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Artículo de método

Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)

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DOI:

10.3791/54293

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28 de julio de 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School, 2Department of Biophysics, University of Michigan

En este artículo

Resumen

Ilustramos aquí un ensayo de unión a membranas in vitro en el que las interacciones entre el Gag del VIH-1 y las membranas lipídicas se analizan visualmente utilizando Gag marcado con YFP sintetizado en un sistema de traducción in vitro basado en germen de trigo y GUVs preparados por una técnica de electroformación.

Resumen

La proteína estructural de VIH-1, Pr55 Gag (o Gag), se une a la membrana plasmática en las células durante el proceso de ensamblaje del virus. unión de la mordaza de la membrana es un paso esencial para la formación de partículas de virus, ya que un defecto en los resultados de unión a membrana de la mordaza de deterioro severo de la producción de partículas virales. Para obtener detalles mecanicistas de la membrana interacciones Gag-lípidos, los métodos in vitro basados ​​en RMN, la huella de la proteína, resonancia de plasmones superficiales, centrifugación liposoma de flotación, o perla de lípidos de fluorescencia unión se han desarrollado hasta el momento. Sin embargo, cada uno de estos métodos in vitro tiene sus limitaciones. Para superar algunas de estas limitaciones y proporcionar un enfoque complementario a los métodos previamente establecidos, se desarrolló un ensayo in vitro en el que las interacciones entre el VIH-1 Gag y las membranas de lípidos tienen lugar en un entorno de "célula como". En este ensayo, la mordaza de la unión a las membranas lipídicas se analiza visualmente utilizando YFP-Tagged Gag sintetizado en un germen de trigo-basa en el sistema de traducción in vitro y GUVs preparados por una técnica electroformation. Aquí se describen los antecedentes y los protocolos para obtener proteínas Gag de larga duración myristoylated y membranas GUV necesarios para el ensayo y para detectar la unión mediante microscopía Gag-GUV.

Introducción

virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es un virus con envuelta que se reúne en los brotes y de la membrana plasmática (PM) en la mayoría de tipos de células. El montaje de VIH-1 partículas de virus está impulsado por la proteína del núcleo viral 55 kDa denominado Pr55 Gag (Gag). Gag se sintetiza como una poliproteína precursora compuesta de cuatro grandes dominios estructurales, a saber, matriz, la cápside, la nucleocápside, y p6, así como dos péptidos espaciadores SP1 y SP2. Durante el montaje, la matriz (MA) de dominio es responsable de la orientación de la mordaza para el lugar de montaje, la cápside (CA) de dominio media interacciones Gag-Gag, la nucleocápside (NC) de dominio recluta ARN genómico viral, y factores del huésped p6 reclutas que ayudan escisión de partícula de virus de la membrana plasmática. Gag también sufre una modificación co-traduccional por la adición de un ácido graso de 14 carbonos o resto miristato de en su extremo N-terminal.

unión de la mordaza de la membrana es un requisito esencial para el ensamblaje viral, ya que mutants que son defectuosos en la unión a la membrana no pueden producir partículas de virus. Nosotros y otros han demostrado que la unión de la mordaza está mediada por señales bipartitos dentro del dominio MA membrana: la fracción de miristato de N-terminal que media las interacciones hidrofóbicas con la bicapa de lípidos y un grupo de residuos básicos en el dominio MA denomina como región altamente básica ( HBR) que interactúa con los lípidos ácidos en el PM 1-4. Los estudios de la mordaza de la membrana interacciones utilizando la expresión ectópica de polyphosphoinositide 5-fosfatasa IV (5ptaseIV), una enzima que cataliza la hidrólisis de fosfatidilinositol fosfolípidos ácidos PM-específica (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] a fosfatidilinositol-4-fosfato, en las células sugiere que Gag-PM localización está mediada por PI (4,5) P 2 3,5. Sin embargo, los estudios in vitro con el objetivo de comprender los detalles más mecanicistas de Gag-PI (4,5) P2 interacciones han demostrado ser un reto para un número de razones. porejemplo, la purificación de longitud completa myristoylated VIH-1 Gag para experimentos bioquímicos ha sido técnicamente difícil al menos en parte debido a la tendencia de la mordaza a agregarse durante la purificación. Por lo tanto, las formas truncadas de VIH-1 Gag, como Myr-MA o Myr-MA-CA, o la forma no myristoylated se han utilizado con frecuencia en los estudios que requieren la purificación de la mordaza (por ejemplo, resonancia magnética nuclear, la huella de la proteína, y la superficie resonancia de plasmón 6-9). Alternativamente, acoplados en reacciones de transcripción-traducción in vitro se han utilizado para producir de longitud completa myristoylated VIH-1 Gag en otros estudios bioquímicos 1,2. Típicamente, en este sistema, un plásmido Gag-codificación se transcribe y se traduce con lisados ​​de células eucariotas (por ejemplo, lisados ​​de reticulocitos de conejo) que están desprovistos de cualquier membranas celulares y ARN mensajeros, pero contienen la maquinaria para la transcripción y la traducción. Después de la reacción, los lisados ​​celulares que contienen Gag se mezclan con membranes para el análisis de las interacciones de la mordaza con los lípidos. Además de la facilidad de la preparación de longitud completa myristoylated Gag, los métodos que utilizan el sistema de traducción de la transcripción in vitro tienen una ventaja que la síntesis de Gag y reacciones de unión de membrana posterior se producen en un medio 'eucariota citosol-como "que pueden representar mejor las condiciones fisiológicas. Esta propiedad contribuyó a los estudios que mostraron que las moléculas de ARN unido al dominio MA regulan Gag unión a lípidos ácidas de manera competitiva 1,2,10-12. Sin embargo, ya que la cantidad total de proteínas Gag obtenidos en estos lisados ​​celulares no son altos, marcaje metabólico de las proteínas con aminoácidos radiomarcados es necesaria para su detección.

Dependiendo del método para medir las interacciones Gag-lípidos, se han utilizado una variedad de preparaciones de membrana. Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas y limitaciones. La mayoría de los ensayos basados ​​en RMN requieren el uso de lípidos con acilo cortocadenas que son solubles en agua (por ejemplo, C4 y C8-PI (4,5) P2) 6,8. Si bien los métodos de RMN de ensayo de fijación de la mordaza a los lípidos que tienen cadenas acilo largas que se encuentran en las células están siendo desarrollados, se han utilizado solamente con MA myristoylated o nonmyristoylated hasta ahora 8,13. Alternativamente, los liposomas preparados a partir de lípidos que tienen cadenas de longitud de acilo nativos se han utilizado en los métodos bioquímicos tales como la flotación del liposoma o liposoma de bolas fluorescentes ensayos de unión 2,3,10,14-16. Sin embargo, los liposomas usados ​​en estos ensayos tienen diámetros pequeños, y por lo tanto sus membranas tienen curvaturas pronunciadas y positivos. En contraste, durante la primera fase de ensamblaje de partículas en las células infectadas por VIH-1, Gag se une a la PM, que es casi plano sobre la escala de Gag, y posteriormente induce curvatura negativa durante ciernes. Por lo tanto, las membranas de liposomas con curvatura pronunciada y positivo podría no ser bicapas lipídicas ideales para estudiar las interacciones Gag-lípido. En cuanto a flot liposomaLos ensayos ación, otro posible advertencia es que la exposición de los complejos de lípidos a Gag-gradiente de sacarosa hipertónica durante la centrifugación pueden afectar el resultado experimental. Para aliviar estas limitaciones y proporcionar un sistema experimental complementaria, ensayos para la mordaza de unión a vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se han desarrollado en los últimos años. GUVs son vesículas bicapa de lípidos individuales cuyos diámetros extender a varias decenas de micrómetros. Por lo tanto, la curvatura de estas membranas se asemeja a la PM en la escala de Gag. Por otra parte, debido a su gran tamaño, lo que permite la inspección visual en los microscopios ópticos, membrana de unión a proteínas Gag de fluorescencia etiquetados o marcados para estas vesículas después de la mezcla puede determinarse fácilmente sin el tratamiento posterior de los complejos de la mordaza en lípidos.

Se describen un protocolo para el estudio del VIH-1 de unión utilizando GUVs obtenidos a partir de un método electroformation membrana de la mordaza. Diversos métodos tales como la hidratación suave, gel de hidratación asistida, micrófonochorro rofluidic, y electroformation 17-22 se han utilizado para obtener GUVs. Para el protocolo descrito aquí, el método electroformation se usa principalmente debido a su eficiencia en la formación de GUVs con los lípidos ácidos y su relativa facilidad de uso sin la necesidad de configuraciones de caras. Desde la visualización de Gag requiere un indicador fluorescente, amarillo proteína fluorescente (YFP) se añade genéticamente a la C-terminal de Gag (Gag-YFP). Proteínas Gag-YFP se obtienen in vitro de transcripción y traducción reacciones en trigo en lisados ​​de germen basado en la tecnología continua de cambio de flujo continuo (CECF). En esta tecnología, tanto la eliminación de subproductos inhibidores de las reacciones y de suministro de sustratos de reacción y componentes de energía se consigue en un mecanismo basado en diálisis. Para estas reacciones, se utiliza un plásmido que codifica Gag-YFP bajo el control de un promotor T7. Es de destacar que, como se ha mostrado anteriormente, lisados ​​de germen de trigo apoyan miristoilación sin componentes adicionales 23,24. Usando este método, ha sido posible obtener cantidades suficientes de longitud completa myristoylated Gag-YFP para la visualización de la mordaza sobre las membranas GUV 24. A continuación se describe el protocolo con el que el VIH-1 Gag unión a PI (4,5) P2 -Con membranas GUV puede ser examinado sin un procesamiento más largo subsecuente siguiendo reacciones de unión y proponer que este método complementa preexistente Gag-membrana ensayos de unión y puede ser extendido para comprender mejor el VIH-1 Gag-membrana de unión.

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Protocolo

Día 1: Expresión de la mordaza de proteínas usando el basado en lisado de germen de trigo in vitro transcripción-traducción Sistema

1. Preparación de VIH-1 Gag

  1. Retire todos los reactivos del kit FBEC germen de trigo comercial del congelador (lisados ​​de germen de trigo se almacenan a -80 ºC; otros reactivos a -20 ºC). Descongelar en hielo y mezclar los componentes como se muestra en la Tabla 1.
Mix-1 (La alimentación de la mezcla)
solución de alimentación 900 l
Aminoácidos 80 l
metionina 20 l
Total 1.000 l
Mix-2 (lisado de la mezcla)
lisados ​​de germen de trigo 15 l
RNasa libre de agua 7 l
Aminoácidos 4 l
metionina 1 l
El ADN de plásmido en tampón TE (1 g / l) ** 4 l
tampón de reacción 15 l
RNasin * 4 l
Total 50 l

Tabla 1: Composiciones de mezclas requeridas para las reacciones de germen de trigo.
Nota: Si el experimento se diseñó para examinar el efecto de la eliminación del RNA por RNasa en unión a la membrana de la mordaza, reemplazar los inhibidores de ribonucleasa con agua libre de RNasa. El ADN del plásmido debe estar libre de impurezas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Sin embargo, plasmids preparar usando convencional, pero no, kits de aislamiento de plásmidos por endotoxinas libres se han utilizado con éxito. las instrucciones del fabricante también recomienda el uso de ADN disuelto en agua libre de nucleasa. Si el uso de ADN en suspensión en TE [10 mM Tris-HCl (pH 7,4) que contiene EDTA 1 mM], evitar el uso de menores concentraciones de ADN, ya que EDTA en TE puede afectar el rendimiento. Los plásmidos disueltos en tampón TE a una gama de concentración de 0,8-1 g / l han utilizado con éxito.

  1. Primero se debe agregar la mezcla de alimentación (Mix-1) en el cassette de reacción (cámara transparente). A continuación, añadir la mezcla de lisado (Mix-2) a la otra cámara (rojo). No introducir burbujas, mientras que la adición de las mezclas en sus respectivas cámaras, ya que puede dar lugar al intercambio ineficaz de los componentes de la solución y por lo tanto reducir la eficacia de la reacción.
  2. Cubrir las cámaras con la película adhesiva suministrada con el kit.
  3. Inserte la cinta de reacción en el soporte de cassette y Incubadoraste el conjunto durante 24 horas a 24 ºC a una velocidad de agitación constante de 900 rpm en un Eppendorf Thermomixer R.

Día 2: Preparar GUVs por Electroformation y Harvest lisados ​​de germen de trigo

2. Preparación de GUVs

  1. lípidos alícuotas disueltos en disolventes inorgánicos tales como cloroformo o mezclas de cloroformo y metanol en viales de vidrio con tapones de rosca alineados con revestimientos de teflón y envueltos con Parafilm. Manejar los lípidos con jeringas de vidrio de tipo Hamilton, o si están disponibles, puntas de plástico de cloroformo-resistente. Sacar viales de vidrio que contienen los lípidos para ser utilizado para la preparación de la GUV -20 ºC congelador.
    1. Una vez que los viales se equilibraron a temperatura ambiente, asegurarse mediante inspección visual de que las suspensiones de lípidos son claras. La calidad de los lípidos, en particular los lípidos ácidos, tales como fosfatidilserina palmitoil-oleoil (POPS) y PI (4,5) P 2, es importante para experimentos exitosos. No utilice los lípidos que se encuentranen alícuotas durante más de 2 meses.
  2. Pre-calentar un bloque de calor a la temperatura deseada. Esta temperatura debe ser al menos 5 ºC mayor que la temperatura de fusión (Tm) del lípido (s) con la más alta T m.
  3. Calcular los volúmenes de lípidos necesarios de acuerdo con las proporciones molares de lípidos deseados. Para el estudio de la unión aquí el VIH-1 Gag, utilice las siguientes relaciones molares como se muestra en la Tabla 2.
+ 20 + 40 + 30 10
mezcla de lípidos Relación molar Volumen (en l) de la concentración
POPC + + POPS Chol 46,6 + 23,3 + 30 19.74 + 10.18 + 6.57 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
POPC + + POPS Chol + Cerebro-PI (4,5) P2 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
Cerebro-PI (4,5) P2: 1 mg / ml

Tabla 2: Los volúmenes de diferentes lípidos utiliza para obtener GUVs.

  1. Añadir los volúmenes deseados de lípidos en un vial de vidrio con tapón de rosca limpia.
  2. Toboganes de dimensiones 25 x 50 x 1,1 mm 3 y la resistencia 70-100 Ohmio (como se describe en el catálogo) Uso ITO-revestido. Coloque dos portaobjetos recubiertos con ITO en un banco limpio. Cada cámara electroformation requiere dos-estaño-óxido de indio (ITO) portaobjetos de vidrio recubiertas. Compruebe que el lado conductor de la lámina de vidrio se encuentre hacia arriba mediante la comprobación de la resistencia con un multímetro. Debe mostrar un valor de aproximadamente 200 Ω. Asegúrese de que la superficie de las diapositivas son limpios frotándolos suavemente con etanol al 70%, utilizando toallitas sin pelusa.
  3. Limpiar la superficie exterior de una aguja de una jeringa por rinsing con cloroformo y coloque la jeringa en el bloque de calor.
  4. Coloque un nuevo portaobjetos de vidrio recubierto con ITO en el bloque de calor con el lado conductor hacia arriba y deje que se equilibre a la temperatura deseada por lo general alrededor de 2-3 minutos. No vuelva a utilizar las placas de vidrio recubiertas con ITO para un riesgo potencial de que el ITO-recubrimiento sobre los portaobjetos de vidrio podría ser dañado durante los procedimientos de limpieza.
  5. Use un volumen de 40-50 l de la mezcla de lípidos para cada diapositiva para el uniforme y sin embargo rápida propagación de los lípidos en el portaobjetos de vidrio. Ajustar el volumen total con un disolvente orgánico apropiado tal como cloroformo.
    1. Coloque una media del volumen total de la mezcla de lípidos en el portaobjetos de vidrio y se extendió inmediatamente el lípido utilizando la jeringa limpiado (paso 2.6) para dejar una película de lípidos uniforme (que se mueve la aguja 2-3 veces a través de la corredera). Corre la película lipídica suavemente (pero rápidamente) para evitar cualquier daño a la capa de ITO delgada. No uniforme difundir o propagar áspera puede llevar a un nivel óptimorendimientos o heterogeneidad computacional de GUVs.
    2. Por lo tanto, garantizar la propagación uniforme mediante la inspección de la película de lípido después de extenderse antes de proceder con el paso siguiente. Si la opacidad de la película aparece excesivamente no uniforme, vuelva a realizar el procedimiento utilizando una nueva diapositiva.
  6. Colocar el portaobjetos recubierto dentro de un plato de Petri con el lado recubierto hacia arriba.
  7. Repetir los pasos 2.6 a 2.9 para el resto de la mezcla utilizando otra diapositiva recubierto con ITO.
  8. Coloque la placa de Petri que contiene tanto los portaobjetos en una cámara de desecación de vacío convencional durante 60-90 min para eliminar cualquier traza de disolventes orgánicos.
  9. Durante este proceso, establecer la incubadora a la misma temperatura que la del bloque de calor (65 ° C en la mayoría de los casos) y pre-calentamiento a 300 mM de solución de sacarosa en la incubadora.
  10. Después del secado, llevar la placa de Petri a la banca y colocar la lámina de vidrio sobre una superficie limpia.
  11. Limpiar suavemente una junta de PDMS (Figura 1) con 70% de etanol y se seca completamente.
  12. Colocarlo en el portaobjetos de vidrio recubiertos con lípidos, como se muestra en la Figura 1 y suavemente y presione firmemente para que los junta forma un sello hermético. Confirmar la ausencia de huecos entre la junta de PDMS y la corredera. Esto da como resultado la formación de una cámara poco profunda que contiene la solución de sacarosa.

figure-protocol-1
Figura 1:. El diseño de la placa de vidrio recubierto con ITO utilizado para electroformation Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Llenar la cámara con una solución de sacarosa pre-calentado, sin burbujas.
  2. Coloque el otro portaobjetos recubierto en la parte superior para hacer un sello hermético. Asegúrese de que no hay burbujas. El montaje final debe aparecer como se muestra en la Figura 2. Fije la cámara de usinclips g aglutinante.

figure-protocol-2
Figura 2:. Representación esquemática de la cámara de electroformation (vista lateral) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Eliminar el exceso de sacarosa por aspiración y limpiar las diapositivas utilizando toallitas sin pelusa. Sujetar las diapositivas a la barra de cobre de modo que las partes conductoras están en contacto uniforme con la barra. Asegúrese de que sólo un lado conductor de la placa de vidrio está en contacto con una barra de cobre.
  2. Conectar la barra de cobre a la salida del generador de funciones utilizando las pinzas de cocodrilo. Coloque el conjunto dentro de la incubadora para permitir el montaje se equilibre a la temperatura deseada.
  3. Aplicar una frecuencia de onda sinusoidal de 10 Hz y una diferencia de potencial de 1 V por 90 min. ensure que la tensión es de 1 V por un multímetro como se muestra en la Figura 3. Continuar el proceso de 90 min.

figure-protocol-3
Figura 3:. Las posiciones en las que se colocan los electrodos del multímetro para medir la frecuencia y la corriente Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Después de 90 min, disminuir lentamente la frecuencia de 2 Hz y continuar electroformation durante otros 10 minutos. Durante este tiempo, la cosecha en reacciones de traducción in vitro (pasos 3.1 a 3.2).
  2. Desconectar el generador de funciones y deje que el conjunto se enfríe a temperatura ambiente lentamente (apagando la incubadora y dejando la puerta ligeramente abierta incubadora).
  3. Después de enfriar, desconectar los cables al generadorde las correderas. GUVs puede ser muy frágil y por lo tanto necesitan ser manejados con mucho cuidado. Con precaución, el conjunto de la banca.
  4. Desmontar la cámara quitando suavemente el carro superior con unas pinzas. Cosechar la suspensión que contiene GUVs sacarosa utilizando una punta de corte de 1.000 l y transferir a un tubo limpio. Manejar el tubo suavemente para evitar interrupciones de GUVs.
  5. Usa los GUVs inmediatamente. GUVs son estables durante al menos 90 min después de la cosecha cuando se almacena a temperatura ambiente.

3. Las reacciones de traducción in vitro de la cosecha

  1. Cosecha de las reacciones de traducción in vitro que contienen las proteínas deseadas de la cámara de rojo utilizando una micropipeta en un tubo.
  2. Para eliminar las proteínas agregadas, girar los lisados ​​a 16.200 xg durante 15 min en una centrífuga de mesa y transferir cuidadosamente el sobrenadante a otro tubo.

4. Ensayo de unión GUV

  1. Con una punta de corte, mezcla 51; l de reacciones de traducción in vitro que contienen proteínas traducidas y 5 l de GUVs en un tubo y se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 min.
  2. Adjuntar una hoja de PDMS con un agujero pequeño (3-4 mm de diámetro) en una hoja de la cubierta limpia y asegurar un sellado hermético presionando suavemente y firmemente contra el cubreobjetos.
  3. Coloque la mezcla de 10 l de la etapa 4.1 en el pequeño orificio.
  4. Image la mezcla bajo un microscopio de fluorescencia confocal invertido epi- o a temperatura ambiente.
    Nota: Para evitar la evaporación, la cámara de formación de imágenes puede ser cubierto por un cubreobjetos.

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Resultados

Utilizando el protocolo anterior, hemos preparado GUVs compuestos de POPC + POPS + Chol (relación molar: 4,66: 2,33: 3). Esta composición fue elegida para representar aproximadamente las concentraciones de colesterol y PS de la PM. Robusto y eficiente de unión de Gag se observó sólo cuando el cerebro-PI (4,5) P2 se incluyó en la mezcla de POPC + + POPS Chol-PI cerebro (4,5) P2 [relación molar (POPC + POPS + + Chol : 4: 2: 3: 1] en este ejemplo) (Figura...

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Discusión

El ensayo de unión GUV como se describe anteriormente proporciona una buena alternativa en escenarios en los otros ensayos de interacción proteína-lípido tienen sus limitaciones. Este ensayo nos permite examinar las interacciones entre myristoylated la mordaza de cuerpo entero y ácidos lípidos con cadenas de acilo de longitud nativa en el contexto bicapa lipídica y lo hacen sin larga centrifugación de flotación a través de gradientes de sacarosa de alta densidad u otro tratamiento posterior a la unión de Gag-lípido comp...

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Divulgaciones

Declaramos que no tenemos intereses en conflicto.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a Mohammad Saleem, Jing Wu y Krishnan Raghunathan útil para los debates. También se agradece a Priya Begani de asistencia durante el rodaje. Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 AI071727 (AO) y R01 GM110052 (a SLV).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Multímetro digitalMeterman30XRUn multímetro genérico que puede medir la resistencia y los voltios servirá para este propósito.
Generador de funcionesInstekGFG-8216AUn generador de funciones genérico que sea capaz de generar una onda sinusoidal a 10 Hz y 1 V es suficiente.
Portaobjetos de vidrio recubierto ITODelta Technologies, Loveland, COCG-90IN
IncubadoraHoeferCualquier incubadora que pueda mantener la temperatura con precisión será suficiente
Cámara de vacíoNalgene
Thermomixer REppendorf21516-166
JeringaHamilton80400Calibre 22S, número de jeringa 702
Kit base de elastómero PDMS Sylgard, Dow-CorningSylgard, 184
RTS 100 Kit CECF de germen de trigoBiotechRabbit,
Berlín, Alemania		BR1401001
DiDLife Technologies, Carlsbad, CA D7757
POPCAvanti Lípidos Polares, Alabastro, AL 850457C
POPSAvanti Lípidos Polares840034C
ColesterolAvanti Lípidos Polares700041P
Cerebro-PI(4,5)P2 Avanti Lípidos Polares840046X

Referencias

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