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Artículo de método

Los ensayos in vitro de transcripción y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos

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DOI:

10.3791/54256

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20 de septiembre de 2016

 , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Department of Applied Biology and Chemical Technology, The State Key Laboratory of Chirosciences, The Hong Kong Polytechnic University

En este artículo

Resumen

En este manuscrito, describimos un protocolo para examinar funcionalmente la transcripción y la actividad inhibitoria de agentes antibacterianos dirigidos a la transcripción bacteriana.

Resumen

Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado y utilizado ampliamente durante muchos años para estudiar los mecanismos moleculares implicados en la transcripción. Este proceso requiere de múltiples subunidades de ADN-polimerasa dependiente de ARN (RNAP) y una serie de factores de transcripción que actúan para modular la actividad de RNAP durante la expresión génica. electroforesis en gel de secuenciación de transcritos radiomarcados se utiliza para proporcionar información sobre el mecanismo de transcripción detallada sobre cómo avanza y los parámetros que pueden afectarlo. En este trabajo se describe el protocolo para estudiar cómo el factor de elongación esencial Nusa regula pausa transcripcional, así como un método para identificar un agente antibacteriano de orientación iniciación de la transcripción a través de la inhibición de la formación de RNAP holoenzima. Estos métodos se pueden utilizar como una plataforma para el desarrollo de enfoques adicionales para explorar el mecanismo de acción de los factores de transcripción que aún siguen sin estar claros, así como nueva agen antibacterianots la orientación de la transcripción que es una diana farmacológica infrautilizado en la investigación y el desarrollo de antibióticos.

Introducción

La transcripción es el proceso en el que el ARN se sintetiza a partir de un molde de ADN específico. En las células eucariotas hay tres RNAPs distintas: RNAP I transcribe precursores rRNA, RNAP II es responsable de la síntesis de mRNA y ciertos pequeños ARN nucleares, y la síntesis de 5S rRNA y tRNA se realiza por RNAP III. En las bacterias, sólo hay un RNAP responsable de la transcripción de todas las clases de ARN. Hay tres etapas de la transcripción: iniciación, elongación y terminación. La transcripción es uno de los procesos más altamente regulados en la célula. Cada etapa del ciclo de la transcripción representa un punto de control para la regulación de la expresión génica 1. Para la iniciación, RNAP tiene que asociar con un factor sigma para formar la holoenzima, que se requiere para dirigir la enzima a sitios específicos llamados promotores 2 para formar un complejo promotor abierta. Posteriormente, un gran conjunto de factores de transcripción son responsables de la regulación of RNAP actividades durante las fases de elongación y terminación. El factor de transcripción se examinan aquí es la proteína altamente conservada y esencial, Nusa. Está implicado en la regulación de pausa de la transcripción y de terminación, así como anti-terminación durante la síntesis de rRNA 3-5.

Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado como herramientas poderosas para estudiar las medidas reguladoras complejas durante la transcripción 6. En general, se requiere un fragmento lineal de ADN que incluye una región promotora como la plantilla para la transcripción. La plantilla de ADN es usualmente generado por PCR o linealizando un plásmido. A continuación se añaden proteínas y los PNT (incluyendo una NTP radiomarcado con fines de detección) purificadas y productos analizados tras el período requerido de incubación. El uso de plantillas adecuadas y condiciones de reacción, todas las etapas de la transcripción se han examinado el uso de este enfoque que ha permitido la caracterización molecular detallada de transcription durante el último medio siglo 7. En combinación con la información sobre la estructura 3-dimensional de RNAP también ha sido posible investigar el mecanismo molecular de la inhibición de la transcripción por los antibióticos y los cables de antibióticos, y utilizar esta información en el desarrollo de nuevos medicamentos, la mejora de 8-10.

En este trabajo se proporcionan ejemplos de cómo los ensayos de transcripción se pueden utilizar para determinar el mecanismo de regulación por elongación de la transcripción / factor de terminación de NusA, y cómo el mecanismo de acción de una novela de plomo inhibidor de iniciación de la transcripción puede ser determinada.

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Protocolo

Precaución: Los experimentos implican el uso del isótopo radiactivo 32P y no debe iniciarse el trabajo hasta que se cumplan todas las condiciones de seguridad adecuadas. Generalmente se requiere personal para asistir a un curso de seguridad y se someten a la práctica supervisada antes de los experimentos utilizando reactivos radiactivos. Por favor, llevar equipo de protección personal (dosímetro de termoluminiscencia, gafas de seguridad, guantes, batas de laboratorio de las habitaciones de radiación, pantalones largos, zapatos cerrados-dedo del pie), al realizar la reacción.

1. Preparación de Materiales de ensayo

  1. Obtener las proteínas requeridas para el ensayo de transcripción.
    1. Para el experimento se describe aquí, la sobreproducción y purificar E. coli RNAP en el laboratorio como se describe 11, u obtener de una fuente comercial (Lista de Materiales).
      Nota: Ambos proporcionan resultados similares. Otros métodos para la purificación de RNAP nativo o de afinidad marcada también se pueden utilizar 12,13. / factores NusA Sigma se pueden obtener como described en trabajos anteriores 14,15.
  2. Agua Preparación de pirocarbonato de dietilo (DEPC) tratados
    Nota: Como alternativa, RNasa libre de agua se puede obtener a partir de fuentes comerciales (Lista de Materiales).
    1. Añadir 1 ml de dietil pirocarbonato (DEPC) a 1 L de agua purificada (0,1% v / v) y se mezcla durante la noche.
    2. agua DEPC autoclave y consejos dos veces.
  3. Patrón de ADN Preparación
    1. Se purifica el plásmido pSG1154 16 y / o 17 pIA226 usando un kit de purificación de plásmido (Lista de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Para amplificar la plantilla para los ensayos de transcripción run-off (un fragmento de 360 pb que abarca la región promotora Xil P), montar una reacción de PCR en hielo incluyendo 25 l mezcla 2x PCR (Lista de Materiales), 2 l cada uno de los cebadores (5 M) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(hacia delante) y 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (hacia atrás), 1 l plásmido pSG1154 preparation (250 M) y 20 l de agua purificada).
      1. O, alternativamente, para los ensayos de transcripción individuales redondos, amplificar un fragmento de 447 pb que abarca la región del promotor λ P R de pIA226 17. Configurar una reacción de PCR en hielo usando 25 l de mezcla de PCR 2x, 2 l cada uno de los cebadores (5 M): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(hacia delante) y 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (hacia atrás), pIA226 1 l 17 preparación de plásmido (250 M) y 20 l de agua purificada).
        Nota: Esta plantilla carece de citosina hasta la posición 26 nt, que es el 26 de nucleótidos desde el sitio de inicio de la transcripción. Por lo tanto, la transcripción usando esta plantilla permitirá la iniciación, el despacho de promotor y estancamiento en el 26 nt para formar un complejo estable elongación de la transcripción (CE) cuando solamente ATP, UTP y GTP están presentes en la reacción.
    3. Configurar una reacción de PCR con las siguientes condiciones: 95 °; C durante 30 s, 50 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 segundos, y se repite durante 30 ciclos.
    4. Se purifica el producto usando un kit de PCR de limpieza (Lista de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluye en 100 l de tampón de transcripción para el ensayo de transcripción.
    5. Determinar la concentración de ADN molde utilizando un fluorospectrometer (Lista de Materiales).
  4. Preparación NTP
    Nota: NTP se pueden obtener de diferentes fuentes comerciales (Lista de Materiales).
    1. Disolver los PNT (≥99% de pureza) en agua tratada con DEPC para hacer reserva 1 M, alícuota de 1 ml de la solución en tubos de 1,5 ml (50 l en cada tubo) y se almacena a -20 ° C.
    2. Orden α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) antes del experimento. 32 P tiene una corta vida media de 14,29 días.
      Nota: El uso de UTP marcado con alfa evita la comparación de la intensidad de las bandas con diferente longitud.
  5. Preparación de ARN de escalera
    1. Montar el seguimientoreacción ing a temperatura ambiente: 0,5 g de ARN de plantilla Mix (Lista de Materiales), 80 mM HEPES pH 7,5 tampón, 12 mM MgCl 2, NaCl 10 mM, DTT 10 mM, 2 mM ATP / CTP / GTP, UTP 0,5 mM, 2 l-32P UTP, 0,5 l de T7 RNAP (Lista de Materiales), el agua tratada con DEPC a 20 l.
    2. Permitir reacción a 37 ° C durante 1 hr. Utilizar inmediatamente o almacenar a -80 ° C.

2. Preparación de RNA Gel de secuenciación

  1. Preparación del gel
    1. Limpiar las placas de un aparato de gel de secuenciación (Lista de Materiales) dos veces con 70% de etanol y agua purificada, y montar la célula con un peine y dos espaciadores.
      Nota: Una placa se puede recubrir con el reactivo siliconado (Lista de Materiales) para facilitar la extracción de gel en el paso 4.2.
    2. Disolver 33,6 g de urea en 22 ml de agua y 16,4 ml de / EDTA (TBE) borato (54 g de tris (hidroximetil) aminometano / 5x Tris; 27,5 g de ácido bórico; 10 ml de ácido etilendiaminotetraacético 1 M (EDTA), pH 7,4 en 1 L de agua) utilizando un agitador magnético.
    3. Añadir 16 ml de bis-acrilamida solución al 40% de acrilamida / (19: 1) a la solución de urea y filtrar a través de un filtro de 0,45 micras.
    4. Añadir 514 l 10% (w / v) de persulfato amónico recién preparada en agua, seguido de 51,4 ​​l N, N, N ', N' tetrametiletilendiamina (TEMED) a la solución filtrada.
    5. Invertir suavemente la solución de gel para evitar la aireación excesiva e inyectar inmediatamente y sin problemas en la célula secuenciación preenvasados ​​horizontalmente desde la parte inferior del agujero de inyección. Tenga cuidado de no hacer burbujas durante la inyección.
    6. Permitir 1-1,5 horas hasta que el gel está completamente ajustado antes de su uso en un ensayo de transcripción. El gel se puede almacenar a temperatura ambiente durante dos o tres días cuando se envuelve con el tejido húmedo de agua en la parte superior de la célula de la secuenciación.

Reacción 3. Transcripción

  1. Transcripción Alargamiento Ensayo Pausa
    1. La formación de un complejo de elongación de la transcripción
      1. Añadir 1 l de enzima núcleo RNAP (1 M de valores de tampón de transcripción) a un tubo de 1,5 ml.
      2. Añadir 1 l de purificado sigma-70 de los factores (σ 70; 3 mM de stock en tampón de transcripción) para la RNAP e incubar en hielo durante 10 min para formar la holoenzima RNAP.
      3. Añadir 3 l 500 nM de ADN plantilla purificado (λ P R promotor a partir del producto pIA226 PCR) en tampón de transcripción a la holoenzima RNAP y se incuba a 37 ºC durante 5 minutos para formar el complejo abierto.
      4. Preparar una mezcla de componentes de la reacción en otro tubo de 1.5 ml con 5 l de 10x tampón de transcripción (Lista de Materiales: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM de MgCl 2 mM, DTT 10, 50% de glicerol, pH 7,9 en DEPC tratado agua), 2 l de 250 mM cada uno de GTP y UTP, 1 l de ATP 1 mM, y 1 l de α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Añadir agua tratada con DEPC a 41 l.
        Note: inhibidor de RNasa (Lista de Materiales) se puede utilizar para reducir al mínimo la contaminación de ARNasa.
      5. Transferir la solución de la mezcla al tubo que contiene el complejo abierto y se incuba a 37 ºC durante 15 minutos para formar el complejo de elongación de la transcripción se detuvo en 26 nt.
      6. Mover la reacción a temperatura ambiente (~ 21 ° C) y se añade 1 l de 2,5 mg / ml de rifampicina a una concentración final de 50 mg / ml.
      7. Añadir 1 l de 0,1 mM purificados NusA a la mezcla de reacción y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
      8. Añadir 2 l de 250 mM CTP en la mezcla de reacción para hacer un volumen final de 50 l y medir el tiempo de reacción usando un temporizador.
      9. Transferencia de 5 l de la solución de reacción en 2 l de tampón de ARN gel de carga (95% de formamida, 0,05% de azul de bromofenol y 0,05% xileno cianol) en 30, 60, 120, 240, 480, y 1200 seg para apagar la reacción.
      10. Desechar las puntas 32P UTP y tubos en un cont residuos radiactivosainer.
  2. Ensayo de transcripción iniciación
    1. La formación del complejo abierto
      1. Diluir purificada σ 70-0,5 M.
      2. Repita los pasos 3.1.1.1 a 3.1.1.3 usando 0,5 M (en lugar de 3 M) purificada σ 70, y la plantilla de ADN (la región del promotor P Xil del producto pSG1154 PCR).
    2. La inhibición de ensayo de iniciación de la transcripción
      1. Añadir el inhibidor diseñado para evitar la formación de holoenzima RNAP a enzima núcleo RNAP antes de la adición de σ 70 (después de la etapa 3.1.1.1), seguido por pasos 3.1.1.2 y 3.1.1.3 examinar si el inhibidor es capaz de interrumpir la formación de la holoenzima.
      2. Alternativamente, después del paso 3.1.1.2, añadir el inhibidor de examinar si es capaz de inhibir competitivamente la unión a σ 70 RNAP.
      3. Usar la misma cantidad de DMSO, el disolvente del inhibidor, en lugar del inhibidor de la stac en las reacciones de control.
    3. La finalización de la reacción
      1. Disolver la heparina en agua a una concentración madre de 1 mg / ml y el inventario en -20 ° C.
        Nota: La heparina es un competidor de ADN que puede secuestrar RNAP que no ha formado un complejo abierto. Una vez se forma el complejo abierto, la heparina no puede entrar en el sitio de unión a ADN de RNAP e inhibir la transcripción a partir de complejo abierto pre-formado. Por lo tanto, la heparina sólo es necesario para los ensayos de una sola ronda de; no es necesario para los ensayos multi-redondas.
      2. Preparar la mezcla de reacción usando 5 l de 10x tampón de transcripción (Lista de Materiales), 1 l de 1 mg solución de heparina / ml, 1 l de 10 mM de cada uno de ATP, GTP, CTP y, UTP 2,5 mM, y 1 l de α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Añadir agua tratada con DEPC a 45 l.
      3. Mezclar la mezcla de reacción con el complejo abierto transcripción, dar un pulso y se incuba a 37 ° C durante 20 min.
      4. Transferir 10 l de la reacción por lolución en 5 l de tampón de ARN gel de carga (95% de formamida, 0,05% de azul de bromofenol y 0,05% xileno cianol) para inactivar la reacción.

4. Ejecución y Desarrollo de ARN del gel

  1. La ejecución de la operación de desnaturalización en gel de poliacrilamida
    1. Correr el gel a 50 ºC y 50 W en tampón 1x TBE durante aproximadamente 1,5 h hasta que la temperatura del gel y el tampón es estable a 50 ºC.
    2. muestras de calor a 90 ° C durante 30 segundos y moverlos sobre hielo de carga previa en el gel.
    3. Cargar las muestras en los pocillos en la parte superior del gel junto con un carril que contiene 2 l de escalera de ARN (dilución 1: 100).
    4. Correr el gel a 50 W y 50 ° C en tampón TBE 1x hasta que el colorante azul de bromofenol alcanza ~ 2/3 por el gel.
  2. Tratamiento Gel
    1. Abrir separar lentamente y con cuidado la placa superior de la celda de secuenciación. Tener mucho cuidado para evitar romper el gel.
    2. chromatograp cortepapel HY (Lista de Materiales) para que coincida con el tamaño del gel a partir de la parte superior para el colorante azul de bromofenol. Utilice un contador Geiger para confirmar la posición aproximada de los transcritos de ARN marcados radiactivamente.
    3. cubrir con cuidado el gel con el papel de filtro, y presione firmemente hasta que el gel se adhiere al papel de filtro. Corte y deseche la parte inferior del gel a los residuos radiactivos como los PNT no incorporadas correr a la parte inferior del gel, que puede ser muy caliente.
    4. Colocar un trozo de tamaño similar de papel de filtro en el lecho de secado de una máquina de secado al vacío, y coloque cuidadosamente el papel recubiertas de gel sobre ella con la cara hacia arriba en gel.
    5. Cubrir el gel con una envoltura de plástico y seco a 60 ° C durante 1,5 horas.
    6. Envolver el otro lado del papel de filtro recubierto de gel con una envoltura de plástico y colocar en una placa de fósforo fotoestimulable en el caso de imágenes, con el tiempo de exposición adecuado, que puede variar entre 1 hr y dependiendo noche a la mañana en la eficacia de la reacción.
    7. La imagen de la placa de fósforo usandoun escáner de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinar la intensidad de la banda relativa utilizando el software ImageJ de acuerdo con el manual del software.
    8. Utilizar un contador Geiger para comprobar la contaminación radiactiva en el área de trabajo, limpie los elementos sospechosos y el área con el tejido y un agente de limpieza y disponer el tejido en el contenedor de residuos.

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Resultados

eficacia de la transcripción puede determinarse midiendo el nivel de radiación en las bandas en diferentes puntos temporales. El ensayo haciendo una pausa para probar la función del factor de Nusa visualización de la pausa, la terminación activada, y la escorrentía productos (Figura 1A). En presencia del dominio N-terminal de NusA (NusA NTD; residuos de aminoácidos 1-137), la apariencia de los productos de ARN se retrasó significativamente en comparación con el experimen...

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Discusión

En todos los organismos, la transcripción es un proceso estrechamente regulado. Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado para proporcionar una plataforma para probar los efectos de los factores de transcripción, moléculas pequeñas e inhibidores de transcripción. En este trabajo el método, se describe un ensayo para la transcripción bacteriana general. los ensayos de transcripción en combinación con electroforesis en gel de secuenciación de transcritos son muy importantes para los estud...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo reconoce una beca de la Universidad de Newcastle (CM).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Obtener las proteínas necesarias para el ensayo
E. coli RNAPEpicentreS90250
en agua
DEPC Sigma-Aldrich D5758
Agua libre de RNasa 
Agua sin nucleasas AmbionThermoFisherAM9937
preparación
  Además SV Minipreps Sistema de purificación de ADNPromegaA1330
ACCUZYME MixBiolineBIO-25028
Imprimaciones
Wizard SV Gel y sistema de limpieza PCR PromegaA9281
NanoDrop 3300 espectrómetro fluorométricoThermo ScientificND-3300
NTP Preparación
ATPSigma-Aldrich A6559
UTPSigma-Aldrich U1006
GTPSigma-Aldrich G3776
CTPSigma-Aldrich C9274
rNTP de alta purezaGE Healthcare27-2025-01
α-32P UTP PerkinElmer   BLU007C001MC
escalera de ARN compuesto radiactivo 
Mezcla de plantilla de marcador de ARN perfecto de Novagen 0.1– 1 kbMillipore69003
HEPESSigma-Aldrich H7006
Cloruro de sodioSigma-Aldrich S7653
Cloruro de magnesioSigma-Aldrich M8266
DTTSigma-AldrichDTT-RO
T7 RNAPPromegaP2075
de gel
Célula de secuenciación de ácido nucleico Sequi-Gen GT Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich SL2
urea   Sigma-Aldrich U6504
tris (hidroximetil) aminometano   Sigma-Aldrich 
ácido bórico Sigma-Aldrich B7901
ácido etilendiaminotetraacético Sigma-Aldrich ED
40% Acrilamida/bis-acrilamida Sigma-Aldrich A9926
persulfato de amonio Sigma-Aldrich A3678
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED)Sigma-Aldrich T9281
Ensayo
de transcripción Cloruro de potasioSigma-Aldrich P9541
glicerol    Sigma-Aldrich G5516
rifampicina    Sigma-Aldrich Formamida R3501
   Sigma-Aldrich F9037
azul de bromofenol Sigma-Aldrich B0126
xileno cianol Sigma-Aldrich X4126
heparina Sigma-Aldrich 84020
Inhibidor de la RNasina ribonucleasaPromegaN2511
Tampón de transcripción 
Tris baseSigma-Aldrich T1503
Cloruro de potasioSigma-Aldrich P9541
Cloruro de magnesioSigma-Aldrich M2393
DTT   Sigma-Aldrich DTT-RO
glicerol   Sigma-Aldrich G5516
Papel
Whatman  3MM Chr Papel de cromatografíaFisher Scientific05-714-5
Descontaminante
Decon 90DeconDecon90
Tratamiento de
Typhoon Trio+ imagerGE Healthcare Life Sciences63-0055-89
de transcripción Preparación de pirocarbonato de dietilo (DEPC) tratada conAsistente dede plantillas de ADNPCR Preparación de Preparación 154563de filtroradiactivogel

Referencias

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