Summary
우리는 보유, 수송 지질 이중층 형성 시스템을 보여준다. 냉동 막 전구체는 상온 상태로 전환하면 지질 이중층 막을 80 % 성공률 1 시간 내에 형성 될 수있다. 이 시스템은 이온 채널과 관련된 힘드는 과정과 전문 지식을 줄일 수 있습니다.
Abstract
인공 지질 이중층 또는 검은 지질 막 (BLM), 이온 채널 단백질의 상호 작용을 연구뿐만 아니라 바이오 센서 응용 프로그램을위한 강력한 도구입니다. 그러나, 기존의 BLM 형성 기술은 몇 가지 단점을 가지고 있고 그들은 종종 특정 전문 지식과 힘든 과정을 필요로한다. 특히, 기존의 BLMs 낮은 형성 성공률과 일치하지 않는 막 형성 시간을 겪는다. 여기서는, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)을 통상적으로 사용되는 필름 (폴리 테트라 플루오로 에틸렌, 폴리 옥시 메틸렌, 폴리스티렌)로 대체함으로써 조절 시닝 아웃 향상된 BLM 생성율 함께 보유하고 수송 BLM 형성 시스템을 보여준다. 이 실험에서는, 예컨대 PDMS 박막 등의 다공질 구조 중합체가 사용된다. 저점도 통상적으로 사용되는 용매는 대조적으로 또, 스쿠알렌의 사용은 막의 수명을 연장, PDMS에 의해 천천히 용매의 흡수를 통해 제어 시닝 아웃 시간을 허용. 광고에서시 조건은 스쿠알렌과 헥사 데칸의 혼합물을 사용함으로써, 지질 용액의 빙점 무기한 저장되고 용이하게 운반 할 수 있고, 전구체 막을 제작했다 이외에 (~ 16 ° C)를 증가시켰다. 이러한 막 전구체는 <1 시간 BLM의 형성 시간을 단축하고 80 % ~ BLM의 형성 속도를 달성했다. 또한, 그래미시 딘 A의 이온 채널 실험 멤브레인 시스템의 타당성을 입증 하였다.
Introduction
인공 지질 이중층 막 또는 블랙 지질막 (BLM)은 세포막 및 이온 채널의 메카니즘을 해명뿐만 아니라 이온 채널 이온 / 분자간 상호 작용을 이해하기위한 중요한 도구이다. 패치 - 클램프 방법이지만 1-7 종종 세포막 연구 금 표준을 고려하고,이 힘든이고, 이온 채널 측정 숙련 된 작업자를 필요로한다. 8 인위적 재구성 지질 이중층 막 이온 채널 연구 대체 공구로 부상하고 있지만, 9,10-들은 또한 수고와 연관된 프로세스 및 특정 전문 지식. 또한, 막은 기계적 교란에 취약하다. 따라서, 현재까지 도입 지질 이중층 기술은 제한된 실제 적용. (11)
지질 이중층 막, 카스텔 외. (12) 및 IDE와 야나기의 안정성과 수명을 향상시키기 위해서
지질 이중층 플랫폼의 개발은 주로 증가 견고성과 BLMs의 수명 주위에 회귀하고있다. BLMs의 수명은 스와되었지만bstantially 향상된 최근 애플리케이션 인해 수송성 및 보존성의 부족에 한정되었다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 전은 외. 저장 가능한 막 시스템을 생성하고, MP를 구성하는 막 전구체 (MP). (16)를 도입들은 3 % DPhPC (1,2- diphytanoyl- 함유 N- 데칸 헥사 데칸의 혼합물을 제조 SN의 -glycero -3- 포스파티딜콜린)는 그것이 ~ 14 ℃ (실온 이하, 일반적인 냉장고 온도 이상)에서 동결되도록 지질 용액의 빙점을 제어한다. 이 실험에서, MP는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 필름 상에 작은 구멍을 통해 분산시키고,이어서 4 ℃에서 냉장 냉동. 다용도 실온으로 기세 좋게하면 MP 해동 및 지질 이중층 자동 일반적 제막와 연관된 지식을 제거 형성 하였다. 그러나 MP에서 만든 BLM의 성공률은 ~ 27 % 및 막 상자 형성만큼 낮았다N 시간 (30 분 내지 24 시간)이었다 일관성 그 실제 응용을 제한.
이전 류에 의해보고 된 연구에서, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 박막 대신에 (a)의 제어 제조 시간과 (b) BLM 형성의 성공 확률을 높이기 위해, 종래의 소수성 박막 (PTFE, 폴리 옥시 메틸렌, 폴리스티렌)로 사용되는 등. (17) 여기에서는, 제막 인해 PDMS의 다공성 특성의 용매 추출에 의해 촉진되고, 막 형성에 필요한 시간이 성공적으로 연구를 제어 하였다. 지질 용액 PDMS 박막에 흡수되었을 때,이 시스템에서는, 일정한 막 형성 시간이 달성되었다. 또한, 멤브레인의 수명 인해 PDMS 박막 지질 용액 스쿠알렌의 첨가의 결과로 용매를 서서히 흡수 연장 하였다. 우리는이 기술을 사용하여 형성 막 내가 적합한 지 확인하기 위해 광학 및 전기 측정을 실시채널 연구에.
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Protocol
1. 솔루션 준비
- 버퍼 용액의 제조 :
- 버퍼 용액을 공식화 한 M의 KCl (염화칼륨), 10mM의 트리스 -HCl (트리스 - 히드로 클로라이드), 증류수에 1 mM의 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산)을 용해하고 8.0의 pH를 조정한다.
- 0.20 μm의 필터를 사용하여 상기 용액을 필터. 살균, 15 분 동안 121 ° C에서 상기 용액을 오토 클레이브.
- 프리 페인팅 지질 용액의 제조 :
- (w : v)로 DPhPC (1,2- diphytanoyl- SN -glycero -3- 포스파티딜콜린) 지질 사전 페인팅 지질 용액 제형이 3 %를 용해 (2)의 혼합물에 8 N -decane 및 헥사 (V : V). 회 전자를 사용하여 밤새 교반.
- 막 형성 지질 용액의 제조 :
- 0.1 % DPhPC (1,2- diphytanoyl- SN -glycero -3- 포스파티딜콜린) 지질을 용해, 막 형성 지질 용액을 공식화 (W : V) 2의 혼합물에 8 평방ualene와 헥사 (V : V). 회 전자를 사용하여 밤새 교반.
PDMS 박막의 형성 (2)
- PDMS의 예비 중합체를 형성하기 위해 믹싱 컵 1 (w / w) 비율 : 9에 PDMS와 경화제를 혼합한다. PDMS의에게 박막 (- 250 μm의 두께 200)를 형성하기 위해 페트리 접시에 PDMS 예비 중합체의 5g을 추가합니다. 박막을 형성하기 위해 10 초 동안 800 rpm에서 스핀 코터를 사용하여 PDMS 예비 중합체를 확산.
- 기포를 제거하기 위해 2 시간 동안 100 mTorr의 압력에서 진공 건조기로 페트리 접시를 배치했다. 70 ° C에서 5 시간 동안 오븐 내에서 예비 중합체 박막 베이크 중합.
- 정사각형 PDMS 박막을 만들기 위해 2 × 2cm이 사각형으로 중합 PDMS 박막을 자른다. PDMS 박막의 중심부에 구멍을 만들기 위해 500 ㎛의 마이크로 펀치를 사용한다. 8 N- 데칸 및 헥사 : 2로 혼합 3 % DPhPC 지질 솔루션을 사전 페인트 구멍.
3. 챔버 제조 및 ASSEmbly
- BLM 챔버를 제작하기 위해 4 cm X 1.5 cm × 1 cm이고, x 1.3 cm X 0.8 cm 17 1.5 cm의 내부 웰 차원의 외형 치수와 3D 드로잉 소프트웨어를 사용하여 챔버의 디자인이 대칭 블록.
- CNC 기계와 PTFE 블록을 사용하여 챔버 공예 제조업체의 지침을 따르십시오.
4. 상공 회의소 총회
- 챔버를 조립하기 위해, PTFE 두 블록 사이의 사전 - 그린 PDMS 박막 두는 PDMS 박막의 개구는 챔버 내의 홀과 정렬되도록.
- 그리스와 커버 글래스 (광 관찰을 촉진)을 사용하여 상기 챔버의 외측 가장자리를 밀봉. 볼트와 너트를 사용하여 조립 실 고정시킨다.
참고 : 어떤 액체 누출이되지 않도록 챔버는 잘 밀봉되어 있는지 확인합니다.
신속 자기 조립 형성과 막 전구체의 5 형성 (MPES)
- 피펫을 사용하여 0.5을 증착N -decane 8 : 2로 혼합하여 0.1 % DPhPC 지질 ㎕의 챔버로 조립 PDMS 박막의 개구 위에 헥사.
- 사용하는 냉동기 또는 10 ℃ 이하의 냉장고에 보관 챔버에 앞서.
6. 막 형성 및 검증
- MPES와 BLM을 형성하는 냉장고에서 실을 인출하고 상기 챔버의 각 측면에 완충 용액 2 ㎖을 정지. 냉동 막 전구체가 해동 될 때까지 <10 분 동안 따로 실을 설정합니다.
- 정확하게 광원 현미경에 대해 높이를 제어하는 미세 조작기에 챔버를 배치했다. BLM 형성 공정의 광 관찰 용 PDMS 박막의 개구를 밝게 할로겐 광섬유 일루미네이터를 사용하여 광원으로서 상기 챔버의 한면을 조명.
- 다른 측면에서, BLM 형성을 관찰하기 위해 상기 광원에 대하여 수직으로 배치 디지털 현미경 (20 확대0X).
- BLM 형성을 확인하기 위해, 색상이 고리보다 밝아진다 개구의 중심을 관찰한다.
7. 전기 녹화
- 전기 측정을 위해> 1 분 동안 차아 염소산 나트륨의 208 μm의 두께 실버 와이어와 표백제를 사용하여 자세 / CL 전극을 준비합니다. 깊이로 상기 챔버의 각 측면에 자세 / CL 전극 배치는 완충 용액에 침지한다.
- 미세 전극 앰프에 전극을 연결합니다. 전기 생리학 소프트웨어를 이용하여 구형파를 취득하는 막에 걸쳐 ± 10 MV 삼각파를 적용한다. V_clamp (MV)에 표시된 화살표를 클릭하여 전압을인가 설정합니다.
- 녹음 버튼 (빨간색 도트 아이콘)을 클릭하여 멤브레인의 전기적 특성을 기록합니다. 균일 한 사각 파가 관찰 될 때까지 녹화를 진행합니다. 검은 사각형 아이콘을 클릭하여 녹음을 종료합니다.
8. 이온 채널 설립
아니E : 조지아 지질 용액에 직접 첨가 될 때 그라 미시 딘 A (GA) 혼입는 BLM의 형성시에 자발적으로 발생한다.
- (GA) 채널의 활동을 관찰 멤브레인의 잠재력을 잡고 측정하기 위해 5 kHz의 샘플 속도에서 막에 걸쳐 100 MV를 적용합니다. V_clamp (MV)에 표시된 화살표를 클릭하여 전압을인가 설정합니다.
- 녹음 버튼 (빨간색 도트 아이콘)을 클릭하여 조지아 법인의 전기적 특성을 기록합니다. 현재 점프가 관찰 될 때까지 녹화를 진행합니다. 검은 사각형 아이콘을 클릭하여 녹음을 종료합니다.
- 전기 데이터 수집 후, 전기 생리학 소프트웨어를 사용하여 100 Hz에서 로우 패스 베셀 필터가 데이터를 필터링.
- (~, 각 전류 점프 0.15 ns의 조지아 이온 채널의 이합체를 나타냅니다) 필터 잠재적 인 데이터를 들고 현재의 도약을 준수 조지아 법인을 확인 할 수 있습니다.
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Representative Results
MPES 솔루션 구성의 최적화
지질 용매의 조성이 다른 성공적 MPES에서 지질 이중층 막을 재구성 시험 하였다. DPhPC 14 3 %를 함유하는 N- 헥사 데칸의 혼합물과의 MP 시스템 제막 (~ 27 %)의 낮은 성공률을 나타내었다. PDMS의 막이 연속적 지질 용액을 추출한 또한, 본래 지질 이중층 막을 유지하는 용매 조성물을 최적화 할 필요가 있었다. 스쿠알렌 사용한 경우 20 ° C. (19)에서 0.92 (Cp)의 점도를 갖는 대신 N- 데칸 사용한 C 18 20 ℃에서 12 (Cp)의 점도 따라서, 스쿠알렌, 안정성 및 수명 모두가로 인해 증가 PDMS에 의해 용매 흡수의 감소 속도는. 표 1은 다른 용매 조성 막의 얇아 아웃 시간, 수명 및 성공률을 비교합니다.
N- 데칸 사용한 경우, 막 형성이 일치했고 막은 종종 때문에 PDMS 박막에 의한 용매의 신속한 흡수, 단시간 파열. 스쿠알렌을 사용한 반면, 멤브레인 파열 시간이 지연되었다. 또한, 막 형성 시간이보다 일관되었다 막의 막 형성을 개선하고 수명의 성공률을 증가.
막 전구체에서 막 형성 (MP)
MP 실온에서 해동시 용이하게 사용할 지질 용액의 냉동 형태이다. A의 작은 구멍에 N- 데칸 헥사 데칸의 혼합물을 함유하는 지질 용액 박막 아래 16 ° C를 정지하고, 언 형태 무기한 보유하고 수송 인 PDMS. (1)는이 PTFE와 박막 PDMS의 조립체를 도시한다 차MP를 생산하는 mber. 사용하기 전에 PTFE 챔버는 막 형성 용 냉장고로부터 회수 하였다. 여기서, 냉동 지질 함유 용액 PDMS 박막 PTFE 챔버의 두 부분 사이에 배치 하였다. 완충 용액을이어서 실온에서 상기 챔버의 양측에 추가 될 때, 지질 이중층 막 자발적 냉동 막 전구체 (MP)의 융해에 형성.
도 2에 기술 된 바와 같이 융해시 지질 용액 씨닝. 냉동 막 전구체 해동되면 버퍼 지질 용액의 계면을 따라 두 개의 단일 층은 막 형성 후에로 연락. 20 끌려 미리 혼합 조지아 단량체 지질 용액 채널 활동을 보였다.
멤브레인의 광학 관측
광학적 막 형성을 확인하기 위해사용 투과광은 멤브레인을 시각화합니다. 막 형성시 막 인해 씨닝 프로세스 주변보다 밝게 나타나고, 개구 (막 형성의 위치)의 중심 고리보다 밝게했다.도 3은 디지털 현미경을 통해 관찰 된 막 형성을 도시한다. 멤브레인을 성공적 시닝 해동시.
지질 이중층의 전기 측정
우리는 막 두께를 계산하기 위해 증폭기를 이용하여 막에 걸쳐 전기 전류를 측정했다. 자세 / AgCl을 전극은 전기 측정을위한 두 챔버로 침수되었다. 10 MV 첨두 삼각파가 막을 가로 질러인가되었을 때, 삼각파 인해 (캐패시터로서 작용) 지질 이중층 막 특성 전류의 구형파로 전환시켰다. (21) 그 결과,이었다 멤브레인의 두께를 추정 할다음 식을 사용하여 :
I (t)는 전류를 나타내고, 여기서 C는 막에서 정전 용량을 나타냅니다. V는인가 된 피크 - 투 - 피크 전압 (0.0625 초 20 MV)을 나타냅니다. 여기서, C는와 자유 공간 (8.85 × 10 12 F / m 2), 지질의 유전 상수 (2.1), 22 A, 멤브레인의 영역 (~ 1.29 X 10-7 m의 유전율을 나타낼 수있다 2) D, 이중층의 두께. 도 3 및 전기적 데이터를 광학 데이터 우리 ~ 4 nm 인 것으로 멤브레인의 두께를 계산 하였다. 또한, 재구성 된 멤브레인은 일반적으로 이온 채널 연구에 요구되는 기가 옴 레벨 씰 (> 1 GΩ)을 만족시켰다. 23
그라 미시 딘 (A)의 이온 채널 활동 (GA)
다용도로 형성 지질 이중층과 이온 채널 선별 가능성을 확인하기 위해 조지아, 제막을 검증을 위해 가장 자주 사용되는 이온 채널 중 하나가 포함된다. 그라 미시 딘 A는 7 이온 채널 형태의 Ga 이합체시. 이후 이량 두 가지 서브 유닛과 막으로 통합하고, 이온은 조지아 이온 채널을 통해 침투. (4) 법인과의 Ga 이합체를 보여줍니다. 조지아 이합체시 (GA) 채널 전도도 수준은 이전 보고서의 결과와 일치 28 피코이었다. (3)
| 지질 농도 | 용제 | 대머리 아웃 시간 (분) | 수명 (분) | 성공률 |
| 0.1 % | 이: 8 스쿠알렌 : 헥사 데칸 | 50.6 (30.9 ~ ±) | 52.4 (30.9 ~ ±) | 77.8 % |
| 0.1 % | 2 : 8 n 개의 -decane : 헥사 데칸 | 13.2 (12.3 ±) | 10.8 (7.8 ±) | 75.2 % |
| 1% | 2 : 8 n 개의 -decane : 헥사 데칸 | 15.8 (8.8 ±) | 26.2 (25.3 ~ ±) | 69.3 % |
| 1% | 2 : 8 n 개의 -decane : 헥사 데칸 | 13.8 (13.3 ±) | 23.6 (30.1 ~ ±) | 55.6 % |
| 1% | 2 : 8 n 개의 -decane : 헥사 데칸 | 13.6 (10.3 ±) | 8.9 (3.0 ±) | 50.0 % |
MPES 용액 조성물 표 1. 최적화. 지질 용액 0.5 μL은 PDMS 박막 개구 (500 μm의 직경)에 현탁시켰다. 여기서 우리는 지질 농도, 용매의 조성 및 미리 그림을 변화. 17. 류, H. 등의 허가 적응. (7)
제막 장치의도 1 개략도. 챔버의 각각 절반의 외형 4 cm X 1.5 cm × 1 cm이고, 상기 내부 웰의 크기는 1.5 cm X 1.3 cm가 X 0.8 cm였다. 내부 웰 완충액 2 ㎖를 수용 할만큼 충분히 크다. 각 PTFE 블록에 완충 용액으로 PDMS 박막 접촉을하는 구멍이 있었다. 다른쪽에는 BLM의 광 관찰 용의 커버 유리로 밀봉 하였다. 마지막으로, 상기 챔버 차단은 액체의 누출을 피하기 위해 볼트와 너트에 의해 보강 하였다.4258 / 54258fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
박막 조리개가 무기한 동결 할 수있는 PDMS에 신속 자기 조립 (MPES) 형성. 지질 용액을 냉동 막 전구체 그림 2. 개략도. 냉동 막 전구체 녹여 실온하게되었을 때, 지질 이중층 형성 인해 PDMS 박막으로 소수성 용매 추출 용이하게된다. 조지아 단량체 직접 지질 용액에 첨가 한 바와 같이, 막 형성 직후 형성 조지아 이온 채널. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
= "/ 파일 / ftp_upload / 54258 / 54258fig3.jpg"/>
도 3 시닝 아웃 처리 현미경도. MPES 소수성 용매의 후속 흡수 해동시는 씨닝 처리는 PDMS 박막의 개구에 용이하게하고, 상기 멤브레인은 해동 후 2 분 이내에 형성된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그램이시 딘 A. 현재의 통합에 따라 그림 4. 전기 측정은 막에 통합과의 Ga 이합체가 도시에 이동합니다. ~ 28 P의 진폭은 (잠재적 들고 100 MV 100 Hz에서 베셀 저역 통과 필터) 조지아 단량체의 이합체에 관찰되었다.rget = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534----------K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
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