Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Resumen

MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

Resumen

Los pequeños ARN no codificantes (miRNAs) han sido implicados en una variedad de enfermedades humanas, incluyendo síndromes metabólicos. Pueden utilizarse como biomarcadores para el diagnóstico y el pronóstico o pueden servir como dianas para el desarrollo de fármacos, respectivamente. Recientemente se ha demostrado que los miRNAs se transportan en las lipoproteínas, en particular en las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y se entregan a las células receptoras para su absorción. Esto plantea la posibilidad de que los miARN desempeñen un papel crítico y fundamental en la función celular y de los órganos a través de la regulación de la expresión génica, así como mensajeros para las comunicaciones entre células y la diafonía entre órganos. Los métodos actuales para el aislamiento de miARN a partir de HDL purificado no son prácticos cuando se utilizan muestras pequeñas a gran escala. Esto se debe en gran medida a los métodos laboriosos y lentos utilizados para el aislamiento de lipoproteínas. Hemos desarrollado un enfoque simplificado para aislar rápidamente el HDL purificado adecuado para el análisis de miARN a partir de muestras de plasma. Este método debería facilitar las investigaciones sobre el papel de los miRNAs en la salud y la enfermedad y, en particular, proporcionar nuevos conocimientos sobre la variedad de funciones biológicas, fuera del transporte inverso del colesterol, que se han atribuido al HDL. Además, las especies de miARN que están presentes en el HDL pueden proporcionar información valiosa de biomarcadores clínicos para el diagnóstico de diversas enfermedades.

Introducción

Los microRNAs son especies endógenas de ARN diminutas no codificantes que están altamente conservadas y se consideran actores clave en la regulación de diversos procesos biológicos mediante la degradación o represión de ARN mensajeros diana específicos¹. Debido a que los miARN actúan intracelularmente, se han explorado como biomarcadores derivados de tejidos, lo que condujo al descubrimiento de las funciones específicas de los tejidos de estos miARN. Sin embargo, los miRNAs también se encuentran extracelularmente, ya sea asociados a proteínas o en exosomas/microvesículas que pueden protegerlos eficazmente de la degradación por RNasas^{extracelulares 2}. Estudios más recientes han demostrado que el efecto protector del HDL puede no estar estrechamente relacionado con su capacidad para promover el flujo de colesterol, sino más bien con su carga no colesterolosa, en particular como portador de miARN circulantes ^{3, 4}. Estos miRNAs no solo pueden modular el metabolismo de los lípidos, sino que también se asocian con efectos antiinflamatorios, antioxidantes y antitrombóticos del complejo HDL-miRNA ^{5, 6}.

Para explorar más a fondo el papel de los miRNAs transportados en las partículas de HDL, es necesario establecer un protocolo simple y fácil para la extracción de miRNAs de HDL altamente purificado aislado para su uso en la rutina clínica. Se han descrito numerosos métodos para aislar el HDL. Estos métodos consumen mucho tiempo o requieren un gran volumen de plasma que puede requerir la agrupación de muestras, una diálisis extensa para desalinizar lipoproteínas aisladas y no eliminan completamente los exosomas como fuente de miARN³, respectivamente. Aquí describimos un método simple y rápido que puede aislar miARN de HDL altamente purificado utilizando un pequeño volumen de muestras de sangre a mayor escala. Creemos que este método puede servir como buena referencia para promover la investigación sobre el papel de los miRNAs circulantes y, en particular, el papel de las HDL en la facilitación de la comunicación entre diversas células y órganos.

Protocolo

1. Recolección de Muestras de Sangre

1. Recoger el ayuno muestras de sangre venosa periférica en tubos de 10 ml de plástico que contienen ácido anticoagulante etilendiaminotetraacético (EDTA) (que tiene varias ventajas sobre otros anticoagulantes) por punción venosa estándar de una vena prominente en la fosa antecubital.
2. Centrifugar las muestras de sangre a 1.600 xg durante 20 min a 4 ° C en una centrífuga de mesa para obtener plasma libre de células rojas de la sangre y pequeñas cantidades de ARN.
3. Secuencialmente centrifugar el sobrenadante a 3.000 g (4 ° C) en un cubo de rotor de balanceo por 10 min para eliminar WBC y plaquetas y luego adicional 15 min para eliminar los desechos de células restante, respectivamente.
4. Medir la densidad del plasma utilizando un densitómetro a TA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: El ajuste de la densidad (d = 1,023 g / ml) con solución salina al 0,9% puede ser necesaria después de la eliminación de los exosomas pero antes de la ultracentrifugación en gradiente de densidad.

2. Eliminación de exosoma de Plasma

1. Retire los exosomas circulantes que tienen una densidad similar a la HDL y representan una fuente cuantitativamente significativo de miARN ^3.
   1. Para ello, agregue 252 l solución de precipitación exosome a 1 ml de plasma seguido de incubación durante 30 min a 4 ° C. Para sedimentar los exosomas, centrifugar la mezcla durante 30 minutos a 1500 g a 4 ° C.
   2. Para aislar HDL, la transferencia de 1 ml del sobrenadante resultante a un tubo de ultracentrífuga de policarbonato de paredes gruesas para su procesamiento posterior con la ultracentrifugación en gradiente de densidad (véase más adelante).

3. La ultracentrifugación en gradiente de densidad (Figura 1).

1. Para separar HDL utilizar un proceso de 3 pasos empleando una ultracentrífuga suelo con un rotor de ángulo fijo que opera a 448.811 x G y 8 ° C, respectivamente.
2. Preparar tres soluciones diferentes de densidad secuencialmente y fresco para cada aislamiento.
   1. Preparar la solución A (aislamiento de VLDL, d = 1,006 g / ml) mediante la disolución de 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na y 1 ml de NaOH 1 N en 1.000 ml de agua destilada-autoclave. A continuación, añadir un adicional de 3 ml de agua destilada en autoclave.
   2. Preparar la solución B (aislamiento de LDL, d = 1,182 g / ml) mediante la adición de 25,2 g de NaBr a 100 ml de solución A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
   3. Preparar la solución de C (aislamiento de HDL, d = 1,470 g / ml) mediante la mezcla de 78,8 g de NaBr con 100 ml de solución A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmar la densidad adecuada a temperatura ambiente usando un densitómetro. Mantenga todas las soluciones a 4 ° C hasta su uso posterior.

4. Aislamiento de VLDL

1. Mezclar 1 ml de plasma (densidad media = 1.023 g / ml) y nucleasa libre 200 l de Fat Red 7B en un tubo de ultracentrífuga de pared gruesa 6,5 ​​ml de policarbonato.
2. A continuación, la capa cuidadosamente 5 ml de la solución A en la parte superior de la mezcla. Si es necesario, añadir grasa adicional Red 7B en la parte superior de la solución A to equilibrar el peso de cada tubo. Centrifugar durante 2 horas (aceleración - 5), (deceleración - 7).
   NOTA: Durante la centrifugación, las lipoproteínas se acumulan como una banda en sus regiones de densidad de equilibrio.
3. Al final de la carrera observar 2 capas. Retirar 1,5 ml de la fracción VLDL que representa la capa superior y se almacena a 4 ° C.
4. Finalmente, utilizando una pipeta de transferencia 4 ml de la parte inferior del tubo que contiene el LDL, HDL, la albúmina y la fracción de ácido graso a un nuevo tubo de policarbonato para el aislamiento de LDL.

5. Aislamiento de LDL

1. Mezclar 2 ml de la solución B y 100 l de nucleasa libre de grasa Red 7B en el tubo que contiene la fracción LDL y HDL (sección 4), respectivamente.
2. Centrifugar a cabo durante 3 horas (aceleración 9, deceleración 7). A partir de entonces, retirar 1,5 ml de la fracción LDL que representa la capa superior y mantener a 4 ° C o almacenar a -80 ° C. Finalmente, la transferencia de 4 ml de la parte inferior del tubo que contiene la HDLfracción a un nuevo tubo de policarbonato.

6. Aislamiento de HDL

1. Mezclar 2 ml de la solución C, 100 nucleasa l libre Fat Red 7B y 15 l de 98% β-mercaptoetanol en el tubo que contiene la fracción HDL, respectivamente.
2. Centrifugar durante 3 horas (aceleración 9, deceleración 7). A partir de entonces retire 2 ml de la fracción HDL representan la capa superior y, o bien mantener a 4 ° C o almacenar a -80 ° C.

7. La desalación y concentración de la lipoproteína de fracciones

1. Para evitar la interferencia con la electroforesis en gel de agarosa posterior y PCR, eliminar el exceso de sal añadida durante la ultracentrifugación en gradiente de densidad usando dispositivos de filtro centrífugos con el corte de peso molecular apropiado (tubo 3K para VLDL y el tubo de 10K para LDL / HDL) como se describe por las instrucciones del fabricante.
   1. En pocas palabras, después de la adición de 2,5 ml de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM; pH 7,4) frío centrifuge toda la fracción VLDL recogió-durante ultracentrifugación en gradiente de densidad a 4 ° C durante 60 min usando un rotor de cubeta oscilante.
   2. Desalar la fracción LDL dos veces con 10 ml de PBS enfriado en hielo durante 30 minutos cada uno. A continuación, utilizar 13 ml de PBS helado dos veces para la desalación de la fracción HDL. El volumen de PBS más alto es necesario para mejorar la movilidad con electroforesis en gel de agarosa. Después de la centrifugación, eliminar los solutos que contienen lipoproteínas y mantenerse a 4 ° C o se almacena a -80 ° C.

8. gel de agarosa La electroforesis

1. Perfrom electroforesis en gel de agarosa empleando el kit de lipoproteínas con modificaciones menores de las instrucciones del fabricante de la siguiente manera.
   NOTA: Este paso es sólo para evaluar la calidad y la pureza de las muestras concentradas de lipoproteínas.
   1. En pocas palabras, obtener 6 l de la fracción de lipoproteínas de desalado con ultracentrifugación en gradiente de densidad y cargar en un gel de lipoproteína pre-cast. Utilice LipoP humanarotein normas de VLDL, LDL y HDL como referencia de tamaño. Llevar a cabo la electroforesis a temperatura ambiente a 100 V durante 60 minutos usando tampón Rep Prep.
   2. Secar el gel durante 10 min y luego manchar durante 10 min a RT con Fat Red 7B. Destain el gel en una mezcla de metanol-agua 75:25 (v / v) y se seca de nuevo por 5 min.

9. RNA Extracción y Purificación

1. Perfrom aislamiento de los genes miARN HDL humano purificado utilizando el kit de suero / plasma de aislamiento y purificación de miRNA.
   1. En pocas palabras, añadir 1 ml de reactivo de lisis de ARN de 200 l de HDL purificada, se mezcla con un vórtice y luego se incubaron durante 5 min a RT para asegurar la disociación completa de los complejos de nucleoproteína y la inactivación de las RNasas.
   2. Entonces pico de 3,5 l de Caenorhabditis Elegans sintética microARN (miR-cel-39, 1,6 x 10 ⁸ copias / l) en la mezcla. A continuación, llevar a cabo la extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. realizar Purificatien extraída de los genes miARN con columnas de centrifugación eluir según las instrucciones del fabricante. Medir la concentración de miARN de HDL purificada con un spectrophorometer.
   NOTA: La elución de miRNA de las columnas de centrifugación empleó 16 l de agua libre de RNasa.

10. transcripción inversa (RT-PCR)

1. Aislar 100 ng de los genes miARN de HDL enriquecida con los genes miARN sintético (cel-miR-39) y a transcripción inversa en un volumen de reacción de 20 l que emplea el kit de transcripción inversa y de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Realizar controles apropiados sin plantilla miRNA (NTC) y sin mezcla de enzima transcriptasa inversa (NRT).

11.-PCR en tiempo real (QRT-PCR)

1. Perfrom PCR en tiempo real en un volumen total de 20 l con 2 l de una dilución 1: 2 del ADNc, 10 l de la mezcla PCR, 2 l cebador universal, 2 l de cebadores miARN y 4 l de agua libre de RNasa.
2. Ejecutar los reactien en placas de 96 pocillos a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 segundos y 55 ° C durante 30 s y una fase de extensión a 70 ° C durante 30 s.ec perfrom todas las reacciones por triplicado .
3. A continuación, calcuate cantidades relativas de los genes miARN utilizando el método 2 ^-ΔΔ Ct después de la normalización para la limpieza de genes sintética según las instrucciones del fabricante.

Resultados

Aislamiento de lipoproteína de alta densidad después de eliminar las exosomas
Para obtener los genes miARN de HDL altamente purificada es necesario para eliminar los exosomas que representan una fuente de contaminación miRNA ^7. Esto se hizo antes de la ultracentrifugación en gradiente de densidad con un kit disponible en el mercado. Para fines prácticos un protocolo de ultracentrifugación en gradiente de densidad estándar de tres pasos de...

Discusión

Identificación de nuevos biomarcadores de la sangre será ayudar en el diagnóstico clínico y el pronóstico de diversas enfermedades. Los microARN han sabe que poseen todas las cualidades de biomarcadores y se ha demostrado en diversos estudios ^14-17. En este estudio hemos demostrado método fácil rápido y sencillo para aislar los genes miARN de HDL plasma. Densidad convencional gradiente método de ultra-centrifugación de aislamiento de VLDL, LDL y HDL depende de muestreo preciso de plasma, una preparación preci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de plástico Vacutainer Lavanda K2EDTA	Becton, Dickinson y compañía	366643
centrífuga	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R
Densitómetro Densito 30PX	Mettler Toledo	MT51324450
solución ExoQuick	Invitrogen	4484451
Tubo ultracentrífugo de pared gruesa de policarbonato	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrífuga	Thermo Scientific	46902
Rojo Gordo 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Dispositivos de filtro centrífugo 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra Dispositivos de filtro centrífugo 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Laboratorios Helena	3344,3544T Estándares de
lipoproteínas humanas para VLDL, LDL y HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Laboratorios Helena	3100
Columnas de centrifugación RNeasy MinElute	Analizador Qiagen
NanoDrop 1000	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Sistema
CFX96 Touch BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Suero/Control de Espiga Plasmática	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH
0.20 µ M filtro de jeringa estéril	SIGMA-ALDRICH	Z227536