Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Resumen

MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

Resumen

Los pequeños ARN no codificantes (miRNAs) han sido implicados en una variedad de enfermedades humanas, incluyendo síndromes metabólicos. Pueden utilizarse como biomarcadores para el diagnóstico y el pronóstico o pueden servir como dianas para el desarrollo de fármacos, respectivamente. Recientemente se ha demostrado que los miRNAs se transportan en las lipoproteínas, en particular en las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y se entregan a las células receptoras para su absorción. Esto plantea la posibilidad de que los miARN desempeñen un papel crítico y fundamental en la función celular y de los órganos a través de la regulación de la expresión génica, así como mensajeros para las comunicaciones entre células y la diafonía entre órganos. Los métodos actuales para el aislamiento de miARN a partir de HDL purificado no son prácticos cuando se utilizan muestras pequeñas a gran escala. Esto se debe en gran medida a los métodos laboriosos y lentos utilizados para el aislamiento de lipoproteínas. Hemos desarrollado un enfoque simplificado para aislar rápidamente el HDL purificado adecuado para el análisis de miARN a partir de muestras de plasma. Este método debería facilitar las investigaciones sobre el papel de los miRNAs en la salud y la enfermedad y, en particular, proporcionar nuevos conocimientos sobre la variedad de funciones biológicas, fuera del transporte inverso del colesterol, que se han atribuido al HDL. Además, las especies de miARN que están presentes en el HDL pueden proporcionar información valiosa de biomarcadores clínicos para el diagnóstico de diversas enfermedades.

Introducción

Los microRNAs son especies endógenas de ARN diminutas no codificantes que están altamente conservadas y se consideran actores clave en la regulación de diversos procesos biológicos mediante la degradación o represión de ARN mensajeros diana específicos¹. Debido a que los miARN actúan intracelularmente, se han explorado como biomarcadores derivados de tejidos, lo que condujo al descubrimiento de las funciones específicas de los tejidos de estos miARN. Sin embargo, los miRNAs también se encuentran extracelularmente, ya sea asociados a proteínas o en exosomas/microvesículas que pueden protegerlos eficazmente de la degradación por RNasas^{extracelulares 2}

Protocolo

1. Recolección de Muestras de Sangre

1. Recoger el ayuno muestras de sangre venosa periférica en tubos de 10 ml de plástico que contienen ácido anticoagulante etilendiaminotetraacético (EDTA) (que tiene varias ventajas sobre otros anticoagulantes) por punción venosa estándar de una vena prominente en la fosa antecubital.
2. Centrifugar las muestras de sangre a 1.600 xg durante 20 min a 4 ° C en una centrífuga de mesa para obtener plasma libre de células rojas de la sangre y pequeñas cantidades de ARN.
3. Secuencialmente centrifugar el sobrenadante a 3.000 g (4 ° C) en un cubo de rotor de balanceo por 10 min para eliminar WBC y plaquetas y luego ....

Resultados

Aislamiento de lipoproteína de alta densidad después de eliminar las exosomas
Para obtener los genes miARN de HDL altamente purificada es necesario para eliminar los exosomas que representan una fuente de contaminación miRNA ^7. Esto se hizo antes de la ultracentrifugación en gradiente de densidad con un kit disponible en el mercado. Para fines prácticos un protocolo de ultracentrifugación en gradiente de densidad estándar de tres pasos .......

Discusión

Identificación de nuevos biomarcadores de la sangre será ayudar en el diagnóstico clínico y el pronóstico de diversas enfermedades. Los microARN han sabe que poseen todas las cualidades de biomarcadores y se ha demostrado en diversos estudios ^14-17. En este estudio hemos demostrado método fácil rápido y sencillo para aislar los genes miARN de HDL plasma. Densidad convencional gradiente método de ultra-centrifugación de aislamiento de VLDL, LDL y HDL depende de muestreo preciso de plasma, una preparación preci.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de plástico Vacutainer Lavanda K2EDTA	Becton, Dickinson y compañía	366643
centrífuga	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R
Densitómetro Densito 30PX	Mettler Toledo	MT51324450
solución ExoQuick	Invitrogen	4484451
Tubo ultracentrífugo de pared gruesa de policarbonato	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrífuga	Thermo Scientific	46902
Rojo Gordo 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Dispositivos de filtro centrífugo 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra Dispositivos de filtro centrífugo 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Laboratorios Helena	3344,3544T Estándares de
lipoproteínas humanas para VLDL, LDL y HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Laboratorios Helena	3100
Columnas de centrifugación RNeasy MinElute	Analizador Qiagen
NanoDrop 1000	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Sistema
CFX96 Touch BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Suero/Control de Espiga Plasmática	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH
0.20 µ M filtro de jeringa estéril	SIGMA-ALDRICH	Z227536

75004261 de detección de PCR en tiempo real Qiagen 218161 480878