedic Surgery, University of Texas Health Science Center at Houston, 7Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles

En este artículo

Resumen

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tejido cardíaco humano alberga poblaciones de células precursoras multipotentes perivasculares que pueden ser adecuados para la regeneración miocárdica. La técnica descrita aquí permite el aislamiento simultáneo y purificación de dos poblaciones de células estromales multipotentes asociados con vasos nativos sangre, es decir CD146 + CD34 - pericitos y CD34 + CD146 - células adventicias, desde el miocardio humano.

Resumen

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Las células madre/estroma mesenquimales multipotentes (MSC) se aislaron convencionalmente, a través de su adherencia plástica, de las digestión de tejidos primarios, mientras que la ubicación de su tejido anatómico permaneció incierta. El reciente descubrimiento de la expresión definida de marcadores perivasculares y de células MSC por células perivasculares en múltiples tejidos por parte de nuestro grupo y otros investigadores ha brindado la oportunidad de aislar y purificar prospectivamente subpoblaciones homogéneas específicas de células precursoras perivasculares multipotentes. Hemos demostrado previamente el uso de la clasificación de células activadas fluorescentes (FACS) para purificar los pericitos microvasculares CD146 + CD34 y las células adventicias vasculares CD34 + CD146 del músculo esquelético humano. En este trabajo describimos un método para aislar simultáneamente estos dos subconjuntos de células perivasculares del miocardio humano mediante FACS, basado en la expresión de un conjunto definido de marcadores de superficie celular para selecciones positivas y negativas. Por lo tanto, este método pone a disposición dos subpoblaciones específicas de células precursoras cardíacas multipotentes similares a MSC para su uso en investigación básica y/o investigaciones terapéuticas.

Introducción

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El corazón ha sido considerado como un órgano de post-mitótico. Sin embargo, estudios recientes han demostrado la presencia de la facturación de los cardiomiocitos limitada en los corazones humanos adultos 1. Las células madre / progenitoras nativas con potencial de diferenciación de los cardiomiocitos también se han identificado dentro del miocardio en roedores adultos y los corazones humanos, incluyendo Sca-1 +, c-kit +, cardioesfera formando, y, más recientemente, las células precursoras perivasculares 2,3. Estas células representan candidatos atractivos para las terapias dirigidas a la mejora cardiaca reparación / regen....

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Protocolo

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1. Tratamiento de la Muestra cardiaca humana

  1. Asegúrese de que todos los fluidos, contenedores, los instrumentos y el área operativa dedicada son estériles.
  2. Coloque la muestra de tejido cardíaco (adquiridos por el banco de tejidos, equipo quirúrgico) en el medio de almacenamiento se compone del medio refrigerado por Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 20% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) en el hielo para el transporte 3.
  3. Retirar la muestra cardíaco del medio de almacenamiento y lavar con un medio de lavado compuesto por solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementado c....

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Resultados

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Las células individuales se distinguen de escombros y dobletes sobre la base de dispersión frontal y lateral distribuciones. Las células vivas fueron identificados por su incapacidad para asumir el tinte DAPI. La estrategia gating fue elegido sobre la base de etiquetado de control de isotipo de este vivo, la disociación de células enteras cardíaca (Figura 1). A partir de las células vivas, las células CD45 + fueron cerrada primero, seguido de CD56 +.......

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Discusión

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aumento de la evidencia apoya una limitada capacidad de regeneración del corazón humano adulto después de la lesión. Identificación y caracterización de células precursoras nativas responsables de tales respuestas regenerativas en los corazones lesionados son fundamentales tanto para la comprensión de los mecanismos y vías de señalización asociadas y el desarrollo de métodos para utilizar estas células terapéuticamente.

Protocolos anteriores han descrito el aislamiento de los subconjuntos de.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen ningún conflicto que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi y Will Ramsay de la Universidad de Edimburgo y a Alison Logar y Megan Blanchard de la Universidad de Pittsburgh por su experta asistencia con la citometría de flujo. También queremos agradecer a Anne Saunderson y Lindsay Mock por su ayuda en la obtención de tejidos humanos. Las muestras de tejido cardíaco humano, adulto y fetal se obtuvieron con el permiso ético completo del Comité de Ética de Investigación Médica del NHS Scotland Tayside y el Comité de Ética de Investigación Lothian del NHS (REC08/S1101/1), respectivamente. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación ....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AbC Anti-mouse Bead KitSondas MolecularesA-10344
Colagenasa IGibco17100-017Reconstituir el polvo según sea necesario y filtrar la esterilización
Colagenasa IIGibco17101-015
Colagenasa IVGibco17104-019
anti-humano CD34-PEBD Pharmingen555822Mantener estéril
antihumano CD45-APC-Cy7BD Pharmingen557833Mantener estéril
antihumano CD56-PE-Cy7BD Pharmingen557747Mantener estéril
antihumano CD144-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566Mantener estéril
antihumano CD146-AF647AbD SerotecMCA2141A647Mantener estéril
EGM2-BulletKitLonzaCC-3162Para la recolección de células y cultivo hasta su adherencia
DMEM, glucosa alta, GlutaMAX sin piruvato de sodioThermoFischer Scientific10566-016
Suero fetal bovinoThermoFischer Scientific10500-064Congelar en alícuotas y mantener estéril Gelatina
Sigma AldrichG1393Diluir con agua estéril
IgG1k-PEBD Pharmingen559320Mantener estéril
IgG1k-APC-Cy7BD Pharmingen557873Mantener estéril
IgG1k-PE-Cy7BD Pharmingen557872Mantener estéril
IgG1k-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566Mantener estéril
IgG1k-647AbD SerotecMCA1209A647Mantener estéril
Suero de ratónSigma AldrichM5905Mantener Película de
parafina estéril - Parafilm MSigma AldrichP7793
Penicilina-EstreptomicinaGibco15979-063Congelar en alícuotas y mantener estéril
Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4ThermoFischer Scientific10010-023Mantener estéril
Tampón de lisado de glóbulos rojos Hybri-MaxSigma AldrichR7757Mantener estéril
Trypan Solución AzulSigma AldrichT8154
Tripsina-EDTA 0.5%(10x)Invitrogen15400-054
  FACSARIA FUSIONBD PharmingenClasificador de células activadas por fluorescencia

Referencias

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  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al.

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Reimpresiones y permisos

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Etiquetas

Perivascular Precursor CellsCardiac Tissue IsolationFluorescent Activated Cell SortingCD146 CD34 MarkersTissue Digestion ProtocolCell Strainer FiltrationFlow Cytometry AnalysisCell Viability AssessmentMyocardial Progenitor CellsCell Surface Markers

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