Artículo de método

Un método de aislamiento de células reconocidas a través del vidrio funcionalización de la superficie

DOI:

10.3791/54315

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20 de septiembre de 2016

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1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe la funcionalización de superficie personalizable del sistema de destiobiotina, estreptavidina y APTES para aislar tipos celulares específicos de interés. Además, este manuscrito cubre las aplicaciones, optimización y verificación de este proceso.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uno de los factores limitantes para la adopción y el avance de la medicina personalizada es la incapacidad de desarrollar herramientas de diagnóstico para sondear los matices individuales en la expresión de un paciente a otro. Las metodologías actuales que intentan separar las células para llenar este nicho dan como resultado una interrupción de la expresión fisiológica, lo que hace que la técnica de separación sea inútil como herramienta de diagnóstico. En este protocolo, describimos la funcionalización y optimización de una superficie para la captura y liberación celular. Esta superficie funcionalizada integra anticuerpos biotinilados con una superficie de vidrio funcionalizada con un aminosilano (APTES), destiobiotina y estreptavidina. La liberación celular se facilita mediante la introducción de biotina, lo que permite la recolección y purificación de las células capturadas por la superficie. Esta liberación se realiza a través de la focalización de la fracción secundaria destiobitina, lo que da como resultado un paradigma de liberación mucho más suave. Esta reducción de los reactivos agresivos y las fuerzas de cizallamiento reduce los cambios en la expresión celular. La superficie funcionalizada captura hasta el 80% de las células en una mezcla de células individuales y ha demostrado una captura del 50% en una mezcla de células dobles. Se investigan las aplicaciones de esta tecnología a los xenoinjertos y a los estudios de separación del cáncer. También se describen las técnicas de cuantificación para la verificación de superficies, como el lector de placas y los análisis ImageJ.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De sobremesa enfoques actuales de separación de células (por ejemplo, de células activada por fluorescencia 1, captura por láser micro-disección 2, inmuno-magnética separación del grano 1) puede tomar varias horas de preparación y de clasificación. Estas grandes escalas de tiempo pueden afectar los niveles de respuesta y fisiológicos de expresión, lo que resulta en análisis que no son representativos de la respuesta fisiológica 3. Sistemas que se necesitan rápida y eficiente puede aislar determinados tipos de células sin interrumpir los receptores de los niveles de la superficie celular con el fin de mejorar el aislamiento de células y el enriquecimiento para aplicaciones biomédicas. Por lo tanto, la razón de nuestro enfoque es el desarrollo de un enfoque suave para el aislamiento de células.

El "laboratorio en un chip" concepto ofrece la promesa de órdenes de magnitud más rápido aislamiento de células (horas-minutos-a), y con mayor frecuencia implica la captura de células sobre una superficie y células o conte intracelular liberaciónn id a través física 4,5 o 6 métodos químicos. Aunque estos enfoques ofrecen algunas ventajas tales como la identificación de la expresión de proteína 7,8, la identificación de la expresión del ARN 9-11, o incluso proporcionar células para el cultivo in vitro 12,13, muchas de estas técnicas no pueden ser traducidos a los diagnósticos, tales como perfiles de receptor de la célula debido a sus entornos no fisiológicas. Agentes de elevación enzimáticos tales como colagenasas también pueden afectar a los receptores de estas cantidades, es decir, 14,15 técnicas de cuantificación del receptor de células que usan estos agentes de elevación no generará datos fisiológicos precisos. Lisis celular previene la diferenciación entre los receptores de la superficie nativas, y las que se internaliza previamente 16. Este protocolo describe un enfoque rápido y suave para el aislamiento de células.

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Protocolo

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1. Limpieza de la superficie del vidrio y Preparación de Reactivos

  1. Colocar una superficie de vidrio en una máquina de plasma de oxígeno durante 5 minutos a 50% de potencia para limpiarlo.
  2. Preparar 2,5 ml 2% reconstituido (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) solución, mediante la adición de 50 l de APTES y 2,45 ml de etanol en un tubo cónico.

2. APTES y funcionalización OSD

  1. Añadir solución APTES a las superficies. Pipetear 150 l por pocillo para placas de 8 pocillos. Pipeta 100 l por pocillo de placas de 24 pocillos. Pipetear 1,1 ml de platos de cristal de 60 x 15 mm. Cubrir las superficies para evitar la evaporación y la distribución desigual de la solución APTES. Colocar las superficies en un agitador de plataforma durante 50 min a temperatura ambiente, lo que crea una distribución uniforme de la capa de APTES.
    NOTA: APTES es un aminosilano que forma la primera capa de la superficie. Si se utiliza una superficie diferente, heurísticamente determinar el volumen de solución necesario para cubrir la superficie.
  2. Seleccione la temperatura para el horno, mientras que las superficies están en el agitador: Calentar a 55 ° C durante 2 h para las placas 8 pocillos y placas de 24 pocillos. vidrio de calor sólo platos a 90 ° C durante 1 hora.
  3. Enjuague las superficies con etanol.
    1. Administrar la cantidad de etanol requerida haciendo referencia basado en la superficie utilizada. Añadir 150 l de etanol a cada pocillo para placas de 8 pocillos. Añadir 125 l de etanol a cada pocillo para placas de 24 pocillos. Añadir 1,1 ml de etanol para los platos de vidrio.
    2. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie. Enjuague dos veces más el uso de etanol.
      NOTA: Si cualquiera de los pocillos con fondo de cristal tienen cualquier plástico en ellos, no calentarlos por encima de 65 ° C, ya que el plástico que comenzará a derretirse y la deformación.
  4. Secar con gas 100% de nitrógeno dispensado desde un tanque. Coloque las superficies de la juntaVen.
  5. Preparar 2,5 ml de la solución de d-destiobiotina (DSB) mediante la combinación de 1,5 mg / ml OSD en 37,5 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO), y 5 mg / ml de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) en 2462.5 l de la (6 pH) tampón de hidrato de ácido 4-morfolinoetanosulfónico M 0,1 (MES). A continuación, combinar ambas soluciones.
  6. Añadir 1 l de mercaptoetanol 2-β, después de 15 min, en la solución para detener la reacción entre DSB y EDC. Retire APTES calientes funcionalizados superficies de vidrio del horno. Espere 5-10 minutos para las superficies de vidrio se enfríe.
  7. Añadir tampón MES la superficie para enjuagar, el uso de cantidades en base a la superficie. Añadir 150 ml de tampón MES a cada pocillo para placas de 8 pocillos. Añadir 125 l de tampón MES a cada pocillo para placas de 24 pocillos. Añadir 1,1 ml de tampón MES para los platos de cristal.
  8. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamenteen la superficie. Enjuague dos veces más con tampón MES.
  9. Aplicar la solución OSD a las superficies para que puedan incubar. Añadir 150 solución OSD l por pocillo para placas de 8 pocillos. Añadir una solución de 100 OSD l por pocillo de placas de 24 pocillos. Añadir 1,1 ml de solución de vidrio platos OSD.
  10. Coloque las superficies de vidrio OSD cubiertos sobre una toalla de papel húmeda en el interior de una caja de Petri. Cubrir e incubar en una nevera C 4 ° durante 18-24 horas.

3. La funcionalización estreptavidina

  1. Enjuague cada superficie de vidrio tres veces con 1 ml de 1,0x salina tamponada con fosfato (PBS). Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie. Diluir la solución de estreptavidina (SAV) stock a 0,4 mg / ml (recomendado).
    NOTA: PBS es isotónica para que pueda ser utilizado como un medio para la dilución y lavado. PBS se usa como un disolvente para el SAv, y por lo tanto, no afectará a la capacidad de la SAV a unirse a la superficie.
  2. Aplicar 0,4 mg / ml de solución de SAv de manera uniforme a las superficies de manera que una capa delgada de formas en la parte inferior de la copa, seleccionar la cantidad de solución basada en la superficie. Para placas de 8 pocillos, añadir solución SAv 150 l 0,4 mg / ml por pocillo. Para placas de 24 pocillos, añadir solución SAv 100 l 0,4 mg / ml por pocillo. Para los platos de vidrio, añadir solución Sav / ml 1,1 ml 0,4 mg.
  3. Tapar y mover las placas a una placa de Petri de 14 cm para retener la humedad. Incubar la placa de Petri en el refrigerador durante 18-24 horas.
    NOTA: Es esencial utilizar volúmenes consistentes de APTES, OSD, y sav en cada superficie.
  4. Enjuague cada superficie de vidrio tres veces con 150 ml de PBS para eliminar SAv. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie.
  5. Moje una toalla de papel wITH agua desionizada y coloque la toalla de papel plana en 14 cm placa de Petri que rodea las placas para retener la humedad en los pocillos. Cubrir la placa de Petri que contiene los pozos. Incubar la placa de Petri en el nivel 1 (BSL-1) refrigerador 4 ° C hasta que se necesite Bioseguridad.

4. Captura y liberación de la célula

  1. Comience con el frasco (s) T175 de células destinados para el experimento. Aspirar los medios de comunicación del frasco (s). Lave el resto del soporte con 5 ml de PBS temperatura ambiente. Aspirar PBS del matraz (s).
  2. Añadir 10 ml de agente de elevación no enzimática, tales como la célula de disociación de soluciones, en el matraz T-175 de las células. Poner el matraz en la incubadora durante 6 minutos para permitir la elevación de las células del matraz.
  3. Después de 6 minutos, añadir 10 ml de solución salina equilibrada de Hank fría (HBSS; Ver Lista de Materiales) para inactivar el agente de elevación. Sacar 20 l de células para contar el número de células en solución utilizando un hemacitómetro.
    NOTA: Dependiendo de la funcsuperficies utilizadas en el experimento de captura de titucionalizado, el número de células necesario varía. Para funcionalizados 8 placas de pocillos, utilice 300.000 células por pocillo. Para los platos de vidrio funcionalizadas, utilizar 1,1 millones de células. Para funcionalizados placas de 24 pocillos, se recomienda a 125.000 células. Más información sobre el recuento de células se encuentra en el Suplemento.
  4. Repetir los pasos 4.1- 4.3 para otro matraz de células, si un menor número de células están presentes de lo necesario para el experimento. Combinar las suspensiones de células y células de recuento para obtener el número total de células en solución.
  5. Centrifugar la suspensión de células en una centrífuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para obtener un pellet de las células concentradas. Encontrar la cantidad apropiada de HBSS para añadir a la suspensión celular para obtener una concentración de 1 x 10 6 células por ml, a continuación, aspirar el sobrenadante de las células se centrifugaron, y añadir el volumen calculado. Este volumen se puede calcular utilizando las ecuaciones presentadas en el suplemento.
  6. Pipeta hacia arriba y abajo (triturado) para volver a suspender THcélulas correos en solución y esto reduce la agregación celular en una solución que puede reducir la unión del anticuerpo. Dividir la solución celular en el control separado y soluciones experimentales. Ver el fichero suplementario para componentes y cálculos.
  7. Añadir los anticuerpos con biotina a las respectivas soluciones celulares como se describe en el archivo suplementario. Incubar durante 30 minutos a 4 ° C en un mezclador extremo sobre-fin.
    NOTA: Para las células MCF7GFP, 0,5 mg / ml o anticuerpos hIgG / ml HLA-ABC 0,5 mg se recomiendan. Para los macrófagos RAW, se recomienda 1 mg / ml mCD11b a la mitad del volumen para dar cuenta de las diferencias de dilución. Para las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), 0,5 mg / ml se recomienda hCD31.
  8. Lavar la superficie de vidrio funcionalizada con HBSS. Para este experimento, se aconseja una placa 8 también.
    1. Añadir 150 l HBSS a cada pocillo para placas de 8 pocillos. Enjuague dos veces más con HBSS. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo.Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie. Mantener frío a 4 ° C.
  9. Añadir las soluciones de células a los pocillos y esperar 45 minutos para que las células se incuban en hielo en el agitador. Hacer que la solución de biotina en HBSS estéril mediante el uso de volúmenes calculados como se describe en el Suplemento.
  10. Retire la solución de células de los pozos de vidrio mediante el uso de HBSS.
    1. pipetear suavemente 150 l HBSS en cada pocillo. A continuación pipetear el HBSS. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie.
    2. Repetir dos veces más. Después del lavado, añadir HBSS a los pocillos para mantener las células en húmedo.
  11. Añadir 150 ml de solución de biotina 20 mM a cada versión respectiva bien, y luego esperar 20 minutos para permitir la reacción.
  12. Se acuerden de células no específicamente unidos de un lavado con HBSS como se ha dicho, y luego, si el uso de células marcadas con fluorescencia, proceder a la fluorescencia de imagen de las células. También las células vivas de la imagen en un frasco (como control, para comparar con las células en el pozo). Si el uso de células transfectadas proteína fluorescente verde (GFP), la excitación será 470 nm, y la emisión será 515 nm.

5. Anticuerpo Optimización: Titulación de anticuerpos

  1. Empezar por el levantamiento de las células de la T75 o T175 matraz como se explica en el paso 4.1- 4.3.
    NOTA: Estos volúmenes están calibrados para placas de 24 pocillos, pero se pueden cambiar para adaptarse a cualquier superficie de vidrio funcionalizada a través de pruebas heurístico. Una valoración de anticuerpos representativo se muestra en la Figura 1.
  2. Recuento de células utilizando el hemocitómetro, y luego girar hacia abajo la solución de células en un tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir las células de 1 millón de células por ml, usando los cálculos descritos en el Suplemento.
  3. Dividir el 1 mcélulas illones por ml de solución en seis soluciones diferentes de 500 l en diferentes tubos de centrífuga para el anticuerpo (Ab) soluciones.
    1. Diluir la solución de anticuerpo de stock a 10 mg / ml, 1 g / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Crear los controles mediante el uso de 100 l de la mancha de Buffer (PBS + 1% de azida de sodio + 1% de BSA), y 500 l de células para el control sin Ab en ella. Para el blanco de control (n Ab y sin células), utilizan una solución de 300 l de PBS.
      NOTA: ATENCIÓN: La azida sódica es extremadamente tóxico, explosivo, y un cuidado extremo se debe tomar cuando se la usa. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) y utilizar el equipo de seguridad apropiado.
  4. Combinar e incubar las soluciones Ab con las soluciones de células en el mezclador de extremo sobre extremo a 4 ° C durante 30 min. Enjuagar las placas de 24 pocillos funcionalizados con HBSS tres veces. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantenga la pipette en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie.
  5. Alícuotas de 125 l de cada solución de muestra en las APTES apropiadas, OSD, y Sav funcionalizados también. Se incuba a 4 ° C o en hielo durante 45 min sobre la superficie de vidrio. Enjuague la superficie con HBSS tres veces para eliminar las células unidas no específicamente. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie. No se enjuague la fila inferior, ya que esos son los controles.
  6. Añadir 150 ml de HBSS a cada lavó bien, poner las placas de 24 pocillos en hielo, y luego usar un lector de placas para medir la fluorescencia de las células GFP (excitación 485 nm / emisión 528 nm).

6. Optimización de la célula: Titulación Celular

  1. Levante las células como se ha mencionado en los pasos 4.1 -4.3.
  2. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Centrifugar las células de modolución en tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir las células a 1 millón de células por ml.
    NOTA: Más información sobre el uso de la hemocitómetro se puede encontrar en el suplemento.
  3. Pipetear 1,6 ml de la solución de células para la población de 1,6 millones de células y colocar en un tubo cónico. Pipetear 800 l de células a partir de la solución de células para la población de 800.000 células y colocar en un tubo cónico. Pipeta de 80 l de la población de células de la población de 80.000 células y colocar en un tubo cónico. Pipeta de 8 l de la población celular de 8.000 células de valores y colocar en un tubo cónico.
    NOTA: Las concentraciones se dan por 8 mediciones de placa así, repetir según sea necesario. Un ejemplo de salida de la placa se muestra en la Figura 2.
  4. Tome las cuatro soluciones madre y girar en una centrífuga a 500 g durante 5 min a 4 ° C. Vuelva a suspender todas las soluciones madre en 400 l de HBSS.
  5. Añadir 1,6 l de 100 ng de anticuerpo / ml al stock 1.600.000 celular, 0,8 μl al stock de 800.000 células, y 0,5 l a todas las demás poblaciones. Incubar el anticuerpo durante 30 minutos en el mezclador de extremo sobre extremo durante 30 minutos a 4 ° C. Lavar la superficie de vidrio funcionalizada con HBSS tres veces.
    NOTA: Se recomienda que la placa de 8 funcionalizado para la cuantificación de microscopía, mientras que se recomienda la placa así funcionalizado 24 para lector de placas de cuantificación. La concentración de anticuerpo de 8.000 celular stock no se redujo para permitir que el factor limitante de la superficie de captura a no ser la falta de anticuerpos en solución, sino más bien las propiedades de captura de la superficie.
  6. Aplicar 150 l de las soluciones de muestra a cada pocillo. Aplicar la población de 1,6 millones de células a la primera columna de pocillos de la izquierda. Aplicar la población de 800.000 celda a la segunda columna de la izquierda. Aplicar la población de 80.000 células a la tercera columna desde la izquierda. Finalmente aplicar la acción de 8.000 celda a la última columna. Incubar durante 45 minutos a 4 ° C en el agitador.
    NOTA: El 1,6 millonescelular stock sirve como la mayor concentración a ensayar, y es el doble de la cantidad de células que se utiliza típicamente en los experimentos de separación celular (600.000 células por pocillo) El stock de 800.000 células sirve como control para el experimento, ya que es la concentración celular típica que se utiliza en los experimentos de separación celular (3.000.000 de células por pocillo). El stock de 80.000 células sirve como una dilución de diez veces para la prueba de concentraciones más bajas para la captura celular (30.000 células por pocillo). El stock de 8.000 celular sirve como una dilución centenar de veces que se utiliza como una prueba para comprobar el límite inferior de la separación celular (3.000 células por pocillo).
  7. Enjuague con HBSS tres veces. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie. Recoger todos los lavados.
  8. Imagen de las células en un microscopio de fluorescencia, si se utilizan placas 8, así, tomar fotos de cada uno surcara, y se aplica biotina 150 l a cada superficie durante una hora a 4 ° C en el agitador. Después de una hora, enjuague pozos de liberación de biotina con HBSS 3 veces como antes. Recoger todos los lavados de los pozos para contar con el hemocitómetro y la imagen de los pozos de liberación.
  9. Aplicar 150 l de solución de biotina exceso de 20 mM a los pocillos apropiados de liberación de biotina durante 1 hora, si el uso de placas de 24 pocillos, y luego enjuague aquellos pocillos 3 veces con HBSS. Cuantificar placas de 24 pocillos utilizando un lector de placas. Utilice un hemacitómetro para contar las células de todos los lavados así recogidos.

Análisis 7. Imagen

Nota: Se recomienda el paquete de software de Fiji (http://fiji.sc/Fiji) para el análisis de imágenes. Inicialmente, las imágenes se convirtieron en la imagen en escala de grises, y luego el brillo / contraste se modificó para permitir llevar a cabo las células.

  1. Cargar la imagen, y convertir a escala de grises haciendo clic en la pestaña de la imagen a continuación, desplazarse hacia abajo para "Tipo" y luego haciendo clic4; 8 bit ".
  2. Aumentar el contraste de la imagen haciendo clic en la pestaña de imagen y luego desplazarse a "Ajuste". Haga clic en "Brillo y contraste", y luego usar las barras de desplazamiento para hacer que las células se destacan. Si el uso de imágenes de fluorescencia, invertir las imágenes para que las células sean más definidos.
  3. Cargar un plugin en ImageJ llama ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) para analizar las imágenes.
  4. Abrir ITCN. Cuando aparezca un cuadro de diálogo que pide al usuario con varios parámetros para estimar el tamaño de la celda, establecer el ancho mínimo de la primera célula de interés. Haga clic en la opción "Detectar picos oscuros" si la imagen es fluorescente y se oscurecen las células.
  5. Establecer el valor umbral en el 2 al principio, y luego pulsa el botón "Count". Una versión recién contado de la imagen aparecerá con puntos rojos que delimitan donde se han contado las células.
  6. Ajustar el parámetro de umbral y el ancho para obtener datos más precisos celulares por defining del tamaño de una "célula". Nota: El número de células contadas estará en un cuadro de diálogo de la derecha. Modificación de los parámetros darán diferente número de células contadas.
  7. Continuar para recorrer los parámetros de umbral y de anchura hasta que se alcanza una buena estimación para el número de células.

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Resultados

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El uso de este protocolo se muestra la captura de células (Figura 3A) y la liberación de células (Figura 3C) de células MCF7GFP, así como controles de células vivas (Figura 4). Se cuantificó la captura de células en un 60% y el 80% fueron puestos en libertad (Figura 3C). Cuando nos extendió este enfoque a una mezcla de RAW 264.7 macrófagos y células MCF7GFP, 50% de los macrófagos RAW fueron capturados (Fig. 3D)

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las mejoras en las técnicas de aislamiento de células promueve estudios científicos en las relaciones estructura-función en la neurociencia 18, la programación celular en biología regenerativa, y la señalización angiogénica en la biología vascular 19 de vástago. De hecho, cultivo celular primario 20 (por ejemplo, HUVECs) en biología vascular se realiza principalmente a través del uso de técnicas de aislamiento de células. Aislamiento de células también fue utilizado recientement...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a la Sociedad Americana del Cáncer, División de Illinois (282802) y a la Fundación Nacional de Ciencias CBET (1512598) por su apoyo financiero. También nos gustaría agradecer a la Dra. Dianwen Zhang del Instituto Beckman de la Universidad de Illinois por su capacitación en microscopía. Finalmente, nos gustaría agradecer a Jared Weddell, Stacie Chen y Spencer Mamer por las discusiones perspicaces.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(3-Aminopropyl) trietoxisilano (APTES)Acros Organics919-30-2Se utiliza para hacer una solución de APTES al 2%
Limpiador de plasma PicoDienerModelo 1Limpia superficies y permite la unión de PDMS al vidrio
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Utilizado como mecanismo de liberación en la superficie de captura celular. 
dimetilsulfóxido (DMSO)British Drug Houses (BDH)BDH1115-1LPDisuelve el DSB en solución
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)Thermo-Scientific5g: 22980
25g: 22981		Activa los ácidos carboxílicos y permite la unión de las proteínas a la superficie del vidrio.
portaobjetos de cultivo de 8 pocillos sin recubrimientoBD FalconCaja de 24: 354118
Caja de 96: 354108		Se utiliza en experimentos celulares con microscopio de fluorescencia Zeiss, como los experimentos de cuantificación de captura y liberación
vidrio Placas de 24 pocillosMatTekP24G-0-13-FSe utiliza en experimentos celulares que involucran el lector de placas, como experimentos
de valoración de anticuerpos y celulares.Science Lab60-24-2Se utiliza para apagar la reacción entre EDC y DSB
Ácido 4-morfolinoetanosulfónico hidrato
(Hidrato MES 99%)		Fisher ScientificAC172590250Se utiliza para fabricar un tampón MES de 0,1 M para su uso en la reacción EDC
Horno de precisiónThermo Scientific11-475-153Se utiliza en el curado de la capa PDMS y APTES.
Titramax 1000 ShakerHeidolph13-889-420Se utiliza para garantizar una distribución uniforme de APTES en las superficies.
1x Estreptavidina 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Proteína de unión a la biotina. Puede causar irritación.
Plato de vidrio de 5 cmFisher Scientific08748AUtilizado en estudios HUVEC, así como en futuros estudios de perfilado.
Placa de Petri de 14 cm con tapaSigma-AldrichZ717231Se utiliza para contener muestras que se están funcionalizando y transportarlas.
Células MCF7-GFPCell BiolabsAKR211Almacenado en nitrógeno líquido
RAW264.7 macrófagos de ratónATCCTIB-71Obsequiado por el laboratorio Smith de la Universidad de Illinois. Almacenado en nitrógeno líquido.
TrypLELife Technologies12605036Conservado en 100 ml a temperatura ambiente
Dulbecco' s Instalaciónde medios celulares de medio Eagle modificado en la Facultad de Ciencias Químicas en UIUC50003PCProveedor: Corning
Instalación de medios celulares de aminoácidos no esenciales en la Facultad de Ciencias Químicas en UIUC25-025-CIYa agregado a DMEM por instalación. Proveedor: Corning.
Raspador de célulasFisher Scientific12-565-58Pequeño 23 cm paquete de 50
Solución de disociación celularCorningMT-25-056CISe utiliza para levantar células de forma no enzimática para su uso en experimentos celulares
HemacitómetroHausser02-671-54Se utiliza para contar células para la cuantificación de soluciones celulares y la efectividad de captura y liberación.
BiotinaAmresco58-85-5Se utiliza para liberar células de la superficie.
HBSSCreado a partir de la recetaN/ASe utiliza para mantener las células vivas en suspensión, así como para lavar las superficies de unión no específica. Adaptado de los protocolos de Cold Spring Harbor: En 500   ml, use 4  g NaCl, 0,2 y nbsp; g KCl, 0,0402  g Na2PO4• 7H2O, 0.03  g KH2PO4 y 0,5  g de glucosa. Agregue agua desionizada para llegar a   500 ml, filtre y luego refrigere.
Anticuerpo HLA-ABCBioLegend311402Anticuerpo utilizado para capturar células MCF7gfp
Anticuerpo hIgGBioLegendHP6017Anticuerpo utilizado para capturar células MCF7gfp
Células MCF7 GFP CellBiolabsAKR-211línea de cáncer de mama luminal que ha sido transfectado con proteína fluorescente verde.
Surtido CónicosThermo-Scientific15mL: 12-565-26850/15 ml cónicos de plástico para almacenar soluciones y alícuotas.
Rotores de minitubos (mezclador de extremo a extremo)Fisher Scientific05-450-127Se utiliza para incubar anticuerpos y mezclar otras soluciones celulares con el fin de mezclar
Axiovert 200M (microscopio de fluorescencia)ZeissN/AMicroscopio de fluorescencia invertida Zeiss Axiovert 200 M.
Columnas de desalinización ZebaThermo-ScientificPI-87770Se utiliza para purificar anticuerpos recién biotinilados después del uso del kit de biotinilación. Instrucciones proporcionadas en: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Kit de biotinilación de bajo pesoTermocientíficoSe utiliza para biotinilar anticuerpos para permitirles integrarse con la superficie de captura
Lector de placasBioTekSynergy HTX Multimode ReaderSe utiliza para medir cuantitativamente la intensidad fluorescente en los experimentos de valoración.
inicial Fondo de

Referencias

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