Tridimensional Ensayo de Cultivo para explorar invasividad de las células del cáncer y la formación de tumores satélite

Summary

Las células cancerosas se incrustan en un gel de colágeno y luego se intercalan en un gel de fibrina acelular para generar un sistema de cultivo 3D en el que se puede monitorear la invasividad y la formación de tumores satélite.

Abstract

cultivo de células de mamíferos en monocapas se utiliza ampliamente para estudiar diversos procesos fisiológicos y moleculares. Sin embargo, este enfoque para estudiar las células en crecimiento a menudo genera artefactos no deseados. Por lo tanto, el cultivo de células en un entorno de tres dimensiones (3D), a menudo el uso de componentes de la matriz extracelular, surgió como una alternativa interesante debido a su estrecha similitud con el nativo en el tejido vivo o un órgano. Hemos desarrollado un sistema de cultivo celular 3D utilizando dos compartimentos, a saber, (i) un compartimiento central que contiene las células cancerosas embebidas en una actuación gel de colágeno como un tumor macrospherical pseudo-primaria y (ii) un compartimento libre de células periférica hecha de un gel de fibrina, es decir, un componente de la matriz extracelular diferente de la utilizada en el centro, en el que las células cancerosas pueden migrar (frente de invasión) y / o formar tumores microesféricas representan tumores secundarios o satélite. La formación de tumores de satélite en el compartimiento periférico esnotablemente correlacionada con la agresividad conocido u origen metastásico de las células tumorales nativas, lo que hace que este sistema de cultivo 3D único. Este enfoque de cultivo celular podría considerarse para evaluar la invasividad del cáncer celular y la motilidad, las interacciones célula-matriz extracelular y como un método para evaluar las propiedades de fármacos anti-cáncer.

Introduction

La investigación de las características fundamentales y biomédicas de la invasión de células de cáncer / migración y el posterior establecimiento de metástasis es objeto de una intensa investigación de ^1,2. La metástasis es la última etapa del cáncer y su tratamiento clínico sigue siendo difícil de alcanzar. Una mejor comprensión de la metástasis en los niveles celular y molecular permitirá el desarrollo de terapias más eficientes ^3.

Varias propiedades de las células metastásicas se pueden explorar in vitro ⁴ incluyendo su stemness y potencial de adquirir un estado de transición (por ejemplo,<....

Protocol

NOTA: No se cuenta la ética ya que las células cancerosas humanas y animales fueron comprados o amablemente proporcionados a nosotros.

1. Realización de colágeno enchufes (Pseudo-Tumor primario)

1. Preparar una dispersión de colágeno. Colágeno de tipo I de tendones de cola de rata (RTT) puede ser o bien extraídas y esterilizadas como se informó anteriormente ^17, o comprar. Dispersar el colágeno liofilizado RTT (3,25 a 3,50 mg / ml en 0,02 N de ácido acético) usando un mezclador (ajuste de alta velocidad; cinco carreras 2 min) para una mezcla uniforme.
2. Cosecha (tripsina-EDTA, por lo general) y utilizar la exclusión de azul de tripa....

Results

Como se mencionó anteriormente, una característica interesante de este ensayo de cultivo de células 3D es que las células cancerosas no sólo pueden migrar desde el tapón de colágeno al gel de fibrina adyacentes, sino también establecer tumores secundarios (estructuras por ejemplo, vía satélite tumorales-like). Esto puede observarse directamente con un microscopio de contraste de fase invertida a bajas y altas magnificaciones a través del espesor de gel, especialmente con una dis.......

Discussion

Como un importante nota técnica, es esencial que ningún hueco está presente en la interfaz entre la central y los geles periféricos. De lo contrario, podría reducir la capacidad de las células para migrar / invadir el gel de fibrina. Un espacio entre el colágeno y los geles de fibrina puede formar durante la primera 24 horas de cultivo si la trombina no se ha diluido apropiadamente. También es posible que la línea celular probado podría llevar el gel de colágeno se contraiga durante el cultivo, causando así un espacio r.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colágeno liofilizado	Sigma-Aldrich	C7661	a partir de tendón de cola de rata (dispersión soluble) o casero (ver Rajan et al., ref.#14)
Fibrinógeno (liofilizado)	Sigma-Aldrich	F8630	Tipo I-S, 65 - 85% de proteína con ≥ 75% de proteína es coagulable
Trombina	EMD Chemicals Inc.	605157	Gibbstown, Nueva Jersey; Unidades NIH/mg de peso seco
Factor de crecimiento reducido Matrigel	Corning	356234	anteriormente de BD Biosciences
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6279	solución a 5 - 10 T UI/ml (Unidad de inhibidor de tripsina)
Microcucharas	Fisher Scientific 2140115		Fisherbrand Handi-Hold Microespátula placa de
96 pocillos, base redonda	Sarstedt	3925500
Placa de 24 pocillos	Sarstedt	3922
Dulbecco's Eagle's Medium modificado	Sigma Chemical, Co.	D5546	DMEM
Suero Fetal Bovino	VWR	CAA15-701	FBS, origen canadiense.
Tripsina-EDTA	Sigma Químico, Co.	T4049
Hank' s Solución salina equilibrada	Sigma Chemical, Co.	H8264	HBSS