Abstract
ラジオ対応のデジタル電子機器の上昇は、飛行中の昆虫の行動を研究するための小型無線神経筋レコーダーや刺激物質の使用を促してきました。この技術は、このプロトコルで説明住む昆虫プラットフォームを用いて、昆虫・マシン・ハイブリッドシステムの開発を可能にします。また、このプロトコルは、システム構成や命綱をつけ昆虫における飛翔筋の機能を評価するための自由飛行実験手順を説明します。デモンストレーションのために、私たちは飛んでカブトムシの左または右回転を制御し、達成するための第三の腋窩骨片(3AX)筋肉をターゲットに。細い銀線電極は、カブトムシの各側の3AX筋に移植しました。これらは、甲虫の前胸背板に取り付けられた。無線バックパック( すなわち 、神経筋電気刺激装置)の出力に接続されていました筋肉は、(左または右)の刺激の側を交互にまたはstimulatioを変えることによって自由飛行で刺激しました。n個の周波数。カブトムシは、筋肉が刺激されたときに同側になって、周波数の増加に段階的な応答を示しました。注入プロセスおよび3次元モーションキャプチャカメラシステムの容積キャリブレーションは、それぞれ、筋肉を損傷し、マーカの追跡が失われないように注意して行う必要があります。それは自由飛行に関心の飛翔筋の機能を明らかにするのに役立つように、この方法は、昆虫の飛行を研究するために非常に有益です。
Protocol
1.研究動物
- リア個々Mecynorrhinaのtorquataカブトムシ木質ペレット寝具付きの独立したプラスチック容器(6センチ、8グラム)。
- 3日毎に各カブトムシに砂糖ゼリー(12ミリリットル)のカップをフィード。
- それぞれ、25℃、60%で飼育室の温度と湿度を保ちます。
- 細線電極を埋め込む前に、各カブトムシの飛行能力をテストします。
- 静かに空気中にカブトムシを投げます。カブトムシが5回連続試験のために10秒より長く飛ぶことができる場合は、カブトムシは、通常の飛行能力を有しており、その後の飛行実験のためにそれを使用すると結論付けています。カブトムシを奪還するために、それは暗い作るために部屋内のすべてのライトをオフにします。これは飛行を終了するカブトムシの原因となります。
注:カブトムシは自然に空気中に放出されたときに離れて飛行することから始まります。 図1(16×8×4メートルに示すように、大きな密室で飛行実験を行う方が良いです3のモーションキャプチャ空間のp> 3)、。
- 静かに空気中にカブトムシを投げます。カブトムシが5回連続試験のために10秒より長く飛ぶことができる場合は、カブトムシは、通常の飛行能力を有しており、その後の飛行実験のためにそれを使用すると結論付けています。カブトムシを奪還するために、それは暗い作るために部屋内のすべてのライトをオフにします。これは飛行を終了するカブトムシの原因となります。
2.電極注入
- 1分13,16,20-24のためにCO 2を充填したプラスチック容器に置くことでカブトムシを麻酔。
- 10秒間お湯の中に浸漬することにより、歯科用ワックスを軟化させます。木製のブロックに麻酔カブトムシを配置し、軟化した歯科用ワックスでそれを固定化します。歯科用ワックスは自然に冷却し、数分以内に固化します。
- 25ミリメートルの長さに切断絶縁銀線(127μmの裸の直径、パーフルオロアルコキシでコーティングされた178μmの直径)は、移植のためのような細いワイヤ電極を使用します。
- 各ワイヤの両端に絶縁体を燃えることにより、裸の銀の3ミリメートルを公開します。
- SMAを作成するために、先の細いハサミを使用して、カブトムシのキューティクルの表面を分析metepisternum( 図2c)で約4×4mmのLLウィンドウ。注意:ソフト茶色のキューティクルは、次に露出させ、 図2cに示すように- 電子 。 3AXの筋肉が柔らかいキューティクルの下に位置しています。
- ピアス二つの穴( 図2d)との間に2mmの距離で虫ピン(サイズ00)を用いて露光茶色のキューティクルの2つの穴。
- 慎重に貫通孔(ステップ2.4で調製した一つの活性と1つの戻り電極を含む)は、2つのワイヤ電極を挿入し、3ミリメートルの深さで各3AX筋にそれらを移植。
- 移植された電極を固定し、穴に溶融した蜜蝋をドロップすることにより、接触および短絡を回避するために、場所でそれらを保持します。必要に応じて、ホットはんだごての先端で蜜蝋に触れることでキューティクルの上に蜜蝋をリフロー。蜜蝋はすぐに固化し、移植を強化します。
注:移植が正しいかどうかを確認するには、ビートの鞘ばねルは、電気刺激時3AXの筋肉の動きを観察するために持ち上げることができます。
3.ワイヤレスバックパックアセンブリ
注:バックパックは、内蔵の無線マイクロコントローラ4階層FR-4基板上(1.6×1.6 cm 2)とから構成されていました。バックパックは、リチウムポリマーマイクロ電池(3.7 V、350 mgの、10ミリアンペア時)によるものでした。電池を含むバックパックの総質量は、甲虫(10gの体重の30%)のペイロード容量未満で1.2±0.26 gでした。バックパックは、無線通信を受信するように予めプログラムと2つの出力チャネルを有していました。
- 両面テープを使用して(キューティクル上のワックス層を除去)前胸背板の表面を清掃してください。そして、両面テープの切れ端でカブトムシの前胸背板にバックパックを取り付けます。
- バックパックの出力に注入された電極の両端を接続します。
- foのマーカーを生成するためにマイクロバッテリの周囲に再帰反射テープを包みますRモーションキャプチャカメラが検出します。
- 再帰反射テープは、モーションキャプチャカメラによって検出することができるように、両面テープの一片を用いてバックパックの上部にマイクロ電池を取り付けます。
4.ワイヤレス制御システム
注:この場合には、用語の無線制御システムは、カスタム飛行制御ソフトウェアを実行するためのリモートコントローラ、ラップトップコンピュータ、ベースステーション、バックパック、およびモーションキャプチャシステムのための受信機を含みます。
- USBポートを介してラップトップコンピュータにリモートコントローラの基地局と受信機を接続します。
- モーションキャプチャシステムに切り替えて、イーサネットポートを介してラップトップコンピュータに接続します。
- 完全にモーションキャプチャ空間をカバーする(モーションキャプチャシステムのベンダー会社によって提供される)較正杖を振ることによって体積較正を実行します。
- ノートパソコンのデスクトップからモーションキャプチャソフトウェアを開きます。クリックして、DRAGは、「リソース」パネルの「システム」メニューのすべてのカメラを選択します。
- 「3D視点」メニューをクリックし、カメラのビューに変更する「カメラ」を選択します。キャリブレーションの設定を表示するには、「ツール」パネルの「カメラ」タブをクリックします。カメラからのノイズを除去する「カメラのマスクを作成」メニューの「スタート」をクリックして、ノイズが青色でマスクされた後、次に「停止」。
- 「カメラ」タブの「ワンド」メニューと「L-フレーム "メニューから" 5マーカーワンド&L-フレーム」をクリックして選択します。 2500に「ワンドカウント」を設定し、「キャリブレーションカメラ」メニューの「スタート」をクリックし、全体のモーションキャプチャ空間を介してキャリブレーション杖を振ります。ワンド数が2,500に達したときに、キャリブレーションプロセスが停止します。
- (「ツール」パネルの「カメラ」タブの下部にある)画像の誤差が0.3 Fよりも高い場合には、キャリブレーションプロセスを繰り返しまたは任意のカメラ。キャリブレーション後、モーションキャプチャ空間の中央に床の上に杖を入れて、モーションキャプチャ空間の原点を設定するには、「ボリュームセットの原点」メニューの「スタート」をクリックします。
- モーションキャプチャ空間内でユーザが手を振ったマーカーの移動経路を記録し、マーカが検出され、追跡されているかどうかを確認するために、ダミー試験を使用してモーションキャプチャシステムのカバレッジを確認します。マーカーが頻繁に検出中に失われた場合、ダミーテストが成功するまで、ボリュームのキャリブレーションを繰り返します。
- 「ツール」パネルの「キャプチャ」タブをクリックし、その軌跡を記録するために、全体のモーションキャプチャ空間を介して、サンプルマーカーを振って前に「キャプチャ」メニューの「スタート」。
- 記録した後、マーカーの位置を再構築し、記録の品質をチェックするために「再構築パイプラインを実行」をクリックしてください。
- がMicroBの端子を接続しますバックパックの電源ピンにattery(ステップ3.4でバックパックに取り付けられています)。
- ラップトップおよびカスタム飛行制御ソフトウェアを使用して、バックパックとの間の無線通信をテストします。ソフトウェアの「スタート」コマンドをクリックして、表示された接続状態を確認してください。
5.無料飛行実験
- 16×8×4メートル3を測定する飛行の分野で自由飛行実験を行います。
- 入力飛行制御ソフトウェア(電圧、パルス幅、周波数、および刺激期間)に適切なパラメータ。注:デモのために、我々は3ミリ秒に、3 Vにパルス幅を電圧を固定し、刺激の持続時間1秒に、60から100 Hzの周波数を変化させます。
- ソフトウェアの画面で、「パルス幅」ボックスで3ミリ秒のための "刺激期間」ボックス、3、および「中ヘルツで所望の周波数で千ミリ秒のための「電圧」ボックス、千の3 Vのためのタイプ3周波数「ボックスOnはコマンドウィンドウ。
- それは飛行アリーナ内で自由に飛ぶことができるように空気中にバックパックに取り付けられた甲虫をリリース。甲虫は、モーションキャプチャ空間に入ったときに手動で刺激をトリガします。押して、適切なコマンドボタン(左または右)リモコンの甲虫の左側または右側にターゲットの筋肉を刺激します。
注:ボタンが押されると、ラップトップ上で実行されている飛行制御ソフトウェアは、コマンドを生成し、バックパックに送信します。バックパックは、その後、(左側または右側に)興味のある筋肉に電気刺激を出力します。 - 刺激中にリアルタイムでカブトムシの反応を観察し、3Dグラフのソフトウェアを使用してデータを再構築します。
- 「ビートル表示」ウィンドウのデータリストに記録された試験のいずれかを選択し、分析フォルダにその試験のデータをコピーして、3次元グラフモジュールを実行するには、「エクスポートパンダ」をクリックします。
- 押して「N」記録された軌道に刺激信号を結合するキーボード。私が強調表示された刺激期間とカブトムシの軌跡を表示するプレス。
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Representative Results
電極の移植手順は、 図2に示されているシン・銀線電極を筋肉( 図2dの - E)のソフトキューティクルに穴を開け、小さな穴を通してカブトムシの3AX筋に移植しました。このソフトキューティクルはmetepisternum( - C 図2D)の前方部分を除去した後、ちょうどbasalar筋肉の内突起の上に発見されました。電極はその後、蜜蝋( 図2F)を用いて固定しました。
図3は、無傷の甲虫を用いて昆虫マシンハイブリッドシステムを構築するための手順を示し、図2および図 (例えば、 図2の関心対象の筋肉に金属細線(刺激電極)を移植するための方法を示す3bは 、3AX筋この研究において使用した)とカブトムシの前胸背板にバックパックを取り付けます。配線の自由端は、電気的にバックパック( 図3c)上に集積マイクロコントローラの入力/出力ピンに接続されたバックパック上のジャンパコネクタの穴に挿入しました。最後に、マイクロバッテリを装着したとマイクロバッテリの電源ケーブルは、マイクロコントローラのグランドと正電源端子につながるジャンパコネクタの穴に接続されていました。
無線制御システムは、図4に示されている。ユーザは、リモートコントローラ( 図4C)上のコマンドボタンを押下すると、ラップトップコンピュータ( 図4d)における飛行制御ソフトウェアが生成して無線基地介してバックパックにコマンドを送信しますステーション( 図4b)。モーションキャプチャシステム( 図4e)は、ビートの位置(X、Y、およびZ)を検出しますルとタイムスタンプとそれをマークします。このデータは、ラップトップコンピュータに供給され、飛行制御ソフトウェアは、刺激信号でデータを同期させます。
代表的な旋回制御結果を図5に示す。3AX筋の活性化は、このように自由飛行で同側のターンを行う甲虫その結果、同側13の翼ビート振幅の低下を引き起こすことが見出されました。左または右3AX筋が13を刺激したときにカブトムシが同側に回すよう3AX筋の電気刺激は、同様の効果を示しました。甲虫の回転速度は、刺激周波数の関数として等級付けしました。
図1:フリーフライトアリーナ配置は自由飛行の分野を中に配置し、二つの部分:制御空間(×4 m 3の3.5×8)が、一方、モーションキャプチャ空間(移植キット(顕微鏡及び解剖ツール)と制御ブース(コンピュータ、無線基地局、及びカメラ制御)を設定するために使用しました。 12.5×4×8 m 3での )甲虫の位置(X、Y、およびZ)を記録するために、近赤外カメラ20で覆われていました。飛行アリーナは、実験中の昼間の条件として、それはのように明るくするために30照明パネル(60×60 cm 2で、48 W)を装備していた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2:電極の移植のための手順は、カブトムシを麻酔し、移植手術のために木製のブロックに歯科用ワックスで固定しました。 ( - <強い> c)の小さなウィンドウが3AX筋にアクセスするためのカブトムシのmetepisternumにオープンしました。虫ピンを使用した(d)は 、2ミリメートルの距離を持つ2つの穴が3AXの筋肉を担う内部キューティクルに穴を開けました。 (E)電極がこれらの孔を介して筋肉に挿入され、クロストークが先端間発生していないことを確実にするためにピンセットを用いて所定の位置に保持しました。 (F - グラム )。電極はその後、蜜蝋を使ってカブトムシに固定されたが、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3: 無傷のカブトムシを用いて、昆虫・マシン・ハイブリッドシステムを生成する手順 (a)は、生きている甲虫の利息の筋肉がウィットを移植しました。銀ワイヤ電極のHAペア。 (b)はミツロウで電極を固定した後、我々は、両面テープを使用して、甲虫の前胸背板にバックパックを取り付けられました。 (c)は 、電極の自由端は、バックパックの出力に挿入されmicropinヘッダで固定しました。 (d)に再帰反射テープで覆われていたマイクロバッテリは、両面テープを使用してバックパックに装着され、バックパックの電源ピンに接続されていた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4: 自由飛行実験用無線システムは、無線システムは、(a)はサイボーグカブトムシ、(b)は 、無線基地局、(Cで構成されてい、(d)の Bluetoothレシーバーで動作するノートPCは電源に接続、および(e)3Dモーションキャプチャシステム。ユーザーがリモート上のコマンドボタンを押すと、ラップトップ上のカスタム飛行制御ソフトウェアは、USBポート経由でノートPCに接続されている基地局を介してサイボーグビートルにワイヤレスで刺激コマンドを送信します。バックパックは、コマンドを受信すると、それは、筋肉を刺激する電気刺激信号を生成します。同時に、モーションキャプチャシステムは、3Dは、カブトムシの座標と刺激データとの同期のためのラップトップに供給する記録している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5:beetl の挙動E(a)は、カブトムシが左または右3AXの筋肉が刺激されたときに同側に転じた。フリーフライトで3AX筋の電気刺激により、旋回運動が刺激周波数の関数として等級付けしました。 (b)の左または右3AXの筋肉が順番に刺激された飛行カブトムシのジグザグパス。刺激パラメータは、3 Vの振幅、3ミリ秒のパルス幅、および60から100ヘルツの周波数であった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6(a) の 3つのマーカーを使用して甲虫構成の三次元姿勢(ロール、ピッチ、ヨー)を追跡するための提案されたマーカーセット 、(B)は、4つのマーカー、および(c)の 5マーカー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
それは、実験の信頼性に影響を与えるような注入プロセスは、重要です。電極は、(近くの筋肉との接触を回避する)甲虫のサイズに応じて、3mm以下の深さで筋肉に挿入する必要があります。電極は近くの筋肉をタッチすると、望ましくないモータの行動や行動は、近くの筋肉の収縮により発生する可能性があります。 2つの電極はよくない短絡が発生しないことを確実にするために整列されるべきです。溶融はんだごてを使用して蜜蝋をリフローすると、実験者は注意が必要と筋肉が筋肉の故障につながる、高温と長時間接触することによって燃焼させることができるので、可能な限り迅速にはんだ付けする必要があります。キューティクルを除去すること3AX筋にアクセスするために必要であるが、挿入および封止プロセスは、1分未満をとり、筋肉へのダメージを最小限にするために管理されていました。昆虫は、実験後の飼育室に戻したし、生存可能性3カ月以上(自分の人生の時間の終わり)まで。カブトムシの良好なパフォーマンスを維持するために、カブトムシ、昆虫など、すべての20の連続した試験では多くの連続(40〜50)の飛行試験後に疲労になることができると開くことができない場合があります後に供給され、3〜4時間放置されるべきです羽。
それは、軌道追従の精度に影響を与えるように自由飛行実験用として、モーションキャプチャシステムの容積較正が必要です。動き追跡システムの精度を維持するために、カメラの全てについて0.3未満の画像エラーで較正ワンドの波の完全なカメラの視野を満たすことが重要です。また、マーカーの表面は清潔であるべきである、または3次元モーションキャプチャシステムは、頻繁にマーカーを逃すことができます。較正の後、ダミーのテストは、モーションキャプチャシステムのカバレッジをチェックするために定義されたボリュームに再帰反射テープで包まれた電池を振ることによって実施されるべきです。試験のためにモーショントラッキングの精度が、我々は、飛行分野で動く二つのマーカーの距離を測定しました。マーカーは、互いに200ミリの間隔でカートンボードに固定しました。ボードには、二つのマーカーの様々な位置を得るために、全体の飛行アリーナに移動させました。標準偏差は、その後、1.3ミリ(N = 3,000)と計算されました。
自由飛行試験設備( 図1および図 4)私たちは、タイムスタンプと一緒に飛んでいる昆虫の位置(X、Y、およびZ)を追跡することができます。単一のマーカーは甲虫に取り付けられ、3次元モーションキャプチャシステムは、唯一のそのマーカーを検出するため、甲虫は、粒子または質点として扱われます。このように、飛んでカブトムシからのデータは、位置情報を持っていますが、方向性を欠いています。したがって、カブトムシの位置データから、運動学的分析は、X、Yに沿ってのみ並進速度と加速度を提供し、そしてZは、角速度または角加速度でなし軸ヨー、ピッチ、およびロール軸周りの回転。甲虫に固定された複数のマーカー剛体と記録回転及び並進データとして飛翔昆虫を治療するために、3次元モーションキャプチャシステムに使用されなければならない(例えば、 図6に示すように)。マーカーは、テープの小片ではなく、最小追跡損失でカメラシステムによって検出されるのに十分大きい必要があるのでしかし、実験者は、飛行カブトムシの動態にこれらのマーカーの寄与のメモを取る必要があります。このような構成と複数のマーカの付着が著しく、その質量及び慣性25のモーメントを増大させることができます。また、飛行アリーナのサイズは、甲虫の自由飛行動作に制約を減らすために、動き追跡システムのカバレッジ範囲内でできるだけ大きく設定することができます。この論文では、飛行アリーナのサイズは、モーションキャプチャシステム(12.5×8×4メートル3)の最大カバレッジに基づいて定義されています。
、例えば 、さまざまな動作を生成することができます。、同側のターン13のための反対側のターン7と3AX筋のためのbasalar筋肉を。また、昆虫の神経系の特定の部分は、様々な反応を誘導することができます。アンテナの刺激が歩行昆虫12に反対転換を誘導することができるのに対し、視葉刺激は、飛行開始7を誘導することができます。さらに、我々はその自然な行動3,26の間に昆虫の活動を記録するために電レコーダーに電気刺激であることから、バックパックの機能を変更することができます。
カブトムシの自由飛行の刺激はenabliによって3AX筋の自然な機能を明らかにし、確認するのに役立ちました昆虫が自由に空気中の移動の瞬間反応のngの観測。このような情報は、係留条件11,13,27-30の下では使用できません。昆虫の挙動は、係留条件下で拘束され、おそらく昆虫の行動の誤った理解につながる自由飛行中のものと異なっていてもよいです。したがって、この技術を使用して自由飛行刺激は係留実験から引き出された仮説を検証するための強力なツールです。また、昆虫マシンハイブリッドシステムは、現在の人工は、機関車の能力と消費電力13,17,31,32の点でロボットを羽ばたきよりも優れています。
昆虫機械ハイブリッドシステムは、それらが複雑であり、柔軟な構造を継承し、将来人工ロボットを交換し、生きている昆虫の機関車の能力と製造プロセスの製造時間を短縮することができます。様々な機関車の機能は、より多くを動作させるために昆虫・マシン・ハイブリッドシステムを助けることができます効率的に救助任務でウォーキングや飛行の組み合わせを伴う制約スペース、 例えば 、インチ自然の昆虫コロニーに溶け込むことができ、それらの活動を制御するのに役立つことができるように加えて、昆虫機械ハイブリッドシステムは、潜在的に農業害虫の制御のためのツールとして使用することができます。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mecynorrhina torquata beetle | Kingdom of Beetle Taiwan | 10 g, 8 cm, pay load capacity is 30% of the body mass Aproval of importing and using by Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore (AVA; HS code: 01069000, product code: ALV002). |
|
Wireless backpack stimulator | Custom | TI CC2431 micocontroler The board is custom made based on the GINA board from Prof. Kris Pister’s lab. The layout of GINA board can be found at https://openwsn.atlassian.net/wiki/display/OW/GINA |
|
Wii Remote control | Nintendo | Bluetooth remote control to send the command to the operator laptop | |
BeetleCommander v1.8 | Custom. Maharbiz group at UC Berkeley and Sato group at NTU | Establish the wireless communication of the backpack and the operator laptop. Configure the stimulus parameters and log the positional data. Visualize the flight data. | |
GINA base station | Kris Pister group at UC Berkeley | TI MSP430F2618 and AT86RF231 | |
Motion capture system | VICON | T160 | 8 cameras for a flight arena of 12.5 m x 8 m x 4 m |
Motion capture system | VICON | T40s | 12 cameras for a flight arena of 12.5 x 8 x 4 m |
Micro battery | Fullriver | 201013HS10C | 3.7V, 10 mAh |
Retro reflective tape | Reflexite | V92-1549-010150 | V92 reflective tape, silver color |
PFA-Insulated Silver Wire | A-M systems | 786000 | 127 µm bare, 177.8 µm coated, 3 mm bare silver flame exposed at tips |
SMT Micro Header | SAMTEC | FTSH-110-01-L-DV | 0.3 mm x 6 mm, bend to make a 3 mm long slider to secure the electrode into the PCB header. |
Beeswax | Secure the electrodes | ||
Dental Wax | Vertex | Immobilize the beetle | |
Insect pin | ROBOZ | RS-6082-30 | Size 00; 0.3 mm Rod diameter; 0.03 mm tip width; 38 mm Length Make electrode guiding holes on cuticle |
Tweezers | DUMONT | RS-5015 | Pattern #5; .05 mm x .01 mm Tip Size; 110 mm Length Dissecting and implantation |
Scissors | ROBOZ | RS-5620 | Vannas Micro Dissecting Spring Scissors; Straight; 3mm Cutting Edge; 0.1 mm Tip Width; 3" Overall Length Dissecting and implantation |
Potable soldering iron | DAIYO | DS241 | Reflow beeswax |
Hotplate | CORNING | PC-400D | Melting beeswax and dental wax |
Flourescent lamp | Philips | TL5 14W | Light the entire flight arena with 30 panels (60 x 60 cm2). Each panel has 3 lamps. 14 W, 549 mm x 17 mm |
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