En este manuscrito, describimos un protocolo para examinar funcionalmente la transcripción y la actividad inhibitoria de agentes antibacterianos dirigidos a la transcripción bacteriana.
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Artículo de método
Los ensayos in vitro de transcripción y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado y utilizado ampliamente durante muchos años para estudiar los mecanismos moleculares implicados en la transcripción. Este proceso requiere de múltiples subunidades de ADN-polimerasa dependiente de ARN (RNAP) y una serie de factores de transcripción que actúan para modular la actividad de RNAP durante la expresión génica. electroforesis en gel de secuenciación de transcritos radiomarcados se utiliza para proporcionar información sobre el mecanismo de transcripción detallada sobre cómo avanza y los parámetros que pueden afectarlo. En este trabajo se describe el protocolo para estudiar cómo el factor de elongación esencial Nusa regula pausa transcripcional, así como un método para identificar un agente antibacteriano de orientación iniciación de la transcripción a través de la inhibición de la formación de RNAP holoenzima. Estos métodos se pueden utilizar como una plataforma para el desarrollo de enfoques adicionales para explorar el mecanismo de acción de los factores de transcripción que aún siguen sin estar claros, así como nueva agen antibacterianots la orientación de la transcripción que es una diana farmacológica infrautilizado en la investigación y el desarrollo de antibióticos.
Introducción
La transcripción es el proceso en el que el ARN se sintetiza a partir de un molde de ADN específico. En las células eucariotas hay tres RNAPs distintas: RNAP I transcribe precursores rRNA, RNAP II es responsable de la síntesis de mRNA y ciertos pequeños ARN nucleares, y la síntesis de 5S rRNA y tRNA se realiza por RNAP III. En las bacterias, sólo hay un RNAP responsable de la transcripción de todas las clases de ARN. Hay tres etapas de la transcripción: iniciación, elongación y terminación. La transcripción es uno de los procesos más altamente regulados en la célula. Cada etapa del ciclo de la transcripción representa un punto de control para la regulación....
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Protocolo
Precaución: Los experimentos implican el uso del isótopo radiactivo 32P y no debe iniciarse el trabajo hasta que se cumplan todas las condiciones de seguridad adecuadas. Generalmente se requiere personal para asistir a un curso de seguridad y se someten a la práctica supervisada antes de los experimentos utilizando reactivos radiactivos. Por favor, llevar equipo de protección personal (dosímetro de termoluminiscencia, gafas de seguridad, guantes, batas de laboratorio de las habitaciones de radiación, pantalones largos, zapatos cerrados-dedo del pie), al realizar la reacción.
1. Preparación de Materiales de ensayo
- Obtener las proteínas re....
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Resultados
eficacia de la transcripción puede determinarse midiendo el nivel de radiación en las bandas en diferentes puntos temporales. El ensayo haciendo una pausa para probar la función del factor de Nusa visualización de la pausa, la terminación activada, y la escorrentía productos (Figura 1A). En presencia del dominio N-terminal de NusA (NusA NTD; residuos de aminoácidos 1-137), la apariencia de los productos de ARN se retrasó significativamente en comparación con el experimen.......
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Discusión
En todos los organismos, la transcripción es un proceso estrechamente regulado. Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado para proporcionar una plataforma para probar los efectos de los factores de transcripción, moléculas pequeñas e inhibidores de transcripción. En este trabajo el método, se describe un ensayo para la transcripción bacteriana general. los ensayos de transcripción en combinación con electroforesis en gel de secuenciación de transcritos son muy importantes para los estud.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo reconoce una beca de la Universidad de Newcastle (CM).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Obtener las proteínas necesarias para el ensayo | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| en agua | |||
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Agua libre de RNasa | |||
| Agua sin nucleasas Ambion | ThermoFisher | AM9937 | |
| preparación | |||
| Además SV Minipreps Sistema de purificación de ADN | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| Imprimaciones | |||
| Wizard SV Gel y sistema de limpieza PCR | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 espectrómetro fluorométrico | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparación | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| rNTP de alta pureza | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | |
| escalera de ARN compuesto radiactivo | |||
| Mezcla de plantilla de marcador de ARN perfecto de Novagen 0.1– 1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| de gel | |||
| Célula de secuenciación de ácido nucleico Sequi-Gen GT | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris (hidroximetil) aminometano | Sigma-Aldrich | ||
| ácido bórico | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ácido etilendiaminotetraacético | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrilamida/bis-acrilamida | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| persulfato de amonio | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ensayo | |||
| de transcripción Cloruro de potasio | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicina | Sigma-Aldrich | Formamida R3501 | |
| Sigma-Aldrich | F9037 | ||
| azul de bromofenol | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xileno cianol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparina | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| Inhibidor de la RNasina ribonucleasa | Promega | N2511 | |
| Tampón de transcripción | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Cloruro de potasio | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Papel | |||
| Whatman 3MM Chr Papel de cromatografía | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Descontaminante | |||
| Decon 90 | Decon | Decon90 | |
| Tratamiento de | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
Referencias
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymer....
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