Artículo de método

Borrado de imágenes embrionario y postnatal Corazones en la Resolución de celda única

DOI:

10.3791/54303

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7 de octubre de 2016

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1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

En este artículo

Resumen

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Describimos un protocolo para obtener imágenes volumétricas de células marcadas con proteínas fluorescentes en el interior de corazones embrionarios y postnatales intactos. Utilizando métodos de limpieza de tejidos en combinación con la tinción de montaje completo, se pueden obtener imágenes claras y precisas de células marcadas con proteínas fluorescentes individuales dentro de un corazón embrionario o posnatal.

Resumen

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Un solo trazado clonal y el análisis a nivel de todo el corazón pueden determinar el comportamiento de células progenitoras cardíacas y diferenciación durante el desarrollo cardíaco, y permitir el estudio de las bases celulares y moleculares de la morfogénesis cardíaca normal y anormal. Recientes tecnologías emergentes de los análisis retrospectivos clonales individuales hacen que el estudio de la morfogénesis cardíaca a una resolución de una sola célula viable. Sin embargo, la opacidad del tejido y dispersión de la luz del corazón como la profundidad de imagen se aumenta la imagen de todo el corazón obstaculizar a una resolución de una sola célula. Para superar estos obstáculos, un sistema de compensación de todo el embrión que puede hacer que el corazón de gran transparencia, tanto para la iluminación y detección deben ser desarrollados. Afortunadamente, en los últimos años, se han reportado muchas metodologías para sistemas de compensación de todo el organismo, tales como la claridad, le Sca, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cúbico, DBE, Babb y PACT. Este laboratorio está interesado en los mecanismos celulares y moleculares de la tarjetamorfogénesis IAC. Recientemente, hemos establecido el linaje de células individuales de rastreo a través de la ROSA26-Cre ERT2; sistema de ROSA26-confeti a las células de la etiqueta escasamente durante el desarrollo cardíaco. Se adaptó varias metodologías integrales de embriones de compensación, incluida Sca-le-(y, cócteles de imágenes cerebrales sin obstáculos claros y análisis computacional) CÚBICAS para despejar el embrión en combinación con toda la tinción de montaje de imagen clones individuales dentro del corazón. El corazón fue fotografiada con éxito en la resolución de una sola célula. Se encontró que Sca le puede borrar el corazón embrionario, pero no puede limpiar con eficacia el corazón postnatal, mientras CUBIC puede limpiar el corazón postnatal, pero daña el corazón embrionario disolviendo el tejido. Los métodos descritos aquí permitirán el estudio de la función de genes en una sola resolución clon durante la morfogénesis cardíaca, la cual, a su vez, puede revelar las bases celulares y moleculares de los defectos congénitos del corazón.

Introducción

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Morfogénesis cardíaca es un evento secuencial que requiere la organización espacio-temporal de cuatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas en sectores distintos del corazón, y también requiere múltiples redes de regulación genética para orquestar este proceso para formar la 1,2 corazón funcional. Cardiaco especificación, diferenciación, patrones, y la maduración de cámara están regulados por factores de transcripción cardiogénico 3. Mutación genética o la aberración postranscripcional de estos factores en las células progenitoras cardiacas podrían resultar en la letalidad embrionaria o defectos congénitos del corazón (CHD) 4.<....

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en Albany Medical College y llevaron a cabo de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Preparación de soluciones

NOTA: El Rosa26Cre ERT2 15, R26R-16 confeti, αMHC Cre-17, y Rosa26-mTmG (mTmG) 20 líneas de ratón se adquirieron comercialmente cTnT Cre-18 fue un regalo del doctor Jiao en la Universidad de Alabama NFATc1-Cre.. fue un regalo del doctor....

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Resultados

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Obtención de imágenes del corazón embrionario aclarado

La formación del corazón de los vertebrados es un proceso morfogenética espaciotemporalmente regulado y depende de la organización y la diferenciación de las células progenitoras de cuatro fuentes diferentes 1. Las células del primer campo corazón de la media luna cardiaca se pliegan hacia la línea media ventral para formar un tubo lineal corazón. Las células de.......

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Discusión

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El aislamiento de embriones es un paso muy crítico. E9.5 embriones son muy frágiles y de tamaño pequeño, por lo que la atención deberá tener precaución de no dañar las estructuras del embrión / corazón durante el aislamiento. Las capas adicionales no embrionarias que envuelve el embrión / corazón deben eliminarse cuidadosamente mediante la formación de imágenes sobre todo cuando todo el embrión. Esto permite la penetración mezcla de anticuerpos y la limpieza en el interior de los tejidos embrionarios, y también ayuda en.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Agradecemos a los miembros del laboratorio M.W. por la discusión científica. Este trabajo cuenta con el apoyo de la AHA [13SDG16920099] para M.W., y por las subvenciones del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre [R01HL121700] para M.W. Las imágenes se capturaron en el Centro de Imágenes del Colegio Médico de Albany.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2,2′,2′ '-nitrilotriethanol Sigma Aldrich90279
4% de paraformaldehído en PBSAffymetrix19943
BSAFischer Scientific 
N,N,N',N'-tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiamina Sigma Aldrich122262
Tampón de fosfato salinoSigma AldrichP5368-10PAK
Triton  X-100Sigma AldrichT8787
UreaSigma AldrichU-1250
SacarosaSigma Aldrich84097
GlicerolSigma AldrichG8773
TamoxifenoSigma AldrichT5648
Aceite de semilla de girasolSigma AldrichS5007
Tween 20Sigma AldrichP1379
PECAM (CD31)BD Pharmingen 
Alexa Fluor 647 InvitrogenA-21247
DAPI tinción nuclearSigma AldrichD9542
37oCIncubadora Termocientífica FischerHeratherm, Incubadoras
placas de pocillosCell Treat229148
Balanza analíticaMetler ToledoPB153-S/FACT
Confocal microscopioZeissZeiss 510 microscopio
Microscopio de disecciónUnitronZ850
Microscopio fluorescenteZeissObserver. Z1
Germinador 500 Esterilizador de cuentas de vidrioCellPoint ScientificGER-5287-120V
Fuente de luzSCHOTTACE I
Par de tijerasFine Science Tools14084-08
Placa de Petri 60 mm x15 mm TPP Techno Plastic Products AG93060
Balancín II  Balancín de plataformaBoekel Scientific260350
Tubos centelleantesFischer Scientific 03-337-26
Pipeta de transferenciaSamco Scientific202
PinzasFine Science Tools11251-20
BP16000550274Microbiológicas Compactas 48 confocal

Referencias

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  1. Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
  2. Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
  3. Olson, E. N.

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