-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

Resumen

Se detallan los protocolos para el cultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), la transfección transitoria de marcadores de crecimiento de microtúbulos marcados con fluorescencia, la obtención de imágenes de células vivas y el análisis automatizado de la dinámica de crecimiento de microtúbulos en interfase.

Resumen

El proceso fisiológico por el cual se forma una nueva vasculatura a partir de la vasculatura existente requiere eventos de señalización específicos que desencadenan cambios morfológicos dentro de las células endoteliales (EC) individuales. Estos procesos son críticos para el mantenimiento homeostático, como la cicatrización de heridas, y también son cruciales para promover el crecimiento tumoral y la metástasis. La morfología de la CE se define por la organización del citoesqueleto, un sistema estrechamente regulado de dinámica de actina y microtúbulos (MT) que se sabe que controla la ramificación, la polaridad y la migración direccional de la CE, componentes esenciales de la angiogénesis. Para estudiar la dinámica de la MT, utilizamos microscopía de fluorescencia de alta resolución junto con el análisis computacional de imágenes de los extremos positivos de la MT marcados con fluorescencia para investigar la dinámica de crecimiento de la MT y la regulación de la morfología de la ramificación de la CE y la migración direccional. Se realizaron imágenes de lapso de tiempo de células endoteliales de vena umbilical humana vivas (HUVEC) después de la transfección con construcciones de ADNc específicas de la proteína de unión al extremo MT (EB3) y la cinesina asociada al centrómero mitótico (MCAK) marcadas con fluorescencia para evaluar los efectos sobre la dinámica de la MT. Se utilizó el software PlusTipTracker para realizar un seguimiento de los extremos positivos de la TA marcados con EB3 con el fin de medir las velocidades de crecimiento de la TA y la vida útil del crecimiento de la TA en imágenes de lapso de tiempo. Esta metodología permite el estudio de la dinámica de la MT y la identificación de cómo la regulación localizada de la dinámica de la MT dentro de las regiones subcelulares contribuye a los procesos angiogénicos de ramificación y migración de la EC.

Introducción

La angiogénesis es disparado por señales extracelulares de señalización que promueven las células endoteliales (ECS) para polarizar, migrar con especificidad direccional, y formar nuevos vasos en los tejidos que requieren suministro de sangre. Los factores que contribuyen pensado para impulsar la angiogénesis son señales de la matriz extracelular (ECM). En respuesta a las señales físicas, EC extender nuevas ramas con especificidad de dirección para guiar el movimiento direccional en la formación de la red vascular ^1,2. La arquitectura de la morfología CE y ramificación se define por la regulación localizada de los microtúbulos del citoesqueleto (MT), de manera que se coordina con la regulación de la contractilidad acto-miosina ^3. A fin de que las ramas de la CE para formar, miosina-II debe ser regulado por disminución a nivel local, lo que resulta en protuberancias localizadas membrana ^4. Al mismo tiempo y en la misma ubicación dentro de la célula, la dinámica de crecimiento MT quedar modificado resultante en el crecimiento MT lenta y persistente para promover Elon ramagación y la estabilidad ^5. Esta regulación del citoesqueleto coordinado permite EC polarizar su morfología para facilitar la migración direccional.

El desarrollo de una morfología celular polarizada requiere montaje MT ⁶ polarizada. En la migración de las células epiteliales, MT crecen lentamente y persistentemente específicamente en el borde delantero de la célula ^7-9; mientras que en las neuronas, la iniciación y la elongación de los axones o dendritas requiere que los MTs son no sólo está presente, pero que están sufriendo de forma dinámica los procesos de montaje y desmontaje ^10-15. De esta manera, el control localizado de la dinámica de crecimiento MT determina la arquitectura de la célula y permite una rápida remodelación de la morfología celular como ECs navegar a través de su ECM.

MT dinámica de crecimiento están regulados por las familias de proteínas motoras moleculares y las proteínas no motores, denominados microtúbulos proteínas asociadas a los microtúbulos o Interactuando Proteínas (de ahora en adelante referred como MAP). Los mapas pueden ser activados o inactivados localmente, normalmente a través de cascadas iniciadas en la interfase célula-ECM ^16,17 señalización. Una vez activa la función, mapas por la unión a la MT y la alteración de la cinética de montaje y desmontaje MT; que funciona de esta manera para regular la dinámica de MT local con el fin de promover la forma de la célula y la polaridad ^18-20. Mitótico Centrómero Asociada Kinesin (MCAK) es un mapa de la familia Kinesin-13 que se une a los extremos y las parejas de hidrólisis de ATP para el desmontaje MT MT ^21-23. Este papel funcional de MCAK es conocido por ser crítico dentro de la mitótico husillo ^{24 a 28,} así como durante la interfase ^29,30. Dentro de interfase EC, desmontaje MT MCAK mediada está regulada por Aurora-A fosforilación inducida localizada de MCAK en respuesta a la herida de punta inducida por la activación de la pequeña GTPasa Rac1. El resultado de esta cascada de señalización es la inhibición de MCAK en el borde delantero de la EC, lo que resulta en el crecimiento polarizado hacia el MT leading borde y desmontaje MT MCAK inducida en el borde de salida de la migración de las CE ^31.

Las metodologías tradicionales para medir la dinámica del crecimiento MT han usado típicamente seguimiento mano de cualquiera de tubulina marcado con fluorescencia o, más recientemente, con la etiqueta fluorescente de unión a proteínas MT End 1 o 3 (EB 1 o EB3, respectivamente). El enfoque de la tubulina fluorescente tiene la ventaja de etiquetado de toda la matriz MT. Sin embargo, debido a que la mayoría de los tipos de células mitóticas mantener una matriz radial de MTs durante la interfase ^8,32,33, MTs cerca del centrosoma son muy densos, y como resultado, el seguimiento del crecimiento MT y desmontaje con la tubulina fluorescente se limita generalmente a la periférica regiones de la célula. Debido a estas limitaciones, la utilización de proteínas de EB fluorescentemente marcado (EB1 o EB3) ha sido el enfoque más común para medir la dinámica de MT. Debido a que los EB única etiqueta que crecen más los fines de MTs, aparecen como pequeños (1-3 micras), con fluorescencia brillante vienents, proporcionando así un marcador fácilmente discernible de la polimerización MT con muy limitada fluorescencia de fondo ^34-37. Si bien el hecho de que EBs etiqueta sólo un subconjunto de la matriz MT representa una fuerza importante del enfoque de EB, también destaca una limitación importante, que los MTs de no crecimiento no están etiquetados por el enfoque de EB3. Sin embargo, la capacidad de medir y realizar un seguimiento de los cometas EB3 en el tiempo y para visualizar el crecimiento MT dentro de las regiones subcelulares que este enfoque sea ideal para aplicaciones que requieren una evaluación regional de la organización MT.

Otra limitación crítica de las metodologías tradicionales para la medición dinámica de crecimiento MT ha sido muy grandes conjuntos de datos y el tiempo requerido para el análisis de datos. Esta limitación se debe a la necesidad de mano de seguimiento de cientos de cometas EB en alta resolución en el tiempo. Por otra parte, estas mediciones deben realizarse en un número estadísticamente significativo de células y también realizada bajo una variedad de control y EXPERIMENTAL condiciones. Recientemente, estas limitaciones han sido superadas a través de técnicas computacionales de análisis dirigidos específicamente a los cometas de seguimiento EB3 usando microscopía de lapso de tiempo en las células vivas ^35. Cuando se usa apropiadamente, este enfoque computacional sirve tanto para restringir el potencial de error humano asociado con la mano de seguimiento, además de proporcionar un método de alto rendimiento de la medición de la polimerización MT. Análisis computacional de dinámica de MT utilizando el paquete de software basado en MatLab, plusTipTracker, permite mediciones de crecimiento MT mediante el seguimiento de los cometas fluorescente marcada EB3 ^5,31,35,38. Además, el software plusTipTracker permite cálculos de eventos catastróficos MT (aka desmontaje) en base a la desaparición de los cometas EB3 dentro de una pista TA cada vez mayor, y permite el análisis subcelular (también conocido como regional) de la dinámica de crecimiento MT dentro de las regiones definidas por el usuario de interés . Para nuestros estudios, la dinámica de crecimiento MT se compararon dentroregiones ramificados contra regiones no ramificados, o dentro de líder frente a los bordes de salida celulares. La salida de datos de software plusTipTracker también se puede utilizar para generar superposiciones de pista con código de color para las células individuales y regiones sub-celulares.

A continuación se describe la metodología utilizada para investigar el papel de MCAK en la modulación de la dinámica de crecimiento MT y la contribución de este despolimerasa MT a la regulación de la CE, la morfología y la migración direccional de ramificación. Nuestro enfoque utiliza una línea primaria humana celular, las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que son fácilmente cultivadas y altamente susceptible a la electroporación inducida, la transfección transitoria de ADNc de plásmido. A continuación, utiliza de alta resolución, lapso de tiempo microscopía de fluorescencia de HUVEC transfectadas con MT Fin de unión a proteínas 3 (EB3) y cDNA específico de mitótico Centrómero Asociada Kinesin (MCAK) construye para evaluar los efectos sobre la dinámica de MT transfectaron células HUVEC. análisis de imagen computacional basado en PlusTipTracker de EB3MT marcado con más extremos era para medir las velocidades de crecimiento MT y MT tiempos de vida de crecimiento en imágenes con lapso de tiempo, para medir y comparar los efectos de las manipulaciones experimentales sobre la dinámica de crecimiento MT. Esta metodología permite el estudio de la dinámica de MT y la identificación de cómo la regulación localizada de la dinámica de MT dentro de las regiones sub-celulares contribuye a los procesos angiogénicos de CE de ramificación y la migración. Estas técnicas son aplicables a las investigaciones de cualquier mapa que puede ser marcado con fluorescencia y se expresó en células vivas.

Protocolo

1. HUVEC cultura y Mantenimiento

1. Preparar medio basal endotelial completa añadiendo todo el contenido del paquete de crecimiento de las células endoteliales suplemento de medio y 5% de mezcla de antibióticos penicilina / estreptomicina al fenol medio basal endotelial libre de rojo (ver Materiales / Lista de Equipo para más detalles). medio caliente completa endotelial basal a 37 ° C en un baño de agua.
2. Retire una criovial HUVEC del almacenamiento en nitrógeno líquido y descongelar rápidamente en un baño de agua a 37 ° C durante 2 min. Cuando ~ 80-90% descongelado, añadir 500 l de medio basal endotelial completa se calentó a la criovial, mezclar mediante pipeteo, y dispensar células uniformemente en una placa de cultivo de tejido de plástico 100 mm que contiene 15 ml de medio basal endotelial completa calentado.
3. Colocar las células en una incubadora a 37 ° con 5% de _CO2. Permiten que las células se adhieran durante la noche. No quitar o cambiar el medio de cultivo celular.
4. Cuando la placa de 100 mm es> 90% de confluencia, transferir HUVECs into un 75 cm tratada cultivo en matraz ² tejido y mantener en> 60% de confluencia en todo momento (véase el paso 1.5).
   Nota: Cuando se mantiene a una densidad de> 60%, HUVEC tiempo de duplicación es consistentemente 18-20 horas.
   1. Para situaciones en las que pases las células no es necesario (es decir, la densidad es de <90%), aspirar el medio y reemplazar con medio basal endotelial completo fresco cada 48 horas.
5. Cuando llegan a HUVECs> 90% de confluencia, enjuague 2 veces con 10 ml de PBS 1x, y luego eliminar las células de la placa de cultivo de tejidos, tratándolos 1,5 ml de tripsina al 0,25% durante 1-2 minutos a 37 ° C. Nota: La viabilidad de HUVEC se reduce en gran medida mediante la ampliación de la duración de la exposición de la tripsina.
6. células de rescate mediante la adición de medio basal endotelial 8,5 ml completa a la mezcla / HUVEC tripsina en una proporción de 4: 1 endotelial basal completa medios de comunicación: tripsina (relación mínima), y recoger en un tubo cónico de 15 ml.
7. Se centrifuga a 1.400 g durante 4 min. Aspirarel sobrenadante.
8. Resuspender el precipitado en 2 ml de medio basal endotelial completa y añadir las células a un nuevo 225 cm matraz de cultivo de tejido que contiene ² a 25 ml de medio basal endotelial completa.

2. Cubreobjetos Preparación Antes de HUVEC Cultura

1. Los cubreobjetos de recubrimiento con fibronectina sustratos.
   1. Preparar la inmaculada 22 mm No. 1.5 cubreobjetos ³⁹ y almacenarlos a temperatura ambiente (RT) en etanol al 100%.
   2. Use un mechero Bunsen a la llama un cubreobjetos y colocarlo en una placa de Petri de 35 mm con pinzas.
   3. Preparar una mezcla de fibronectina / PBS mediante la mezcla de 10 l de fibronectina de stock (1 mg / ml) con 990 l de PBS.
   4. Pipetear 250 l de la mezcla / PBS fibronectina en el cubreobjetos en el plato 35 mm. Extienda uniformemente para cubrir la superficie del cubreobjetos.
   5. Incubar la placa durante un mínimo de 3 horas a 37 ° C y enjuagar 3 veces con 2 ml de 1x PBS antes de su uso.
2. Cubreobjetos de pintura, haciendo de poliacrilamida Sustratos (PA).
   1. La activación cubreobjetos
      1. Coloque una de 22 mm Nº 1.5 cubreobjetos en el 50% de 3-aminopropyltrimethyloxysilane durante 10 minutos sobre una placa de agitación. Después de la incubación, lavar 10 veces durante 2 minutos en cada una de doble _H2O destilada _(ddH2O).
      2. Incubar el portaobjetos en glutaraldehído al 0,5% durante 30 minutos sobre una placa de agitación. Después de la incubación, lavar 10 veces durante 2 minutos en ddH ₂ O.
   2. Preparación de poliacrilamida
      1. Preparar un gel PA con un cumplimiento de 0,7 kilopascales (kPa) mediante la adición de 3,75 ml de 40% de acrilamida, 0,3 ml de 2% de bis-acrilamida, y 0,95 ml de ddH ₂ O.
      2. Preparar una solución de trabajo al 10% de persulfato de amonio (APS) y almacenar en hielo hasta su uso.
      3. Para preparar la solución de PA durante 1 cubreobjetos (volumen total = 166,7 l), añadir 0,83 l de _ddH2O, 41,7 l de la solución de bis-acrilamida (hecha en el paso 2.2.2.1), 124 l de 10% de APS, y0,25 l de TEMED.
      4. Inmediatamente pipetear 15 l de solución de PA en un portaobjetos de vidrio hidrofóbico (ver Lista de reactivos) y cubrir con una activa 22 mm Nº 1.5 cubreobjetos. Permitir que el PA polimerizar durante 20 min a TA.
      5. Quitar el cubreobjetos y transferir a una placa de 35 mm. Lavar 3 veces con 2 ml de 1x PBS. Almacenar durante <2 semanas a 4 ° C.
      6. Para unirse a la fibronectina en gel de poliacrilamida, exponer a los cubreobjetos recubiertos de poliacrilamida a 2 mM sulfo-SANPAH con 7.500 J de la luz UV (254 nm). Enjuagar una vez con _ddH2O
      7. Preparar una mezcla de fibronectina / PBS mediante la mezcla de 10 l de fibronectina de stock (1 mg / ml) con 990 l de PBS.
      8. Pipetear 250 l de la mezcla de fibronectina / PBS en el cubreobjetos (s) en una placa de Petri de 35 mm. Extienda uniformemente para cubrir la superficie del cubreobjetos.
      9. Incubar la placa durante un mínimo de 3 horas a 37 ° C y enjuagar 3 veces con 2 ml de 1x PBS antes de su uso.

class = "jove_title"> 3. La transfección de ADNc de HUVEC y Cultura en Cubreobjetos

1. Complete los pasos 1.5-1.6.
2. El uso de un hemocitómetro, contar el número de células y recoger un volumen que contiene 100.000 células / cubreobjetos (para los experimentos no migratorios), 500.000 células / cubreobjeto (para los experimentos de migración). Sedimentar las células a través de centrifugación a 1400 xg durante 4 min.
   Nota: El protocolo de migración se describe en la sección 9, a continuación.
3. Resuspender las células que se transfectaron con 100 l de tampón de electroporación. Se combinan con 1 g de ADNc y colocar en la cubeta de electroporación. Células electroporate: mezcla de ADN utilizando el programa designado para HUVEC electroporación (por ejemplo, programas #: A-034).
4. Rescate de células con 500 l de media y células endoteliales placa basal completas transfectadas en un 22 mm Nº 1.5 cubreobjetos recubiertos de fibronectina (ver Protocolo 2.1, más arriba). Se incuba a 37 ° C durante 3-4 horas para dar tiempo a la expresión de construcciones de ADNc.

Le "> 4. Preparación de muestras de Imagen

1. Cortar la cinta de doble cara en 2,5 cm x 0,65 cm tiras.
2. Obtener un portaobjetos de vidrio limpio. Tomar dos tiras de cinta adhesiva de doble cara y asegurarlos horizontalmente a lo largo del borde superior e inferior de la diapositiva. Nota: Es importante permitir que una pequeña cantidad de espacio entre la cinta y el borde de deslizamiento para el sellado de la cámara como se describe en el paso 4.5).
3. Monte cubreobjetos (del Paso 3.4; celular del lado hacia abajo) tal que 2 bordes del cubreobjetos resto de la cinta. El uso de fórceps para presionar hacia abajo suavemente para asegurar el cubreobjetos.
4. Usando una micropipeta, añadir 40 l de medio de formación de imágenes (medio basal endotelial completo suplementado con 25 mM HEPES) entre el cubreobjetos y portaobjetos. Asegúrese de que el espacio entre el cubreobjetos y portaobjetos se llena completamente con el medio de formación de imágenes. Aspirar medio formador de imágenes en exceso (si es necesario).
5. Sellar todos los bordes con valap caliente (1: 1: 1 vaselina: lanolina: parafina). Compruebe si hay fugas empujando GenTLY sobre el portaobjetos de vidrio.
6. Lugar montada y sellada sobre cubreobjetos (37 ° C) platina del microscopio pre-calentado.

5. Microscopía

1. Utilizando un microscopio de giro del disco confocal equipado con un 60X, 1,40 Apertura numérica (NA) de interferencia diferencial (DIC) de la lente objetivo de inmersión en aceite, un sistema de control de enfoque automático (PFS), el obturador electrónico para iluminación transmitida, una X-y-Y motored etapa, filtros de paso de banda alojados en una rueda de filtros electrónicos, y un módulo combinador láser monolítico, enfocar el microscopio en la interfaz de la célula / cubreobjetos y el uso de la palanca de mando platina del microscopio para localizar una sola célula.
2. Haga clic en el panel de "Configuración de la cámara" en el programa de software de imagen. Dentro de la ventana desplegable "tiempo de exposición" del panel de ajustes de la cámara, seleccione 400 ms.
   Nota: Los tiempos de exposición pueden variar y deben ser determinado empíricamente.
3. Haga clic en el panel "ND Adquisición" en elsoftware de imagen del programa. Dentro de la pestaña lambda (λ) del panel ND Adquisición, haga clic en las casillas de verificación para seleccionar los 488 y 561 nm láseres. Dentro de la pestaña de "tiempo" del panel ND Adquisición, establecer el tiempo de adquisición de 2 segundos y el tiempo total de 2 minutos.
4. Haga clic en el botón "Ejecutar ahora" en el panel de ND adquisición para adquirir una secuencia de imágenes de lapso de tiempo de 2 minutos a intervalos de 2 segundos de adquisición usando un tiempo de exposición de 400 ms tanto para la iluminación y 488- 561 nm.
5. En el panel "Config óptica" del programa de software de imagen y el uso de los ajustes de la cámara que se describen en el paso 5.2, haga clic en el botón de láser 405 nm y luego haga clic en "Adquirir" para capturar una imagen única de la proteína fluorescente azul (BFP) marcado con proteínas .
   Nota: En general, es aconsejable limitar la exposición de células (frecuencia de captura de imagen y / o el tiempo de exposición) para iluminación láser de 405 nm de longitud de onda ya que esto puede dañar las células con el tiempo.
   1. Para los estudios de MCAK-shRNA, unacquire una única imagen de 405 nm para verificar la expresión del shRNA marcado con BFP.
6. En el panel "Optical Config" del programa de software de imagen y el uso de los ajustes de la cámara que se describen en el paso 5.2, haga clic en el botón CID y haga clic en "Adquirir" para capturar una sola imagen DIC de la célula para ramificar el análisis de la morfología (véase la sección 10 , más abajo).
7. Tras la adquisición de la imagen, utilice la función "brillo / contraste" en el programa de software de imagen para aumentar digitalmente la señal de imagen.
8. Exportar el brillo y el contraste de imágenes ajustados. Haga clic en "Archivo" y luego haga clic en "Guardar como", a continuación, haga clic para seleccionar ".tif" para el tipo de archivo de imagen.
   Nota: Normalmente, esto genera 61 .tif archivos de imagen de un solo 2 minutos adquisición de lapso de tiempo cuando fue capturado como se describe en el paso 5.4.

6. Análisis de dinámica MT

1. Para el seguimiento EB3, utilizar software plusTipTracker ^35, un código abierto,paquete de software computacional basado en MatLab diseñada para la detección automática, seguimiento, análisis y visualización de los EB marcado con fluorescencia.
2. plusTipGetTracks Interfaz gráfica de usuario (GUI)
   1. Para acceder a la interfaz gráfica de usuario plusTipGetTracks, tipo plusTipGetTracks.
   2. Para la detección EB3 cometa, utilizar la interfaz gráfica de usuario para buscar y seleccionar el directorio principal que contiene las imágenes .tif.
   3. Dentro del panel de parámetros de seguimiento de la interfaz gráfica de usuario plusTipGetTracks, introduzca los siguientes valores: Rango de búsqueda Radius = de 5 - 10; Longitud mínima Sub-Track = 3; Longitud máx Gap (Frames) = 12; Max Factor de contracción = 1,0; Adelante Ángulo máximo = 25; Ángulo máximo hacia atrás = 10; Fluctuación Radio (píxeles) = 2; Frame Rate (s) = 2; Tamaño de píxel (m) = 110.
      Nota: En primer lugar comprobar si los parámetros de seguimiento óptimos utilizando el plusTipParamSweepGUI en un conjunto representativo de .tif archivos de imagen. El valor introducido para el tamaño del píxel es específico de la lente del objetivo utilizado para adquirir la imagen de lapso de tiempos (consulte los pasos 5.1-5.2, más arriba).
   4. Para la Región de selección de interés (ROI), crear máscaras binarias de toda la célula trazando manualmente el borde de la celda utilizando la imagen DIC de la célula para formar un polígono.
   5. Para sub-región de interés (ROI sub-) la selección, crear ataque y de salida máscaras de borde trazando manualmente una línea gruesa de 2 puntos a través de la célula de la herida de punta de interés utilizando una herramienta de selección sub-ROI plusTipTracker modificado.
      Nota: La línea debe ser trazada paralelamente al borde de la herida en la posición en la célula de interés se extiende más allá células de cicatrización de borde ³¹ vecino.
3. GUI plusTipSeeTracks
   1. Verificar e inspeccionar visualmente las superposiciones de pista de las imágenes .tif almacenados en la carpeta de "retorno de la inversión" haciendo clic en el "Solar Tracks" botón en la columna de la pista de superposiciones. Repita este procedimiento para todas las superposiciones de pista.
   2. Realizar el agrupamiento de datos haciendo clic en el botón "Crear grupos" en la columna de la configuración opcional. Seleccione la experimentales de datos que pertenecen al mismo conjunto de datos haciendo clic en los archivos de datos. Guardar la selección, dando el "grupo", un nombre que puede ser fácilmente identificado (por ejemplo, "grupo de control").
   3. Para las mediciones dinámicas de crecimiento Sub-ROI MT, introduzca el número mínimo de cuadros de imagen que la pista cometa uno EB3 debe ser detectado dentro de la sub-retorno de la inversión con el fin de calificar como una "pista" y extraer excursiones de crecimiento MT en el retorno de la inversión inicial y final borde haciendo clic en "selección manual" en el panel de "sub-regiones de interés" de la interfaz gráfica de usuario.
      Nota: Por ejemplo, utilice 3 marcos (6 segundos) como la longitud de detección mínimo para ser extraído como una "pista". pistas extraídas de sub-regiones de interés se almacenan en una carpeta de sub-proyecto dentro de la carpeta de retorno de la inversión original para cada celda.
   4. MT crecimiento sub-pista y análisis subpoblación
      1. Calcular la velocidad media de crecimiento MT y la media de vida de crecimiento MT para conjuntos de datos de "grupo" (ver paso 6.3.2), para cada retorno de la inversión (véase step 6.2.4), y para cada sub-retorno de la inversión (véase el paso 6.2.5).
   5. Dentro de la columna del Cuadrante gráficos de dispersión de la interfaz gráfica de usuario plusTipSeeTracks, haga clic en "Seleccionar grupos" y haga clic en los grupos (creado en el paso 6.3.2) para ser comparados.
      1. Seleccione "velocidad de crecimiento" para la opción del eje X y escriba el valor medio de la velocidad de crecimiento (de la etapa 6.3.4) en la caja. Seleccionar "tiempo de vida de crecimiento" para la opción de eje y, y escriba el valor medio para el crecimiento de por vida (de la etapa 6.3.4) en la caja.
   6. Marque la casilla junto a "Eliminación de pistas de inicio / final" y al lado de "proceso por lotes en grupos." Haga clic en "Hacer Solares" para generar un perfil de distribución de pistas de crecimiento MT para toda la celda, bordes de ataque y los bordes de salida sub-ROI.
      Nota: Para los estudios descritos aquí, las vías de crecimiento MT se distribuyen en cuatro subpoblaciones: lenta y de corta duración, lento y de larga vida, rápido y de corta duración, y rápido y de larga vida.
   7. copie los valores medios de la etapa 6.3.4 en un programa de software de hoja de cálculo y guardar el archivo con la extensión .xls.
      1. Haga clic en "Datos", a continuación, haga clic en "Análisis de Datos" de la ventana desplegable de datos. Seleccione "t-test: dos muestras suponiendo varianzas iguales" para comparar las velocidades de crecimiento MT y tiempos de vida de crecimiento significa MT. Resaltar las celdas de datos dentro de la hoja de cálculo donde las comparaciones de la prueba t dan como resultado un valor de p <0,001.

7. Análisis Colocalización

1. Para la sustracción del fondo, utilizando la "herramienta de línea" del programa de software de imágenes, dibujar una región de interés (ROI) haciendo clic en la pantalla para crear una forma cuadrada que es de 10 m ² en la imagen del canal verde (488 nm de excitación) a una posición en la que no hay fluorescencia celular (el fondo). Repita este la imagen del canal rojo (561 nm de excitación) utilizando las imágenes desde el paso 5.8 para.
2. Usando el software de imágenes programa, haga clic derecho sobre el retorno de la inversión desde el paso 7.1 y seleccione "establecer como fondo de retorno de la inversión." Haga clic en "Imagen", luego haga clic en el "fondo de resta" de la ventana desplegable para restar los valores de fondo promedio (del Paso 7.1) de la totalidad imagen. Conseguir una substracción de fondo para las células que expresan co-Em-Aurora A y, o bien mCherry-MCAK, Mapple-EB3, o Mapple-tubulina.
3. En la imagen del canal rojo antecedentes resta únicamente, haga clic en la cinta binario y seleccione "Definir Umbral" y luego seleccione la función "por canal" para excluir el marcador fluorescente designado.
   Nota: El paso de umbral se llevó a cabo ya sea en el mCherry-MCAK, Mapple-EB3, o la imagen Mapple-tubulina para permitir que las líneas que marcaban específicamente el objeto de umbral para el análisis de co-localización (véase el paso 7.4) dibujo.
4. Usando la herramienta de línea en el software de imágenes, dibujar una línea gruesa de 2 puntos sobre los objetos excluidos dentro de la imagen de umbral.
5. Seleccione los objetos línea trazada en el paso 7.4. Copiar y pegar los objetos de línea desde el canal rojo en la imagen correspondiente canal verde (Em-Aurora A).
6. Medir los valores de intensidad de píxel de escala de grises debajo de la línea de objetos para calcular la co-localización y valores totales Em-Aurora-A para cada célula individual mediante la selección de "Medida", luego "perfil de intensidad" de la ventana desplegable dentro del programa de software de imágenes.
   1. Organizar los datos por tratamiento experimental y la región subcelular mediante la exportación a un programa de software de hoja de cálculo y guardar el archivo como .xls tipo (por ejemplo, "control_grayscale_intensity.xls").
      Nota: Los datos presentados en esta forma representa la fracción de co-localización del total medido Em-Aurora-A por región subcelular.
7. Utilizando los valores medidos desde el paso 7.6, repita el paso 6.3.7 para calcular la significación estadística usando p <0,05 como nivel de significación.

8. inmunofluorescencia

1. Fijar las células (véase el paso 3.4) con paraformaldehído / glutaraldehído co-extracción / tampón de fijación (PGF-PHEM; 4% de paraformaldehído, 0,15% de glutaraldehído, 0,2% de detergente en las tuberías 60 mM, HEPES 27,3 mM, EGTA 10 mM, y MgSO 8,2 mM _4, pH 7,0) durante 10 min a RT.
2. Enjuagar 3 veces durante 5 min con 2 ml de 1x PBS.
3. Tratar 2 veces durante 15 minutos con 0,01 g / ml NaBH ₄ en 1X PBS para saciar aldehídos reactivos.
   Nota: _NaBH4 forma burbujas que pueden causar los cubreobjetos floten. Es fundamental que los cubreobjetos permanecen sumergidas durante estas incubaciones. Si los cubreobjetos comienzan a flotar, el uso de fórceps para elevar un borde del cubreobjetos con el fin de permitir que las burbujas de escapar.
4. Enjuague 2 veces con 1x PBS antes del bloqueo con 5% de leche descremada en 1x PBS en una plataforma de agitación durante 1 hora a temperatura ambiente.
5. Se incuban las células en los anticuerpos primarios (anti-conejo pT288-Aurora A (1: 1000)) y de rata anti-α-tubulina (1: 500), preparado en solución de 1x PBS. Se incuba a 4 ° C durante la noche en una plataforma oscilante.
6. Eliminar los anticuerpos primarios y enjuagar 3 veces durante 5 minutos en 1 x PBS antes de incubar con anticuerpos secundarios (de burro anti-conejo (1: 1000) y de cabra anti-rata (1: 1000)) preparado en el 5% de leche sin grasa para 2 hr a 37 ° C.
7. Monte cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio en medio de montaje de fluorescencia optimizado. Sellar los bordes cubreobjetos al portaobjetos usando esmalte de uñas transparente, y almacenar en la oscuridad a 4 ° C.

9. Ensayo de Migración Celular

1. Realizar cultivos de HUVEC para ensayos de migración se han descrito anteriormente (Protocolo 3: Transfección de ADNc de HUVEC y Cultura en cubreobjetos, Etapas 3,2-3,3).
2. Después de la transfección de células, las células transfectadas con rescate medio basal endotelial 80 l completa. Pipetear la muestra 80 l como una sola gota en el centro de un 22-mm ronda No. 1.5 cubreobjetos recubiertos de fibronectina seca. No se debe extender el dro 80 lpag. Se incuba a 37 ° C durante 3-4 horas para dar tiempo a la adherencia de las células en una monocapa confluente.
   Nota: El secado del cubreobjetos es necesario para evitar la caída de 80 l se propague al contacto del cubreobjetos. Este enfoque permite HUVECs a ser concentradas en un área pequeña del cubreobjetos y de ese modo promueve la rápida formación de una monocapa confluente de células.
3. Enjuague 2 veces en medio basal endotelial completa para eliminar las células unidas por la ONU.
4. Para crear un "borde de la herida," raspar el cubreobjetos con una hoja de afeitar esterilizada arrastrando suavemente una hoja de afeitar limpia través de la monocapa HUVEC (de la Etapa 9.2). Mantenga el cubreobjetos con cuidado en su lugar con pinzas para evitar el deslizamiento de la cuchilla de afeitar durante el raspado.
5. Permitir que las células se recuperen en una incubadora a 37 ° durante 3 horas. Ensamblar y montar cubreobjetos (s) para la formación de imágenes (véase el Protocolo 4).
6. Adquirir de contraste de fases y las imágenes de 488 nm a intervalos de 10 minutos durante 12 horas en el microscopio utilizando una10x fase de 0,45 NA objetivo y un condensador de 0,52 NA LWD con el panel "ND Adquisición" del programa de software de adquisición de imágenes (que se describe en el Paso 5.3).

10. La cuantificación de HUVEC ramas y Migración

1. Para ramificación análisis y para permitir la iluminación uniforme de células y cuantificación imparcial, adquirir una imagen microscópica de un HUVEC transfectadas (véase el paso 3.3) y expresando el cDNA MAPPLE-C1 construir, un marcador de volumen celular.
2. Utilizando el programa de software de imagen, abra la imagen de Mapple-C1 y etiquetar la posición en ambos lados de la rama donde la membrana muestra el mayor ángulo de curvatura. Conecte los dos puntos con una línea recta. Esta línea es la "salida del ramo".
3. Usando la herramienta de línea de software de imágenes, identificar visualmente las ramas que miden> 10 micras de longitud de la "salida del ramo" determinado en el paso 10.2. Calcular la longitud de la rama mediante la medición de la distancia desde THe "salida del ramo" hasta el punto más distal de la punta de la rama (véase la Figura 4).
4. Contar el número de protuberancias ramificadas que miden> 10 micras de longitud para obtener "la sucursal número de células."
5. Para el análisis de la migración, el uso de las imágenes recogidas en el paso 9.6, identificar visualmente un HUVEC herida de punta basado en la ubicación física (es decir, células físicamente en el borde de la herida) y el perfil de expresión (es decir, seleccionar una celda borde de la herida verde si el experimento implica expresión de GFP).
6. Usando las imágenes de contraste de fase de la célula, identificar visualmente el núcleo (la estructura esférica semi-transparente cerca del centro de la célula), y luego identificar visualmente el nucleolo (una estructura pequeña, de color oscuro, esférica dentro del núcleo) a el primer punto de tiempo de las imágenes con lapso de tiempo. Haga clic en la posición del nucléolo para etiquetar las coordenadas X e Y del nucléolo.
7. El uso de software de imágenes, a mano un seguimiento de lanucléolo en imágenes con lapso de tiempo sucesivos haciendo clic en la posición del nucléolo para etiquetar las coordenadas X e Y del nucléolo en cada fotograma de la película de lapso de tiempo (Figura 4).
8. Usando el software de imagen, haga clic en "Archivo" y luego haga clic en Guardar como "y haga clic para seleccionar el tipo de archivo de imagen" .xls ".
9. Abra el archivo de datos de seguimiento de mano (desde el paso 10.8) usando un programa de software de hoja de cálculo. Calcula la velocidad media la migración y la media distancia de migración de origen.
10. El uso de un programa de software de hoja de cálculo, haga clic en "Datos", a continuación, haga clic en "Análisis de Datos" de la ventana desplegable de datos. Seleccionar corrección de Bonferroni, el análisis de una sola vía de la prueba de varianza con confianza> 95% como punto de corte para la significación estadística.

Resultados

cultura HUVEC para microscopía de células vivas
Imágenes de células vivas de HUVECs expresar proteínas fluorescentes requiere que HUVECs se mantienen en un ambiente que es adecuado para el crecimiento normal de las células y el mantenimiento, así como la expresión de proteínas y la función normal. La figura 1 muestra una representación esquemática del protocolo utilizado para preparar un tamponada y un sistema cerrado que mantiene las características ópticas optimizadas para la recogida de imágenes con lapso de tiempo de células vivas. Finas tiras de cinta de doble cara se colocan en un portaobjetos de vidrio (Figura 1A) y luego el cubreobjetos que contiene el cultivaron HUVECs se invierte en la parte superior de la cinta de tal manera que las células se enfrentan a la corredera (Figura 1B). De esta manera, la cinta proporciona un pequeño espacio entre las dos superficies de vidrio, y crea un espacio en el que las células pueden ser bañados en medios de cultivo celular apropiada (Figura 1C; véase el Protocolo 4, arriba). yona paso final, el cubreobjetos de vidrio se sella a la lámina de vidrio usando una jalea de petróleo: cera de parafina: lanolina (1: 1: 1 mezcla, valap; Figura 1D) para establecer un sistema cerrado. Este enfoque de cultivo celular se utiliza tanto para el más corto tiempo de la secuencia de imágenes de los cometas y EB3 para la secuencia de tiempo más largo de ramificación y los experimentos de migración. Además, la consistencia similar a la cera de valap permite la fácil retirada de la lámina de vidrio y un cubreobjetos en el extremo de una formación de imágenes experimentar tales que los enfoques complementarios incluyendo fijación y immunolabelling (véase el Protocolo 8), se puede realizar en el mismo cubreobjetos y muestra de células que se visualizó utilizando el enfoque de imágenes de células vivas.

Figura 1:. Metodología de la cultura HUVEC para imágenes microscópicas de células vivas (A) Cortar 2 piezas de cinta de doble cara en 0,65 cm x 2.50 cm tiras rectangulares y asegurar una pieza de cinta de doble cara horizontalmente a lo largo del borde superior de la corredera, y la otra pieza, a lo largo del borde inferior de la corredera. Es importante para permitir que una pequeña cantidad de espacio entre la cinta y el borde de deslizamiento para el sellado de la cámara como se describe en (D). (B) El uso de pinzas eliminar el cubreobjetos que contiene HUVECs e invierten el cubreobjetos (células hacia abajo) en la parte superior de los trozos de cinta adhesiva. (C) El uso de una micropipeta, añadir 40 l de los medios de formación de imágenes (medio basal endotelial completo suplementado con 25 mM HEPES) entre el cubreobjetos y el portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que el espacio entre el cubreobjetos y portaobjetos se llena completamente con los medios de formación de imágenes y evitar burbujas. Utilice un aspirador a lo largo del borde del cubreobjetos para eliminar el exceso de medios de comunicación, si es necesario. (D) el uso valap caliente (1: 1: 1 de vaselina: lanolina: parafina) para sellar alrededor de los bordes del cubreobjetos. Compruebe si hay fugas de medios de formación de imágeness empujando suavemente en torno a la cubreobjetos. Utilice valap adicional para subsanar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

seguimiento automatizado de EB3 marcado con fluorescencia permite el análisis exhaustivo de células enteras y la dinámica de crecimiento MT regionales. La colección de imágenes microscópicas claros y distintos, y altamente tiempo y resueltos con el espacio de la proteína EB3 es esencial para el análisis de los movimientos EB3 dentro de la célula. expresión HUVEC de EB3-marcado con fluorescencia varía ampliamente de célula a célula y la intensidad de fluorescencia normalmente aumenta dentro de la misma celda durante un período de horas. Por lo tanto, es importante tener en cuenta y monitorear estos cambios en el perfil de expresión con el fin de identificar los efectos potenciales de una mayor expresión de EB en la dinámica de crecimiento MT. Esto se logra mejor mediante la evaluación de intensit fluorescencia de escala de grisesperfiles de Y, para cada célula de fotografiado, y a continuación, la restricción de análisis de datos para aquellas células que muestran una gama definida de los perfiles de expresión en escala de grises. La evaluación inicial de conjuntos de datos de perfil de expresión es crítica, y debe compararse con MT dinámica de crecimiento de datos que se obtiene por software plusTipTracker para cada celda. Perfiles de expresión se pueden trazar en contra de la velocidad de crecimiento de MT y la vida útil de crecimiento MT para cada celda dentro de un grupo experimental, con el fin de determinar el rango deseado de expresión de escala de grises y para identificar posibles valores atípicos.

Figura 2 destaca un HUVEC cultivadas en un sustrato de fibronectina (véase el Protocolo 2.1, arriba) y expresando cerca de los niveles óptimos de EB3 marcado con Mapple. Cometas EB3 fluorescentes se muestran en una serie de lapso de tiempo de las imágenes durante un periodo de 12 segundos (Figura 2A). El análisis de los cometas EB3 utilizando el software plusTipTracker implica una, dete EB3 cometa automatizado fotograma a fotogramacción (puntos verdes y amarillos, Figura 2b). Cometas detectados dentro de cada trama se enlazan, depende de su cambio de posición de cuadro a cuadro, para generar pistas EB3 y una superposición de pista EB3 visual (Figura 2C-F). superposiciones de pista son codificadas por color y distinciones de color pueden ser determinadas por los parámetros introducidos por el usuario. Comúnmente, estas distinciones utilizan la media global de la velocidad de crecimiento de MT y MT curso de la vida de ese modo el crecimiento de ^5,31 y dividir los datos en cuatro grupos: lenta y de corta duración (de color rojo), lenta y larga vida (amarillo), rápidas y de corto vivido (verde), y el crecimiento MT rápido y de larga vida (azul; Figura 2G). seguimiento mediada por PlusTipTracker de la dinámica de crecimiento MT EB3 marcado también permite a las regiones definidas por el usuario de interés (ROI). PlusTipTracker extrae los datos de la pista de crecimiento MT desde el interior del retorno de la inversión definida por el usuario (Figura 2 A, B y F), lo que permitió establecer comparaciones de crecimiento dynam MTICS dentro de diferentes regiones de la misma célula.

Figura 2: Detección cometa EB3, seguimiento y salida de datos plusTipTracker (A) de la película de lapso de tiempo de un HUVEC EB3 expresar Mapple.. El panel izquierdo muestra una vista células enteras y la máscara de célula entera (línea blanca) demarcación de los límites de las celdas. cuadro rojo representa la región ampliada se muestra en las imágenes con lapso de tiempo (paneles de la derecha). paneles de la derecha muestran imágenes con lapso de tiempo en escala de grises primas de cometas EB3 en marcos de imágenes sucesivas (t = 0 seg - t = 12 seg). (B) la detección de los cometas plusTipTracker EB3 partir de las imágenes que se muestran en (A). El panel izquierdo muestra una vista de célula completa de los cometas detectados (puntos amarillos). cuadro rojo representa la región ampliada se muestra en las imágenes con lapso de tiempo (paneles de la derecha). paneles de la derecha destacan cinco cometas detectados EB3 (flechas rojas) y trazan esos cinco cometas durante el período de formación de imágenes 12 seg. Verde Los puntos representan los cometas detectados EB3 que no existían (o no fueron detectados) en el intervalo de tiempo anterior. (C) Proyección de intensidad máxima de 61 fotogramas (2 min) de la película de las cometas EB3 mostrados en (A). (D) plusTipTracker MT superposición de la pista de los mismos 61 cuadros (2 min de película) que se muestran en (C). (E) El zoom de proyección de intensidad máxima (cuadro rojo en C). (F) El zoom de plusTipTracker MT superposición pista de proyección de intensidad máxima (cuadro rojo en D). Leyenda para los recubrimientos de pista se muestran en (D) y (F) (G) con código de colores. La designación como lento, rápido, de larga vida efímera o se basa en el valor medio de todas las pistas de crecimiento medidos en un grupo de HUVEC que expresan diez Mapple-EB3. Para la visualización más fácil, superposiciones de pista en (D) y (F) se generan utilizando intensidades de los píxeles de la imagen invertida de células se muestra en (A). Barras de escala = 20 m./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

HUVEC ramificación y los patrones de migración son sensibles a la mecano-físicas señales desde el ECM.

HUVECs son bien conocidos para responder a diversos tipos de señales de señalización y, al hacerlo, para someterse a alteraciones morfológicas que dictan una respuesta celular apropiada para la señal de señalización en particular (s) ^36,40-42. HUVECs cultivadas sobre sustratos de vidrio recubiertos de fibronectina (Figura 3A), o en rígidas ECMs de poliacrilamida de 2 dimensiones (55 kPa) suelen mostrar una ronda o morfología alargada con unos salientes ramificados distintos (Figura 3b). Sin embargo, cuando se cultivan en ECMs poliacrilamida 2-dimensionales muy blandos (0,7 kPa), HUVECs mostrar una morfología muy ramificado que es conocido por ser el resultado de cumplimiento inducida abajoregulación de la miosina-II de la contractilidad ^4,5,31 (Figura 3C). Por lo tanto, las HUVEC a regular su morfología celular a través de mechanosensing ECM, y esto se logra a través de la modulación de la dinámica localizada MT y acto-miosina contractilidad.

Debido a HUVECs mostrar una amplia variedad de atributos morfológicos, con el fin de medir HUVEC ramificación es crítico para definir primero lo que un saliente ramificado es, a continuación, para definir la forma de un saliente ramificado será medido objetivamente. Una técnica utiliza un enfoque de cuatro pasos por el que un límite de la celda o "máscara" se genera mediante el trazado de los bordes de la célula usando una imagen de una célula que expresa un marcador fluorescente volumen para definir los bordes de células (Figura 3D) la mano. Después de la generación de la máscara, los orígenes de ramificación se definen mediante la localización de mayor ángulo de curvatura entre la protuberancia ramificado y el cuerpo de la célula. Se traza una línea a DEMArk el "origen rama" (líneas angulosas púrpuras; Figura 3E). Número de sucursal se mide simplemente contando el número de ramas con una rama de origen definido (Figura 3F). Longitud Branch se mide como la distancia desde el origen rama en la punta de la rama distal (Figura 3G). Para evitar la inclusión de pequeñas proyecciones lamellipodial de análisis de datos, criterio adicional requiere que las ramas deben ser más largos ( "longitud de la rama") de lo que son de ancho (en el "origen rama"), y que las ramas deben tener al menos diez micras de longitud ^{5 , 31.}

. Figura 3: Análisis de HUVEC morfología de ramificación (A - C) Ejemplos de imagen DIC de HUVECs cultivaron en ECMs de vidrio recubiertas de fibronectina (A) rígidos (55 kPa) ECMs de poliacrilamida (B) y blandos (0,7kPa) ECMs de poliacrilamida (C). La ramificación se incrementa dramáticamente en HUVECs cultivadas en 0,7 ECMs poliacrilamida kPa (C) en comparación con ECMs más rígidos (A, B). (D). DIC imagen microscópica (imagen izquierda) de un HUVEC transfectadas que expresan un ADNc Mapple-C1 construir (un marcador de volumen de la célula; imagen de la derecha). (E) fijar la salida del ramo mediante la localización de la mayor ángulo de curvatura (es decir, la posición en la que la membrana muestra la mayor curvatura; líneas de color violeta) a ambos lados de la rama y luego conectar los ángulos con una línea recta (líneas azules) . (F) Identificar y seleccionar las protuberancias que se extienden ramificados> 10 micras de la "salida del ramo" (definido en E). Contar el número de protuberancias ramificadas obtener el "número de sucursal." (G) Medir la distancia desde el centro de la "salida del ramo" al messt punto distal de la rama utilizando la herramienta de línea en la aplicación de las anotaciones y las mediciones de NIS elementos de software para obtener la "longitud de la rama." Las barras de escala = 20 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además del cumplimiento de ECM de detección, HUVECs también detectar y responder a la eliminación de los contactos celulares adyacentes como inducida por la herida cero. En el ensayo de migración, HUVECs cultivarse en una monocapa están sometidos a una herida cero y características de la migración se miden (véase el Protocolo 9, más arriba). Después de la inducción de la herida por el rascado de la monocapa, HUVECs herida de punta polarizan mediante el desarrollo de un borde de ataque de protrusión que se extiende en la herida (Figura 4A, t = 0 h). Durante un transcurso de tiempo de 10 a 12 hr, polarizadas HUVECs herida de punta migran a la zona de la herida y llenan elherida, estableciendo una nueva monocapa confluente (Figura 4A, t = 11 horas). Al igual que con HUVEC ramificación, la evidencia actual sugiere que la polarización y la migración depende de manera crítica de la coordinada reorganización del citoesqueleto de actina y MT ^43-49. Esto se consigue, en parte, a través de la inhibición localizada de desmontaje MT MCAK inducida en el borde de ataque, pero no en el borde de salida de la herida de punta HUVECs ^31. La sensibilidad de la dinámica de MT a la herida inducida por la polarización es iniciada por el Rac1 GTPasa, que apunta a numerosas proteínas reguladoras aguas abajo, incluyendo Aurora-A quinasa que fosforila e inhibe MCAK en el borde delantero, y otras quinasas que son capaces de inhibir o activar MAPs a nivel local modular el crecimiento y la contracción MT ^{18,31,36,48,50-53.} Amplia evidencia experimental apoya la idea de que la coordinación de líder saliente del borde anterior y posterior contracción de aristas se rige por ciclos de activación de Rac1para promover el ensamblaje MT en el borde de ataque y la activación de RhoA al acto-miosina contractilidad en el borde posterior, impulsando así la motilidad dirigida ^{9,41,51,52,54-58.}

Hasta la fecha, no existe una metodología establecida para llevar a cabo el seguimiento automático de la migración celular. Este es un resultado de la dificultad de analizar computacionalmente límites célula-ECM que están cambiando constantemente como las células de la herida de punta polarizan y migran. Mientras que muchos programas de software son capaces de rastrear las células marcadas fluorescentemente ^59-64, la población de la etiqueta fluorescente HUVECs en los experimentos de migración herida de punta es de aproximadamente 30 a 40% de la población total HUVEC, y por lo tanto la mayoría de las células de la herida de punta debe ser visualizado por contraste de fase o de imágenes DIC. Además, es importante en la medición de la migración de la herida de punta para evaluar células fluorescentes y no fluorescentes dentro de la misma herida con el fin de identificar específicaefectos de construcciones de expresión, tanto dentro de los grupos de estudio experimentales y entre los grupos de estudio experimentales. En la actualidad, el mejor enfoque para medir la migración HUVEC es utilizar un enfoque de seguimiento de mano en la que se identificó por primera vez una célula herida de punta y luego el núcleo y el nucléolo se identifican (Figura 4B). El nucleolo se utiliza como la posición determinante para el seguimiento de las células debido a su densidad de dispersión de luz de alta y tamaño relativamente pequeño. Estas dos características del nucleolo que sea más fácil identificar y reducir el error de medición mediante la limitación de la zona en que el usuario puede colocar las posiciones de pista individuales. pistas de migración HUVEC Se generan entonces haciendo clic en el nucléolo en sucesivos cuadros de imagen de lapso de tiempo. Por último, la velocidad y la distancia de migración de origen de migración son medidos y analizados por grupos de células experimentales (Figura 4B) de control y.

Figura 4: Análisis de HUVECs herida de última generación y seguimiento de la migración de las imágenes (A) 20X contraste de fase de una serie de imágenes a intervalos de 11 h de cero herida de punta HUVEC (también conocido como "ensayo de migración").. La herida y la dirección de la migración se indican en el panel de t = 0 h. HUVECs se muestran para cruzar la herida de punta y el avance en la herida hasta que se forma una monocapa de células (t = 3,5 hr - t = 11 h). (B) Análisis de ensayo de migración de imagen de lapso de tiempo (como se muestra en A) requiere en primer lugar la identificación de una herida de punta HUVEC rastreable basado en la localización celular (es decir, células físicamente en el borde de la herida) y el perfil de expresión (i .e. , seleccione una celda borde de la herida verde si el experimento implica la expresión de GFP). Uso de imagen de contraste de la fase, identificar el núcleo y el nucléolo. Mano seguimiento del nucléolo en imágenes con lapso de tiempo sucesivos utilizando la unanotaciones y las mediciones de aplicación en el software NIS elementos para determinar la velocidad de la migración y la distancia al origen. Las barras de escala = 100 micras (A), 20 mm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El uso de HUVEC en la morfología y migración experimentos.
imágenes de células vivas de la dinámica de crecimiento MT EB3 marcado dentro de las HUVEC requiere condiciones de cultivo celular adecuados y reproducibles con el fin de medir y evaluar los cambios en el crecimiento y la morfología de las células HUVEC MT, de tal manera que pueden ser asignados a una señal de señalización de ECM. HUVECs representan un excelente modelo para el estudio de la forma celular y la motilidad. Ellos son altamente susceptibles a la transfección con ADNc marcados con fluorescencia, presentan morfologías dramáticos en respuesta a ambas señales de señalización solubles y físicas, y mantienen la capacidad de organizarse en tubos vasculares cuando se proporcionan condiciones de cultivo celular adecuados ^65-70. cultivos de células primarias, tales como HUVECs, requieren un manejo y la supervisión del número de pases celulares cuidado a fin de asegurar que las células están sanas y que se comportarán normalmente durante la experimentación. Por ejemplo, cuando se realizan experimentos que investigan el cytoskeletonelada y / o la morfología celular, HUVECs no deben ser utilizados para los experimentos de más allá del paso de cultivo de células décimo, como HUVECs típicamente comienzan a mostrar morfologías no uniformes alrededor de pasaje doce y quince.

La densidad celular también es un regulador crítico de HUVEC de la salud y la proliferación. HUVEC investigaciones de ramificación (véase el Protocolo de 10/01 a 10/04, más arriba) utilizan cultivos de células de densidad relativamente baja con el fin de proporcionar las células espacio físico para interactuar con su ECM y para ampliar salientes ramificados. Por el contrario, en los estudios de migración herida de punta (ver Protocolo de 10.05 a 10.08), HUVECs son la cultura en una monocapa antes de la herida. Como tal, las HUVECs herida de punta exhiben una morfología relativamente poco ramificado, que lleva extender salientes de borde, y exhiben las interacciones célula-célula con sus vecinos inmediatos mientras se desplazan hacia la herida.

Salvedades y ventajas de Seguimiento MT Dinámica de estar en HUVEC.
Spinning microscopía de disco es una excelente aproximación aprobar las hipótesis experimentales que requieren una claridad de imagen confocal con una alta resolución temporal. Con el módulo de la cámara y el láser apropiado, este enfoque es sensible a la microscopía de fluorescencia de baja emisión y puede ayudar en la reducción de photobleaching en comparación con otros tipos de microscopía de fluorescencia. Es importante destacar que este enfoque es también muy adecuado para la moderada a alta resolución de imagen tiempo que se requiere para generar mediciones integrales de MT dinámica de crecimiento utilizando el mecanismo de etiquetado EB3, en una variedad de diferentes tipos de células.

Si bien la metodología de etiquetado EB3 creciente MT-plus extremos tiene claras ventajas sobre otros métodos de marcaje fluorescente MT, también tiene desventajas únicas. Por ejemplo, existe una proporción de la matriz de MT que no está creciendo activamente en un momento dado, incluyendo tanto la población de MTs desmontaje y la población de estables, MTS no dinámicos ^71-74. EB3 no sería etiquetar estas dos poblaciones de MTS ypor lo tanto, la contribución de estas dos poblaciones no se incluiría en el análisis de datos experimentales. metodologías alternativas para la evaluación de toda la matriz MT se han centrado en la expresión de la tubulina fluorescente marcada, que incorpora en todas las poblaciones de MTS y permite la identificación de crecimiento, la reducción y estable MTs. Sin embargo, debido a la relativamente alta densidad de la matriz de MT cerca del centro de la célula y adyacente a la organización de los microtúbulos centro (COMT), el etiquetado toda la matriz MT crea una desventaja en la realización de análisis de imagen de los extremos de MT que no están cerca de la celda ^75-77 periferia. Los experimentos utilizando dos colores co-etiquetado de MTs con la tubulina fluorescente y EB3 fluorescente en células vivas han revelado, cualitativamente, que la gran mayoría de los MTs de tubulina marcada también son EB3 marcado ^78. Además, no ha habido un método eficaz de seguimiento automatizado de MTs marcadas con tubulina fluorescente. Esto significa que recolección de datosción y las mediciones de la dinámica de MT en las células que expresan la tubulina fluorescente requieren seguimiento de la mano de los MT individuales, un proceso que es propenso a errores y tedioso. Como resultado, el análisis computacional automatizado de los MTs EB3 marcado se ha convertido en la metodología preferida para la medición de la dinámica de MT, ya que se puede aplicar a MT dinámica de experimentos a través de numerosos tipos de células y dentro de una variedad de regímenes experimentales ^35,79.

La vinculación de MT dinámica de crecimiento a HUVEC Morfología y Migración.
Desde la perspectiva de un investigador del citoesqueleto, una adaptación extremadamente útil del plusTipTracker análisis automatizado de seguimiento es la capacidad de medir y evaluar tanto los cambios en las células enteras y regionales en la dinámica de crecimiento MT. El requisito para que una célula se polarizan es un requisito previo esencial para la migración celular direccional. Como tal, las señales de señalización polarizadas hace tiempo se conocen como factores clave que impulsa la migración celular direccional ^{30,31,51,54,56,80,81} . Por ejemplo, moléculas de señalización solubles, tales como VEGF inducen la polimerización de actina y el crecimiento MT hacia la señal VEGF en tipos de células endoteliales ^2,82-87. Además, en respuesta a las interacciones físicas con el ECM (por ejemplo, el cumplimiento y mechanosensing dimensionalidad), HUVEC modular la dinámica de MT mediante la regulación localmente mapas para promover el crecimiento MT dentro alargando protuberancias ramificadas, y esto sirve para guiar la migración HUVEC en la dirección de la cue ^5,31,88. Por lo tanto, la polarización en respuesta a señales extracelulares de señalización pone de relieve la necesidad de una evaluación experimental de cambios localizados en la dinámica del citoesqueleto.

imágenes de células vivas simultánea de la dinámica de MT de crecimiento (utilizando el enfoque EB3) y la migración de células HUVEC es extremadamente difícil de realizar porque MTs crecen en una escala de tiempo de segundos, mientras que los cambios en la morfología celular y la migración direccional se producen en una escala de tiempo de horas. Sin embargo, ambos procesos están íntimamente Linkere. Por otra parte, la rápida formación de imágenes continua, de EB3 con fluorescencia marcado en la segunda escala de tiempo conduce a photobleaching de la señal EB3. Los intentos para superar este problema mediante la realización de series de imágenes de corta EB3 (serie adquisición 1-2 min) cada 30 minutos han sido un éxito, pero sólo podría llevarse a cabo en un pequeño número de EC que tenía una expresión óptima de EB3 y que no mostraba adversa efectos de iluminación láser repetida ^5.

Un enfoque alternativo que permite interpretaciones de cómo la dinámica de crecimiento MT contribuyen a los cambios en la morfología celular y la migración es la región de interés plusTipTracker herramienta (ROI) ³⁵ (véase el Protocolo 6.6). Esta metodología permite el crecimiento para el conjunto de células MT pistas para ser sub-dividida en regiones definidas por el usuario, a partir del cual las pistas de crecimiento MT pueden ser extraídos y analizados. Por ejemplo, las comparaciones de "ramificada" frente a las regiones "no ramificados" de la célula han revelado que los MT crecen más shumilde y más persistente dentro de las regiones ramificados en comparación con la periferia de la célula no ramificado ^5. En polarizada herida de punta HUVECs, las comparaciones de la dinámica de borde de ataque y salida de crecimiento borde MT revelaron que MCAK inducida desmontaje MT se inhibe específicamente dentro del borde de ataque, pero no el borde de salida. Evaluación regional de ataque y de salida dinámica de crecimiento borde MT en HUVEC que expresan Rac1 y / o mutantes fosforilación de MCAK reveló además que la activación inducida por Rac1 de Aurora-A quinasa específica y localmente inhibe la actividad MCAK dentro del borde de ataque para conducir HUVEC polarización y la migración direccional ^31. Por lo tanto, la combinación de seguimiento automatizado de la dinámica de crecimiento MT y evaluación regional de la dinámica de crecimiento MT dentro de los salientes ramificados y / o el borde delantero de la herida de punta HUVECs nos ha permitido vincular la dinámica de crecimiento MT a HUVEC morfología y migración.

Los protocolos descritos son designed para proporcionar una metodología generalmente inmediata y altamente repetible para el cultivo de HUVEC y la investigación experimental. Sin embargo, muchos de los detalles del protocolo son complejas y requiere mucho tiempo, lo cual, a su vez, proporciona la oportunidad para errores o dificultades en la realización de la metodología experimental. Si bien se trató de abordar problemas potenciales en todo el protocolo, se proporciona aquí sobre solución de problemas, detallado de los problemas potenciales que son menos comunes o abreviado de otra manera como notas dentro de los protocolos de metodología.

En relación con cubreobjetos de recubrimiento con sustratos de poliacrilamida (Protocolo de 2,2), un problema común que surge es la compleja naturaleza de la activación de cubreobjetos de vidrio, el acoplamiento de poliacrilamida al vidrio, la activación de poliacrilamida, y luego el acoplamiento de ECM a la poliacrilamida. Un paso particularmente difícil y potencialmente problemático que cultiva HUVEC sobre el gel de fibronectina / poliacrilamida después de la exposición de la polyacubreobjetos recubiertos de crylamide a 2 mM sulfo-SANPAH (paso 2.2.2.6, arriba). Es crítico para el éxito del cultivo de HUVECs en estos sustratos que sulfo-SANPAH ser retirado completamente del sistema experimental después de la conjugación ECM. Esto puede lograrse mejor mediante lavado con _ddH2O e incubando los cubreobjetos en _ddH2O en un agitador durante la noche. Si las células cultivadas en ECM de poliacrilamida no sobreviven, o si la viabilidad es menos de lo esperado, aumentó y el lavado de sulfo-SANPAH repitió después de la conjugación a la fibronectina (paso 2.2.2.9) se recomienda potencialmente aliviar este problema.

Relacionada con el Protocolo nº 3 (cDNA transfección y cultivo de HUVEC en un cubreobjetos), una influencia importante para el éxito del procedimiento de electroporación es el manejo de las HUVEC tanto durante el tratamiento con tripsina de las células para eliminarlos del frasco de plástico, y tras la celebración de la electroporación (pasos 3.3 a 3.4, más arriba). Es crítico para el cuidadopor completo el monitor HUVECs mientras que en la tripsina, y que no exceda el tiempo necesario para que las células "round-up" en la superficie del matraz (típicamente 1-2 min). El tiempo excesivo en tripsina es una causa importante de muerte HUVEC, que normalmente no se realiza hasta que las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos de fibronectina (paso 3.4) y luego no para unir al sustrato.

De similar importancia, HUVEC (y la mayoría de los tipos de células primarias) no les va bien cuando se suspendió por mucho tiempo en el tampón de electroporación. Durante los experimentos de mayor escala, por ejemplo, donde el usuario tiene cinco o más condiciones que requieren la electroporación, es mejor mantener las células sedimentadas en tubos individuales (1 tubo por transfección) y mezclar ellos, uno-a-un-tiempo , en el tampón de electroporación inmediatamente antes de la electroporación. Este enfoque minimiza el tiempo de incubación en tampón de electroporación y la supervivencia de HUVEC maximizada. Además, el rescate inmediato en medio de cultivo completo también está critical después de la electroporación. retrasos de rescate de un minuto o más después de la electroporación pueden resultar en la muerte de su concreción HUVEC y por lo tanto deben ser evitados.

ensayo de migración de células relacionadas (Protocolo 9), la técnica de cultivo de HUVECs a muy alta densidad depende de una modificación crítico (descrito en el paso 9.2) de la metodología de cultivo de células HUVEC tradicional (que se describe en el Protocolo 3) que requiere el secado del cubreobjetos recubiertos de fibronectina con el fin de hacer posible la cultura HUVEC en un área muy pequeña del cubreobjetos. Muchas veces, si el cubreobjetos no está completamente seca o si el revestimiento antes del cubreobjetos con fibronectina (pasos 2.1 o 2.2) no fue eficiente, las células que contienen los medios de comunicación que se coloca sobre el cubreobjetos perderán su tensión superficial y expandir a la bordes del cubreobjetos, reduciendo así la densidad de células en el cubreobjetos. Un método para solucionar este problema potencial es para aspirar los medios de comunicación desde el cubreobjetos y luegocolocar el cubreobjetos (todavía en su plato de 35 mm) en la parte posterior de la cabina de bioseguridad durante 5-10 minutos. Esta adaptación puede ayudar a permitir el flujo de aire dentro de la caja para ayudar a secar el plato. Si algún líquido visible permanece en el portaobjetos después de secado al aire, aspirar las manchas de líquidos y de nuevo deje secar al aire durante 5-10 minutos adicionales en la cabina de bioseguridad. Es importante tener en cuenta que no hay manera de evitar por completo este problema potencial, pero se convierte en un problema menor con la práctica repetida del protocolo. También es una recomendación de solución de problemas que cuando se prepara cubreobjetos para el ensayo de migración celular (o cualquier ensayo, en general), para preparar cubreobjetos adicionales y tienen HUVECs adicionales listos para ir en caso de problemas en el camino.

Con estas consideraciones en mente la solución de problemas, también es importante destacar la utilidad de los protocolos de tratados y de sus implicaciones en el futuro la investigación en biología celular. La aplicabilidad de la polyacrcarboxílico enfoque es muy amplio, e incluye no sólo los estudios bidimensionales de compromiso de células-ECM (descrito anteriormente), sino también las investigaciones tridimensionales ^5. Esta aplicación es fundamental para aumentar nuestra comprensión de cómo las HUVEC regulan la forma celular y la migración en entornos fisiológicos y debe proporcionar a los investigadores una comprensión básica de cómo los cambios morfológicos son coordinados con los cambios del citoesqueleto. Si bien los protocolos descritos aquí se centran en las mediciones de la dinámica de crecimiento MT, la mayoría de los protocolos puede y debe ser adaptado para medir cualquier número de otros aspectos medibles al microscopio de las interacciones célula-ECM. En lo que respecta a la dinámica de MT, hay numerosos mapas, incluyendo al menos 14 familias de Kinesins ^89, cada uno con un papel potencial para contribuir a HUVEC polaridad y migración dirigida, y todos los cuales pueden ser investigados utilizando los protocolos presentados.

Las investigaciones futuras deberían unalso estar dirigidas a la participación de células-ECM en normales frente a estados de enfermedad. protocolos de HUVEC se presentan aquí son aplicables a las investigaciones de los procesos homeostáticos vasculares normales, así como a estados de enfermedad incluyendo enfermedades del corazón, la retinopatía, el crecimiento tumoral y la metástasis, para nombrar unos pocos. Conjugando visiblemente transparentes sustratos ECMs y poliacrilamida de cumplimiento susceptibles con estudios microscópicos permitirá célula-ECM estudios de acoplamiento de tal manera que la angiogénesis vascular de las células endoteliales se puede controlar con alta resolución espacial y temporal. Estos tipos de enfoques experimentales ya han comenzado a revelar diferencias importantes en la forma de la célula endotelial, la polaridad, la migración, y los efectos de las proteínas que regulan estos procesos ^5,31,90. Los esfuerzos futuros deben tratar de determinar cómo la combinación de ECM cumplimiento y mechanosensing dimensionalidad puede servir para proteínas de control a nivel local que se dirigen y regulan la dinámica del citoesqueleto.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Inhibidor de Aurora A I	Selleck Chemicals	S1451
Solución al 2% Bis	Bio-Rad	1610142
3-aminopropiltrimetiloxisilano	Sigma-Aldrich	A3648
Acrilamida al 40%	Bio-Rad	1610140
405, 488, 561, 640 nm módulo combinador láser MLC400 de alta potencia	Agilent Technologies	99462
Persulfato de amonio	Sigma-Aldrich	A3678
anti– perlas de inmunoprecipitación IgG de ratón	Reactivos TrueBlot; Rockland Inc.	88-1688-31
anti– perlas de inmunoprecipitación IgG de conejo	Reactivos TrueBlot; Rockland Inc.	88-7788-31
ET455/50m, Filtro de emisión DAPI-ET	Chroma Technology Corp.	ET455/50m
ET525/36m Filtro de emisión Chroma	Technology Corp.	ET525/36m
ET605/70m Filtro de emisión	Chroma Technology Corp.	ET605/70m
ET700/75m Filtro de emisión	Chroma Technology Corp.	ET700/75m
Suero bovino Albúmina Fracción V Productos	RPI	A30075-100.0
Cámara de dispositivo de carga acoplada refrigerada Clara	Tecnología Andor 77026010
Cy3 anti-conejo para burro	Jackson ImmunoResearch	711-165-152
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250
Dyelight 649 anti-ratas	de cabraJackson ImmunoResearch	112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Factores de crecimiento (el contenido se muestra a continuación)	Lonza	CC-4143
Suero fetal bovino 25 ml
Extracto de cerebro bovino 2,0 ml
Sulfato de gentamicina 0,5 ml
Factor de crecimiento epidérmico 0,5 ml
Hidrocortisona 0,5 ml
Penicilina/estreptomicina (10,000 UI Pen/ml, 10,000 µ g Estreptococos/ml)  10.0 ml
EGTA	Sigma-Aldrich	E3884-100G
Obturador electrónico	Instrumento Sutter	77016099
Fibronectina	EMD Millipore	FC010
Glutaraldehído	Thermo Fisher Scientific	S80026
HALT Inhibidor de la proteasa	Thermo Fisher Scientific	PI-78425
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HRP anti-ratón	de cabra Jackson ImmunoResearch	115-036-062
HRP anti-conejo	de cabra Jackson ImmunoResearch	111-036-045
Immuno-Blot Membrana de PVDF	Bio-Rad	162-0174
Lanolina	Thermo Fisher Scientific	8006-54-0
Magnesio sulfato	Sigma-Aldrich	M2643-500G
Microscopio	Nikon TiE	MEA53100
Platina motorizada	ASI Technologies	MS-2000
Medio de montaje	Dako	CS70330-2
Ratón anti-Aurora A	Abcam	ab130156
Ratón anti-GAPDH	Abcam	ab9484
Ratón anti-MCAK	Abcam	ab50778
Ratón anti-tubulina (DM1A)	Tecnología de señalización celular	3873S
uñas	Ciencias de la microscopía electrónica	72180
Software NIS Elements Nikon		MQS310000
Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	Contiene el tampón de electroporación
Parafina	Thermo Fisher Scientific	P31-500
Penicilina-estreptomicina (10.000 UI de pluma/ml, 10.000 µ g Estreptococo/ml)	MP Biomedicals	91670249
Vaselina	Dow Corning	2021854-1113
Pipas	Sigma-Aldrich	P6757-100G
plusTipTracker
Conejo anti-GFP	Abcam	ab290
Conejo anti– pT288– Aurora A	Abcam	ab18318
Rata anti– α-tubulina	AbD Serotec	MCA78G
Borohidruro de sodio	Thermo Fisher Scientific	678-10
Disco giratorio	Andor Technology	Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH	Thermo Fisher Scientific	PI-22589
SuperSignal West Pico Sustrato quimioluminiscente	Thermo Fisher Scientific	34080
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-500
Tripsina	Corning	MT25053CI
Tween-20	Thermo Fisher Scientific	BP337