Artículo de método

Medición In Vitro Actividad ATPasa para enzimática Caracterización

DOI:

10.3791/54305

⸱

23 de agosto de 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan

En este artículo

Resumen

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Describimos un protocolo básico para cuantificar la actividad de la ATPasa in vitro. Este protocolo se puede optimizar en función del nivel de actividad y los requisitos de una ATPasa purificada determinada.

Resumen

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enzimas trifosfato-hidrólisis de la adenosina, o ATPasas, juegan un papel crítico en una diversa gama de funciones celulares. Estas proteínas dinámicas pueden generar energía para el trabajo mecánico, como el tráfico de proteínas y la degradación, transporte de solutos, y los movimientos celulares. El protocolo descrito aquí es un ensayo básico para la medición de la actividad in vitro de ATPasas purificadas para la caracterización funcional. Las proteínas se hidrolizan ATP en una reacción que resulta en la liberación de fosfato inorgánico, y la cantidad de fosfato liberado a continuación, se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico. Este protocolo altamente adaptable se puede ajustar para medir la actividad de ATPasa en ensayos cinéticos o de punto final. Se proporciona aquí un protocolo representativo basado en la actividad y requisitos de EPSE, la AAA + ATPasa implicada en la secreción de Tipo II en la bacteria Vibrio cholerae. La cantidad de proteína purificada necesaria para medir la actividad, la duración del ensayo y la sincronización y la cantidad de saintervalos mpling, tampón y composición de sal, temperatura, cofactores, estimulantes (si lo hay), etc., pueden variar de los descritos aquí, y por lo tanto una optimización pueden ser necesarios. Este protocolo proporciona un marco básico para ATPasas que caracterizan y se puede realizar rápida y fácilmente ajustarse según sea necesario.

Introducción

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ATPasas son enzimas integrales en muchos procesos en todos los reinos de la vida. Las ATPasas actúan como motores moleculares que utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para impulsar reacciones tan diversas como el tráfico, el despliegue y el ensamblaje de proteínas; replicación y transcripción; metabolismo celular; movimiento muscular; motilidad celular; y bombeode iones 1-3. Algunas ATPasas son proteínas transmembrana involucradas en el transporte de solutos a través de las membranas, otras son citoplasmáticas y pueden estar asociadas con una membrana biológica como la membrana plasmática o las de los orgánulos.

AAA+ ATPasas (ATPasas asociadas con diversas actividades celulares) constituyen un gran grupo de ATPasas que comparten cierta secuencia y conservación estructural. Estas proteínas contienen motivos de unión a nucleótidos conservados, como las cajas Walker-A y -B, y forman oligómeros (generalmente hexámeros) en su estado activo1. Se han caracterizado grandes cambios conformacionales en estas proteínas tras la unión de nucleótidos entre diversos miembros de la familia AAA+. La EpsE es una ATPasa AAA+ y miembro de la subfamilia de secreciones bacterianas de tipo II/IV de las NTPasas4-6. EpsE potencia la secreción tipo II (T2S) en Vibrio cholerae, el agente causante del cólera. El sistema T2S es responsable de la secreción de una amplia variedad de proteínas, como el factor de virulencia toxina del cólera que causa diarrea acuosa profusa cuando V. cholerae coloniza el intestino delgado humano7.

Las técnicas para cuantificar la actividad de la ATPasa in vitro son variadas, pero comúnmente miden la liberación de fosfato utilizando sustratos colorimétricos, fluorescentes o radiactivos8-11. Describimos un método básico para determinar la actividad de la ATPasa in vitro de proteínas purificadas utilizando un ensayo colorimétrico basado en un sustrato que contiene verde de malaquita disponible comercialmente y que mide el fosfato inorgánico (Pi) liberado. A pH bajo, el molibdato verde de malaquita forma un complejo con Pi y el nivel de formación de complejos se puede medir a 650 nm. Este ensayo simple y sensible se puede utilizar para caracterizar funcionalmente nuevas ATPasas y para evaluar las funciones de posibles activadores o inhibidores, para determinar la importancia de dominios y/o residuos específicos, o para evaluar el efecto de tratamientos particulares sobre la actividad enzimática.

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Protocolo

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1. Realizar la reacción de hidrólisis de ATP con la proteína purificada

  1. Las existencias de preparar todos los reactivos necesarios para la incubación con proteína purificada.
    1. Preparar tampón 5x HEPES / NaCl / glicerol (HNG) que contiene 100 mM de HEPES pH 8,5, NaCl 65 mM, y 5% de glicerol (u otro tampón de ensayo según el caso).
    2. Preparar 100 mM de MgCl 2 (u otro metal, si es de metal ATPasa dependiente) en agua.
    3. Preparar fresca mM ATP 100 en 200 mM Tris Base (no ajuste de pH más) utilizando ATP alta pureza. Alícuota y almacenar el archivo de ATP a -20 ° C durante no más de unas pocas semanas, en forma de ATP se descompone con el tiempo, y se abstengan de congelación y descongelación de la población de ATP.
    4. Premix MgCl 2 y ATP en una relación 1: 1 justo antes de la creación de la reacción de hidrólisis de ATP.
  2. Preparar y etiquetar tubos de 1,5 ml para la recogida de muestras a intervalos regulares a lo largo de la reacción. Preparar tubos para recoger muestras en el tiempo 0 y en el tiempo de 15, 30,45, y 60 min.
    NOTA: Como alternativa, recoger muestras solamente en el tiempo 0 y el punto final.
    1. Añadir 245 l de tampón 1x HNG a cada tubo con el fin de diluir las muestras recogidas de las reacciones de hidrólisis de ATP 1:50.
  3. Preparar un baño de hielo seco y etanol para congelar rápidamente muestras para detener la reacción. En un cubo de hielo de caucho o recipiente de otro seguro (no plástico), añade varios trozos de hielo seco y se vierte con cuidado suficiente etanol 70-100% para cubrir el hielo seco.
  4. Diluir la proteína purificada en tampón HNG 1x, según sea apropiado (normalmente, un 5-10 mM), y mantener en hielo.
  5. Configurar las reacciones de hidrólisis de ATP.
    1. En distintos tubos de 0,5 ml para cada muestra, añadir los siguientes reactivos (en orden): H 2 O (hasta un volumen final de 30 l), 6 l 5x HNG u otro tampón, 3 l mM MgCl 100 mezcla 2 -ATP, y 0,25-5 proteína M.
    2. Incluir un único amortiguador-condición de control negativo en el que no se añade ninguna proteína.
  6. Retire 5 l de la reacción en el tiempo 0, se diluye 1:50 en el tubo de 1,5 ml preparado que contiene 245 l de tampón HNG, y congelar inmediatamente la muestra en el baño de hielo seco / etanol.
  7. Incubar las reacciones a 37 ° C para permitir la hidrólisis de ATP que se produzca durante 1 hora. En cada intervalo (15, 30, 45, y 60 min), retirar 5 ml de alícuotas de la reacción y añadir a los tubos de muestra etiquetados que contienen tampón HNG como en el paso 1.6.
  8. Al final de la reacción de hidrólisis de ATP, mover muestras diluidas a un congelador -80 ° C para el almacenamiento. Para asegurarse de que todas las muestras se congelaron por completo, espere al menos 10 minutos antes de continuar.

2. Las muestras que contienen Incubar libre pi con el reactivo de detección

  1. Descongelar las muestras diluidas que contienen partes alícuotas de la reacción de hidrólisis de ATP en cada punto de tiempo (obtenidos a partir de los pasos 1.6 y 1.7) a temperatura ambiente.
  2. Configurar una placa de 96 pocillos que contienen las muestras y patrones de fosfato.
    1. En una ma 0,5 mlser, diluir el estándar de fosfato (proporcionado con el reactivo de detección de Pi) de 800 mM a 40 mM mediante la adición de 5,5 l de tampón de la HNG 800 M estándar a 104,5 l. Mezclar bien y añadir 100 l de esta norma Pi 40 M a pocillo A1 de una placa de 96 pocillos.
    2. Añadir tampón HNG 50 l a los pocillos B1-H1 para 1: 1 diluciones en serie de la norma Pi.
    3. Retire 50 l de 40 mM Pi desde el pocillo A1 y añadir al tampón de ensayo en 50 l B1 así, mezclar y remover 50 l de bien B1 y C1 añadir a bien, diluciones continuas a través de G1 también. Desechar 50 l de G1 bien después de la mezcla para asegurar cada pocillo tiene el mismo volumen. Así H1 debe contener solamente tampón para crear un estándar a PI 40 a 0 M.
      NOTA: Si un factor adicional (tal como un inhibidor) se ha añadido a las muestras, crear una curva estándar que contiene ese factor en el control de cambios en la liberación de fosfato o absorbancia bajo esas condiciones.
    4. Añadir 50 l de cada sampLe por duplicado a la placa. Añadir muestras del mismo punto de tiempo en las columnas verticalmente (muestra 1 hora 0 = A2, A3; muestra 2 tiempo 0 = B2, B3) y diferentes puntos de tiempo horizontalmente. Esto permite hasta 8 muestras y 5 puntos de tiempo por placa.
  3. Usar una pipeta estéril para eliminar suficiente reactivo de detección de verde malaquita / molibdato de Pi añadir 100 l a cada uno de los pocillos que contienen las muestras y los estándares (reactivo necesario (ml) = 0,1 x número de muestras y los estándares) y añadir a un plato para facilitar el pipeteado utilizando una pipeta multicanal. No vierta el reactivo de detección directamente en la cápsula, ya que es probable que se produzca contaminación Pi.
  4. Con una pipeta multicanal, se añaden 100 l de reactivo de detección Pi a cada pocillo y mezclar cuidadosamente con la pipeta hacia arriba y abajo un número considerable de veces sin la introducción de burbujas, preferentemente en el orden de los últimos puntos de tiempo a los primeros momentos de la hora.
  5. Incubar la placa durante 25 min a temperatura ambiente, o de acuerdo con la madirecciones de nufacturer.

3. cuantificar Resultados El uso de un lector de microplacas

  1. Leer la absorbancia de las muestras a 650 nm utilizando un lector de microplaca de absorbancia.
  2. Hacer una curva estándar Pi. El uso de un software de gráficos, representar gráficamente los valores de absorbancia de las muestras estándar Pi frente a la concentración con el fin de encontrar una ecuación usada para resolver la cantidad de fosfato en cada muestra.
  3. Calcular la actividad ATPasa para cada muestra mediante la calibración con el estándar de fosfato. Fosfato liberado = (OD 650 - Intersección) / pendiente.
    1. Promediar el Pi total a partir de duplicados de cada muestra. Restar lectura de la absorbancia del control de tampón de sólo de este número. Multiplique esto por el factor de dilución (50 en nuestro ejemplo).
    2. Determinar el Pi liberado por nmol de proteína mol. Representación gráfica de estos valores para cada punto de tiempo en un ensayo de cinética debe producir ajustes lineales de al menos R = 0,99 (Figura 1); Si nOT, el ensayo puede ajustarse con más o menos proteína o un tiempo de incubación más largo o más corto.
  4. Representan los resultados como nmol Pi / mol de proteína / min (Figuras 2, 3), o como proteína nmol Pi / mg / min si se desea.

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Resultados

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La actividad in vitro de la ATPasa T2S EPSE puede ser estimulada por copurification de EPSE con el dominio citoplásmico de EPSL (EPSE-cytoEpsL) y la adición de la cardiolipina fosfolípido ácido 12. También es posible determinar el papel de los residuos particulares EPSE en la hidrólisis de ATP mediante la comparación de la actividad de tipo salvaje (WT) a formas variantes de la proteína utilizando este ensayo. Aquí, el efecto de sustituir dos residuos de lisina en el ...

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Discusión

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Este es un protocolo general para la medición de la actividad ATPasa in vitro de proteínas purificadas para la caracterización bioquímica. Este método se optimiza fácilmente; por ejemplo, el ajuste de la cantidad de proteína, tampón y composiciones de sal, temperatura, y la variación de la longitud de ensayo y los intervalos (incluyendo el aumento del número total de intervalos) puede mejorar la actividad de la cuantificación. Comercialmente disponibles malaquita reactivos basados ​​en verde son muy se...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer la financiación de una subvención de los Institutos Nacionales de Salud RO1AI049294 (a M. S.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tampón HEPESFisherBP310-500
Cloruro de sodioFisherBP358-212
Cloruro de magnesioFisherBP214-500
Trifosfato de adenosina (ATP)FisherBP41325
Placas de 96 pocillos (transparentes, de fondo plano)VWR82050-760
BIOMOL GreenEnzo Life CienciasBML-AK111Reactivo de detección de fosfato preferido. Precaución: irritante.
LectorBioTek Synergy o software Prism
5GraphPad comparable
de microplacas

Referencias

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