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Artículo de método

Borrado de imágenes embrionario y postnatal Corazones en la Resolución de celda única

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DOI:

10.3791/54303

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7 de octubre de 2016

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1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo para obtener imágenes volumétricas de células marcadas con proteínas fluorescentes en el interior de corazones embrionarios y postnatales intactos. Utilizando métodos de limpieza de tejidos en combinación con la tinción de montaje completo, se pueden obtener imágenes claras y precisas de células marcadas con proteínas fluorescentes individuales dentro de un corazón embrionario o posnatal.

Resumen

Un solo trazado clonal y el análisis a nivel de todo el corazón pueden determinar el comportamiento de células progenitoras cardíacas y diferenciación durante el desarrollo cardíaco, y permitir el estudio de las bases celulares y moleculares de la morfogénesis cardíaca normal y anormal. Recientes tecnologías emergentes de los análisis retrospectivos clonales individuales hacen que el estudio de la morfogénesis cardíaca a una resolución de una sola célula viable. Sin embargo, la opacidad del tejido y dispersión de la luz del corazón como la profundidad de imagen se aumenta la imagen de todo el corazón obstaculizar a una resolución de una sola célula. Para superar estos obstáculos, un sistema de compensación de todo el embrión que puede hacer que el corazón de gran transparencia, tanto para la iluminación y detección deben ser desarrollados. Afortunadamente, en los últimos años, se han reportado muchas metodologías para sistemas de compensación de todo el organismo, tales como la claridad, le Sca, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cúbico, DBE, Babb y PACT. Este laboratorio está interesado en los mecanismos celulares y moleculares de la tarjetamorfogénesis IAC. Recientemente, hemos establecido el linaje de células individuales de rastreo a través de la ROSA26-Cre ERT2; sistema de ROSA26-confeti a las células de la etiqueta escasamente durante el desarrollo cardíaco. Se adaptó varias metodologías integrales de embriones de compensación, incluida Sca-le-(y, cócteles de imágenes cerebrales sin obstáculos claros y análisis computacional) CÚBICAS para despejar el embrión en combinación con toda la tinción de montaje de imagen clones individuales dentro del corazón. El corazón fue fotografiada con éxito en la resolución de una sola célula. Se encontró que Sca le puede borrar el corazón embrionario, pero no puede limpiar con eficacia el corazón postnatal, mientras CUBIC puede limpiar el corazón postnatal, pero daña el corazón embrionario disolviendo el tejido. Los métodos descritos aquí permitirán el estudio de la función de genes en una sola resolución clon durante la morfogénesis cardíaca, la cual, a su vez, puede revelar las bases celulares y moleculares de los defectos congénitos del corazón.

Introducción

Morfogénesis cardíaca es un evento secuencial que requiere la organización espacio-temporal de cuatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas en sectores distintos del corazón, y también requiere múltiples redes de regulación genética para orquestar este proceso para formar la 1,2 corazón funcional. Cardiaco especificación, diferenciación, patrones, y la maduración de cámara están regulados por factores de transcripción cardiogénico 3. Mutación genética o la aberración postranscripcional de estos factores en las células progenitoras cardiacas podrían resultar en la letalidad embrionaria o defectos congénitos del corazón (CHD) 4. El estudio de la morfogénesis cardíaca requiere una comprensión de los detalles inherentes estructurales en tres dimensiones (3D) y solo linaje de células progenitoras cardíacas etiqueta de rastreo durante el desarrollo cardiaco promoverá la comprensión de la morfogénesis cardíaca. Una serie de métodos basados ​​sección de tomografía de alta resolución se han desarrollado en THe últimos años, que la estructura del órgano de imagen 5,6; Sin embargo, estos métodos requieren instrumentos especializados, costosos y extensa de trabajo, y carecen de organización estructural detallado en la resolución de las células del volumétrica final de la imagen reconstruida 7,8.

De imagen volumétrica en 3D en el nivel de células individuales proporciona un medio para estudiar la diferenciación de células progenitoras y el comportamiento celular in vivo 7. Sin embargo, la dispersión de luz de tejido sigue siendo el principal obstáculo para imágenes de células y estructuras en 3D en el interior del corazón intacto. Los lípidos son una fuente importante de dispersión de la luz, y la eliminación de lípidos y / o el ajuste de la diferencia de índice de refracción entre los lípidos y sus alrededores son posibles enfoques para aumentar la transparencia del tejido 8. En los últimos años, se han desarrollado una serie de métodos de compensación de tejido, lo que reduce la opacidad del tejido y la dispersión de la luz, como Babb (alcohol bencílico y benzoato de bencilomezcla e) y DBE (tetrahidrofurano y dibenzylether); pero en estos métodos, extinción de fluorescencia sigue siendo un problema 8-10. El disolvente basa métodos hidrófilos, tales como SeeDB (fructosa / tioglicerol) y 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), preservar señales fluorescentes, pero no hacen que el conjunto del órgano transparente 7,8,11. En comparación, el método de limpieza de tejido CLARITY hace que el órgano transparente, pero requiere un dispositivo de electroforesis especializado para eliminar los lípidos de 8,12, como lo hace PACT (técnica de claridad pasivo), que también requiere la incorporación de hidrogel 7,13. Para obtener información detallada acerca de todos los métodos de limpieza de tejidos disponibles, consulte la Tabla 1 en Richardson y Lichtman, et al. 7.

En 2011, Hama et al. Serendipitously descubrió una mezcla hidrófila 'Sca le' (urea, glicerol y Triton X-100 mezcla) que hace que el cerebro de ratón y embrión transparent preservando al mismo tiempo completamente señales fluorescentes a partir de clones marcados 14. Esto permite la formación de imágenes del cerebro intacto a una profundidad de varios milímetros y reconstrucción a gran escala de poblaciones neuronales y proyecciones con una resolución subcelular. Susaki et al. aún más mejorada Sca le mediante la adición de aminoalcoholes y desarrolló el (claras, cócteles sin obstáculos de imágenes cerebrales y análisis computacional) '' CÚBICAS método de compensación de tejido, lo que aumentó la solubilización de fosfolípidos, un reducido tiempo de compensación, y se deja para la imagen multicolor fluorescente 8. En el presente estudio, aprovechando la Sca LE y técnicas de limpieza y eliminación de tejido cúbico y alta resolución en 3D seccionamiento óptico, clones individuales dentro del corazón durante cardiogénesis se trazaron utilizando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-confeti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, NFATc1 Cre-19, y Rosa26-mTmG (mTmG) 20 líneas de ratón. La combinación del método de tinción conjunto de montaje (WMS) desarrollado previamente 21,22 con los métodos de limpieza y eliminación de tejido permitidos adicional para la tinción de otras proteínas en clones etiquetados y para el estudio de su comportamiento en un contexto volumétrica 3D. La combinación de la limpieza de tejidos y WMS permite una mejor comprensión de las funciones de los diferentes genes y proteínas durante el desarrollo cardiaco, y la etiología de los defectos congénitos del corazón. Este protocolo se puede aplicar para estudiar otra diferenciación de células progenitoras, el comportamiento celular, y eventos morfogénesis de órganos durante el desarrollo.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en Albany Medical College y llevaron a cabo de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Preparación de soluciones

NOTA: El Rosa26Cre ERT2 15, R26R-16 confeti, αMHC Cre-17, y Rosa26-mTmG (mTmG) 20 líneas de ratón se adquirieron comercialmente cTnT Cre-18 fue un regalo del doctor Jiao en la Universidad de Alabama NFATc1-Cre.. fue un regalo del doctor Bin Zhou en el Albert Einstein College of Medicine 19. Los ratones fueron sacrificados por inhalación de dióxido de carbono en una cámara cerrada durante al menos 60 segundos, seguido por medios físicos de verificación muerte por toracotomía bilateral, decapitación o dislocación cervical.

  1. Preparar tamoxifeno. Disolver 10 mg de tamoxifeno en 10 ml de OI de semilla de girasoll. Una vez que esté completamente disuelta, alícuota y se almacena a -20 ° C.
  2. Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS). Disolver Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) y KCl (0,20129 g) en 1 L de agua destilada y ajustar el pH a 7,4.
  3. Preparar PBST: 0,1% de solución de Tween-20 en PBS disolviendo 100 l de Tween-20 en 100 ml de PBS.
  4. Preparar el tampón de bloqueo. Hacer 3% de albúmina de suero bovino (BSA) solución de bloqueo por disolución de 3 g de BSA en 100 ml de PBST que contenía 0,2% de Tween-20.
  5. Preparar CUBIC-1 (reactivo 1). Mezclar 25% en peso de urea, N, N, N ', N'-tetrakis etilendiamina 25% en peso (2-hidroxipropil) y 15% en peso de Triton X-100 en dH 2 O.
  6. Preparar CUBIC-2 (reactivo 2). Mezclar 50% en peso de sacarosa, 25% en peso de urea, 10% en peso de 2, 2 ', 2' '- nitrilotrietanol y 0,1% (v / v) de Triton X-100 en dH 2 O.
  7. Preparar Sca le A2: 4 M urea, 10% w / v de glicerol y 0,1% w / v Triton X-100 en dH2O Ajustar el pH a 7,7.
  8. Preparar Sca le B4: urea 8 M y 0,1% w / v Triton X-100 en dH 2 O. Ajustar el pH a 8,7.
  9. Preparar Sca le 70: 4 M urea, 70% w / v de glicerol y 0,1% w / v Triton X-100 en dH 2 O.

2. El tamoxifeno inducción, aislamiento de los embriones y Fijación

  1. El tamoxifeno Inducción y aislamiento de los embriones
    1. El uso de un protocolo aprobado tubo de alimentación curvada (ACUP 13-12.007), alimentación forzada de los ratones hembra R26Cre ERT2 confeti (tapado por los ratones macho R26Cre ERT2) con 10 mg / g de tamoxifeno en el desarrollo embrionario día 33 E7.75. En el día embrionario 9.5 (E9.5) o E10.5, la eutanasia a los ratones hembra con CO2 y dislocación cervical.
    2. Después de la verificación de la muerte del ratón (véase la Sección 1 Nota), abrir la cavidad abdominal del ratón con unas tijeras y diseccionar el cuerno uterino, eliminar las capas de tubos uterina con la ayuda de tijeras y pinzas, y rearrendar los embriones del 23,24 trompa uterina.
      1. La transferencia de los embriones para una placa de Petri que contiene PBS (pH 7,4). Bajo el microscopio de disección, eliminar las capas no embrionarias (corion, amnios y el saco vitelino) con la ayuda de unas pinzas.
    3. El uso de pinzas y tijeras, recoger las muestras de hembras de ratón y de la cola del embrión para la genotipificación como se informó anteriormente 22. Usando una pipeta de plástico, la transferencia de cada embrión a un pocillo de una placa de 48 pocillos que contenía 1 ml de 1x PBS.
    4. Bajo un microscopio de fluorescencia, identificar las GFP / RFP / embriones de la PPC positivos a través de un microscopio invertido con una cámara. Despegue del pericardio mediante pinzas y gire el corazón / embrión con la ayuda de unas pinzas curvas, para determinar el número de clones fluorescentes en ambos lados del corazón con los filtros GFP / RFP / CFP. No se necesitan cortes.
  2. Después de identificar GFP / RFP / embriones positivos de la PPC, lavar rápidamente los embriones dos veces (2 minutos cada uno) con 1 x PBS en THe-48 así placa en un agitador de placas a temperatura ambiente (TA). Esto eliminará el exceso de sangre.
  3. Fijar el embrión corazón / embrionario usando 4% de paraformaldehído (PFA) a TA. El tiempo de fijación depende de la edad y el tejido tamaño embrionario. Para E9.5 fijar el embrión durante 2 horas a RT. A finales de los embriones en etapa embrionaria requieren tiempo de fijación más largo, que incluso se pueden prolongarse hasta 24 horas para el corazón posnatal.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico, evite el contacto con la piel, los ojos y las membranas mucosas.
  4. Después de la fijación, lavar el embrión / el corazón en la placa de pocillos 48 dos veces (10 min cada una) con 1 x PBS en un agitador de placas a temperatura ambiente. Esto elimina el exceso de PFA a partir del embrión / corazón. Los embriones se procesan adicionalmente para toda la tinción de montaje y la limpieza de tejidos.

3. Todo el montaje de tinción

NOTA: Después de la fijación del embrión PFA / corazón se somete a toda la tinción de montaje de la siguiente manera.

  1. Permeabilizar el embrión / corazón en una placa de pocillos 48 por medio de 1 ml de 0,1% PBST durante 2 horas en un agitador de placas a temperatura ambiente.
  2. Tras la permeabilización, sumergir el embrión / corazón en 1 ml de tampón de bloqueo, durante 2 horas o durante la noche en un agitador de placas a 4 ºC.
  3. Sumergir el embrión / corazón a la PECAM anticuerpo específico de células endoteliales (CD31), diluido (1: 100) en 0,3 ml de tampón de bloqueo durante 48 horas en un agitador de placas a 4 ºC.
  4. Lavar el embrión / corazón usando PBST 5 veces, 30 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador de placas. Esto elimina el anticuerpo primario unido no específica exceso del tejido.
  5. Sumergir el embrión / corazón en Alexa Fluor 647 de cabra anti-rata anticuerpo secundario, se diluyó (1: 1000) en 1 ml de tampón de bloqueo durante 48 horas en un agitador de placas a 4 ºC.
  6. Repita el paso 3.4 para lavar el anticuerpo secundario.
  7. Post-solucionar el embrión / corazón con 4% PFA durante 1 hora a RT en un agitador de placa y lavar dos veces con PBS 5 min cada uno.
  8. Teñir el embrión / corazón con la mancha nuclear 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (diluido en PBST a una concentración de 0,01 mg / ml) durante 10 minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente. Siga con dos lavados de PBS de 5 minutos cada uno.

4. Embriones / Compensación corazón con Sca l eo Método CÚBICO

NOTA: Después de toda la tinción de montaje, el embrión / corazón se somete a cualquiera de las Le Sca o método de compensación de tejidos cúbica. La elección del método depende del tamaño del tejido y de la edad embrionaria. Por E11.5 embriones o edad más temprana, e l método de limpieza de tejidos uso Sca, mientras que para los embriones de más edad o corazones postnatales se prefiere el método de compensación de tejidos cúbica.

  1. Tejido escala Método de Compensación
    1. Se incuba el embrión / corazón con 1 ml de solución de e A2 Sca l en un vial de centelleo (envueltos en papel de aluminio) con ocasional agitación suave (con la mano) durante 48 horas a 4 ° C.
    2. Después de la incubación Sca l e A2, se incuba el embrión / corazón con 1 ml de solución de e B4 Sca l a 4 ° C en el mismo vial con agitación suave ocasional para anotsu 48 hr.
    3. Incubar el embrión / corazón para otro 48 horas con 1 ml Sca l e 70 a 4 ° C con agitación suave ocasional. Monte embrión utilizando glicerol al 90% (ver sección 5.1).
  2. Método de Compensación de tejidos cúbica
    1. Para el conjunto del embrión / compensación CÚBICO corazón, sumerja cada embrión / corazón en 1 ml de CUBIC-1 con ocasional agitación suave durante 48 horas a 37 ºC 7. Después de 48 horas, vuelva a colocar la solución con el mismo volumen de reactivo CÚBICO fresca 1, e incubar la muestra durante 48 horas adicionales a 37 ° C con agitación ocasional con la mano.
    2. Lavar la cúbica-1 tratada corazón / embrión con 1x PBS varias veces a temperatura ambiente con agitación suave con la mano. Esto elimina el exceso de solución CUBIC-1.
    3. Después de lavar a cabo cúbicas 1 con PBS, sumerja los embriones / corazones en solución CUBIC-2 (1 g por embrión / corazón) durante 48 horas a 37 ºC con ocasional agitación suave con la mano. Esto se deduce de montaje utilizando glicerol embrión / corazón (véase la sección 5.2).

5. Montaje de la muestra e Imagen

NOTA: Los embriones u órganos despejados en Sca l e 70 o solución CUBIC-2 se pueden obtener imágenes directamente con la escala 70 y la solución CUBIC-2 como el medio de imágenes, respectivamente. Sin embargo, teniendo en cuenta la vulnerabilidad de las muestras embrionarias para reactivos de compensación, si las muestras no se obtenerse imágenes de inmediato, sino que se almacena a largo plazo, almacenar las muestras en glicerol al 90% siguiendo el protocolo a continuación.

  1. Directamente sumerja el Sca le sacó la muestra en 1 ml de glicerol al 90% y se almacena a 4 ° C hasta el momento de formación de imágenes.
  2. Lavar la muestra tratada cúbicos con 1x PBS dos veces, 5 minutos cada uno y se incuban secuencialmente la muestra con 1 ml de 30%, 50%, 70% y solución de glicerol al 90% cada uno por 30 min.
  3. Para formación de imágenes, transferir la muestra a fondo de cristal placa de Petri con una cantidad mínima de 90% de glicerol y de imagen clones con un microscopio confocal equipado con dos capacidades de fotones.
  4. Image el corazón o el embrión en el glicerol con un / 0.3 NA 10X, una inmersión NA 25X / 0.8, o una lente de objetivo 40X correctiva / 1,2 NA agua. Imagen usando DAPI de excitación de 2 fotones de una coherente de titanio: zafiro láser camaleón. La elección de microscopio y la lente objetivo dependerá de la finalidad de los experimentos, por ejemplo para super-resolución, un microscopio de fluorescencia de lámina de luz podría ser utilizada.

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Resultados

Obtención de imágenes del corazón embrionario aclarado

La formación del corazón de los vertebrados es un proceso morfogenética espaciotemporalmente regulado y depende de la organización y la diferenciación de las células progenitoras de cuatro fuentes diferentes 1. Las células del primer campo corazón de la media luna cardiaca se pliegan hacia la línea media ventral para formar un tubo lineal corazón. Las células de...

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Discusión

El aislamiento de embriones es un paso muy crítico. E9.5 embriones son muy frágiles y de tamaño pequeño, por lo que la atención deberá tener precaución de no dañar las estructuras del embrión / corazón durante el aislamiento. Las capas adicionales no embrionarias que envuelve el embrión / corazón deben eliminarse cuidadosamente mediante la formación de imágenes sobre todo cuando todo el embrión. Esto permite la penetración mezcla de anticuerpos y la limpieza en el interior de los tejidos embrionarios, y también ayuda en...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del laboratorio M.W. por la discusión científica. Este trabajo cuenta con el apoyo de la AHA [13SDG16920099] para M.W., y por las subvenciones del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre [R01HL121700] para M.W. Las imágenes se capturaron en el Centro de Imágenes del Colegio Médico de Albany.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2,2′,2′ '-nitrilotriethanol Sigma Aldrich90279
4% de paraformaldehído en PBSAffymetrix19943
BSAFischer Scientific 
N,N,N',N'-tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiamina Sigma Aldrich122262
Tampón de fosfato salinoSigma AldrichP5368-10PAK
Triton  X-100Sigma AldrichT8787
UreaSigma AldrichU-1250
SacarosaSigma Aldrich84097
GlicerolSigma AldrichG8773
TamoxifenoSigma AldrichT5648
Aceite de semilla de girasolSigma AldrichS5007
Tween 20Sigma AldrichP1379
PECAM (CD31)BD Pharmingen 
Alexa Fluor 647 InvitrogenA-21247
DAPI tinción nuclearSigma AldrichD9542
37oCIncubadora Termocientífica FischerHeratherm, Incubadoras
placas de pocillosCell Treat229148
Balanza analíticaMetler ToledoPB153-S/FACT
Confocal microscopioZeissZeiss 510 microscopio
Microscopio de disecciónUnitronZ850
Microscopio fluorescenteZeissObserver. Z1
Germinador 500 Esterilizador de cuentas de vidrioCellPoint ScientificGER-5287-120V
Fuente de luzSCHOTTACE I
Par de tijerasFine Science Tools14084-08
Placa de Petri 60 mm x15 mm TPP Techno Plastic Products AG93060
Balancín II  Balancín de plataformaBoekel Scientific260350
Tubos centelleantesFischer Scientific 03-337-26
Pipeta de transferenciaSamco Scientific202
PinzasFine Science Tools11251-20
BP16000550274Microbiológicas Compactas 48 confocal

Referencias

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