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Artículo de método

La excitación externa de neuronas usando campos eléctricos y magnéticos en culturas de una y dos dimensiones

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DOI:

10.3791/54357

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7 de mayo de 2017

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1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

En este artículo

Resumen

cultivos neuronales son un buen modelo para el estudio de las técnicas de estimulación del cerebro emergentes a través de su efecto sobre las neuronas individuales o una población de neuronas. Aquí se presentan los diferentes métodos para la estimulación de cultivos neuronales estampadas por un campo eléctrico producido directamente por los electrodos de baño o inducida por un campo magnético variable en el tiempo.

Resumen

Una neurona se disparará un potencial de acción cuando su potencial de membrana supera un cierto umbral. En actividad típica del cerebro, esto ocurre como resultado de insumos químicos a sus sinapsis. Sin embargo, las neuronas pueden también ser excitados por un campo eléctrico impuesto. En particular, las aplicaciones clínicas recientes activan las neuronas mediante la creación de un campo eléctrico externo. Por tanto, es de interés para investigar cómo la neurona responde al campo externo y lo que hace que el potencial de acción. Afortunadamente, la aplicación precisa y controlada de un campo eléctrico externo es posible para las células neuronales embrionarias que son extirpados, disociados y crecer en cultivos. Esto permite la investigación de estas preguntas en un sistema altamente reproducible.

En este trabajo algunas de las técnicas utilizadas para la aplicación controlada de campo eléctrico externo en cultivos neuronales se revisan. Las redes pueden ser de una sola dimensión, es decir, modelado en lineaformas R o dejaron crecer en todo el plano del sustrato, y por lo tanto de dos dimensiones. Además, la excitación puede ser creado por la aplicación directa de campo eléctrico a través de electrodos sumergidos en el fluido (electrodos de baño) o induciendo el campo eléctrico usando la creación remota de pulsos magnéticos.

Introducción

La interacción entre las neuronas y los campos eléctricos externos tiene implicaciones fundamentales, así como los prácticos. Aunque se conoce desde los tiempos de Volta que un campo eléctrico aplicado externamente puede excitar el tejido, los mecanismos responsables de la producción de un potencial de acción resultante en las neuronas sólo se están empezando recientemente a ser desenredado 1, 2, 3, 4. Esto incluye la búsqueda de respuestas a las preguntas sobre el mecanismo que causa la despolarización del potencial de membrana, el papel de propiedades de la membrana y de los canales iónicos, e incluso la región en la neurona que responde al campo eléctrico 2, 5. Therapeutic neuroestimulación 6, 7, 8, 9, 10 metodologías son particularmente dependientes de esta información, que puede ser crucial para la definición de las zonas afectadas y para la comprensión de los resultados de la terapia. Tal entendimiento también puede ayudar en el desarrollo de protocolos de tratamiento y nuevos enfoques para la estimulación de diferentes áreas del cerebro.

La medición de la interacción dentro del cerebro in vivo añade un componente importante para esta comprensión, pero se ve obstaculizada por la imprecisión y baja capacidad de control de las mediciones dentro del cráneo. En contraste, las mediciones en cultivos fácilmente se pueden realizar en gran volumen con alta precisión, excelente señal al rendimiento de ruido y un alto grado de reproducibilidad y de control. Utilizando cultivos una gran variedad de propiedades neuronales del comportamiento de la red colectiva se puede elucidar 11, 12, 13, 14, 15, 16. Del mismo modo, se espera que este sistema bien controlado ser altamente eficiente en elucidar el mecanismo por el cual otros métodos de estimulación trabajo, por ejemplo cómo la apertura del canal durante la estimulación óptica en las neuronas optogenetically activas 17, 18, 19 es responsable de crear potencial de acción.

Aquí la atención se centra en describir el desarrollo y la comprensión de las herramientas que pueden excitar de manera eficiente la neurona a través de un campo eléctrico externo. En este trabajo se describe la preparación de dos dimensiones y unidimensional cultivos de hipocampo estampadas, la estimulación utilizando diferentes configuraciones y orientación de un campo eléctrico aplicado directamente por los electrodos de baño, y finalmente la estimulación de dos dimensiones y modelado culturas unidimensionales por una variable en el tiempo del campo magnético, que induce un campo eléctrico5, 20, 21.

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Protocolo

Ética declaración: Los procedimientos que implican la manipulación de animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto de Ciencia Weizmann, y la ley israelí apropiado. El Instituto Weizmann está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC). El Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Weizmann aprobó este estudio, llevado a cabo con las neuronas del hipocampo.

1. Preparación de dos dimensiones (2D) y unidimensional (1D) cultivos de hipocampo

  1. Preparación de cubreobjetos para cultivos 2D.
    1. Preparar medio en placa (PM) compuesta de: 0,9 ml mínimo medio esencial (MEM) + 3G, 0,05 ml de suero de ternera fetal (FCS), 0,05 calor ml de suero de caballo inactivado (HI HS) y 1 l de suplemento B27. Nota: MEM + 3G contiene por cada 500 ml de MEM x 1, 1 ml de gentamicina, 5 ml de estabilizado 100x de L-glutamina (ver
    2. Prepare tampón de borato compuesta de: 1,9 g de bórax (tetraborato sódico decahidrato) en 200 ml de agua destilada doble (DDW) (de la mezcla a 60 ° C) y 1,24 g de ácido bórico en 200 ml de DDW. Valorar la solución final a pH 8,5 usando HCl 1 M. Nota: La solución final es de 400 ml 0,1 M tampón de borato.
    3. Sumergir cubreobjetos de vidrio en ácido nítrico al 65% durante 2 h. Enjuague tres veces en DDW, seguido de tres enjuagues con reactivo analítico absoluto (AR ABS) etanol.
    4. Pase cada cubreobjetos brevemente a través de la llama de un quemador Bunsen dos o tres veces durante 1 - 2 s, y luego dejar incubar durante la noche en placas de 24 pocillos con 1 ml de solución de poli-L-lisina al 0,01% diluido 1: 5 en tampón de borato ( 0,1 M, pH 8,4). A continuación, enjuagar cubreobjetos en DDW tres veces y dejar con 1 ml PM por pocillo en un estándar de 37 ° C, 5% de CO2 durante la noche.
  2. Preparación de cubreobjetos para cultivos 1D.
    1. g limpiaLasl cubreobjetos por inmersión en una solución base de piraña consistente en 75 mL de DDW, 25 mL de solución de amoníaco al 25% y 25 mL de peróxido de hidrógeno al 30%. Colocar la solución con los cubreobjetos de vidrio en una placa calefactora a ~ 50 ° C durante 30 min y luego secar los cubreobjetos de vidrio con nitrógeno.
    2. Cubra los cubreobjetos primero con una fina película de cromo (99,999%) de 6 Å de espesor seguido por una capa de oro de 30 ˚ (99,999%), usando deposición de vapor o de pulverización catódica.
      1. Para conseguir una velocidad de pulverización catódica de 0,05 - 1 Å / s, utilice una máquina de pulverización con 2 vigas eléctricas y un sistema de vacío de 260 l / s con tamaños de objetivo 2 "y 4". Utilice una etapa de rotación que puede ir de 0 a 100 rondas por minuto (RPM). Utilice una potencia de pulverización de corriente continua (CC) de 0 - 750 vatios.
      2. Utilice una rotación de 30 rpm y argón 99,999% para obtener plasma a 10 mTorr de presión en la cámara.
      3. Maneje la fuente de alimentación de las pistolas pulverizadoras a una potencia de pulverización de 40 W DC para el cromo, lo que lleva a ~ 0.12 A / s tasa de cobertura, ya los 10 W de potencia DC pulverización catódica por el oro, lo que lleva a ~ 0,28 Å / s.
    3. Disolver 0,1 g de 1-octadecanotiol en 100 ml de etanol ABS AR usando ultrasonidos durante 30 min. Coloque cubreobjetos recubiertos Cr-Au durante 2 h en esta solución, después se lava con etanol AR ABS y seco con nitrógeno.
    4. Preparar una solución de 100 de solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato ml (D-PBS) y 3,5 g de un co-polímero tri-bloque (véase la Tabla de Materiales / reactivos) por agitación durante 1 - 2 h a 600 - 700 rpm. Colocar cubreobjetos en la solución durante 1 h. cubreobjetos secos con nitrógeno.
    5. Mecánicamente grabar el patrón deseado por el rascado de la capa de bio-rechazo 22. Para ello, el uso de un trazador de pluma, donde la pluma se sustituye por una aguja de grabado. Rayar el patrón a través de las capas de metal para alcanzar el vidrio subyacente. Controlar este proceso por un ordenador para lograr un patrón deseado replicado. Los patrones formados por este proceso son demostrar D en la Figura 2 y Figura 3 .
    6. Preparar una capa biocompatible de 100 ml de D-PBS, 3,5 g de copolímero tribloque, 35,7 μL / ml de fibronectina y 29 μl / ml de laminina.
      1. Esterilizar cubreobjetos en luz ultravioleta durante al menos 10 min. Incubar cubreobjetos en la solución biocompatible preparada durante la noche.
        NOTA: La capa biocompatible sólo se formará cuando la capa de bio-rechazo haya sido grabada en el paso anterior.
      2. Al día siguiente lavar cubreobjetos dos veces con P-DBS. Incube los cubreobjetos en PM durante la noche. Los cubreobjetos ahora están listos para el recubrimiento celular.
  3. Realizar la disección de acuerdo con los procedimientos estándar que se han publicado extensamente con anterioridad 23 , 24 .
    1. En resumen, extraer el hipocampo o la corteza de embriones de rata, típicamente el día E19, o de ratones, típicamente al día E17 23 ,class = "xref"> 24.
    2. Disociar las células primero en solución de papaína para 20 - 30 min, seguido de trituración mecánica 24 con pipetas de vidrio cuyas puntas son pulida al fuego.
      NOTA: Si las células provienen de ratones modificados genéticamente entonces el tejido de cada embrión se debe mantener en un tubo de plástico por separado 1,5 ml durante todo el proceso.
    3. Contar las células con azul de tripano antes de sembrar.
      NOTA: Para los animales genéticamente modificados el recuento debe hacerse por separado para cada embrión.
    4. Para los cultivos 2D, semillas de neuronas de ratón en 750.000 y neuronas de rata en 850.000 células por pocillo. Para 1D, semilla a 650.000 células por pocillo. Agitar la placa ligeramente inmediatamente después de la siembra para asegurar una cobertura homogénea del cubreobjetos.
  4. El mantenimiento de los cultivos neuronales.
    1. Preparar el cambio de medio (CM) compuesto de (por ml):. 0,9 ml MEM + 3G, 0,1 ml HI SA, 10! L 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR) con 100x uridina
    2. Preparar medio final (FM) compuesto de (por ml): 0,9 ml de MEM + 3G y 0,1 ml HI SA.
    3. Reemplazar PM con 1-1,5 ml CM después de 4 días in vitro (DIV). A las 6 DIV, reemplazar el 50% de la CM con CM fresco. A DIV 8, cambiar el medio a 1,5 ml FM, seguido por un cambio de 50% de FM cada 2 días. Después de aproximadamente una semana emerge la actividad sincrónica espontánea.
  5. Obtención de imágenes de la actividad espontánea o evocada en cultivos neuronales con colorantes fluorescentes.
    1. Preparar una solución de 50 g de calcio colorante fluorescente sensible (véase la Tabla de Materiales / reactivos) en 50! L de DMSO (dimetil sulfóxido).
    2. Preparar la solución de registro extracelular (EM) que contiene (en mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glucosa, 45 sacarosa (pH 7,4).
    3. Incubar el cultivo neuronal en 2 ml EM con 8 l de la solución colorante fluorescente sensible al calcio durante 1 h. Proteger de la luz y gire suavemente para asegurar homogenous difusión del colorante a las células.
    4. Reemplazar solución con EM fresco antes de la imagen. La imagen fluorescente se demuestra en la Figura 4.
    5. Image en un microscopio de fluorescencia con filtros ópticos para imágenes de fluorescencia de calcio (pico de excitación a 488 nm, pico de emisión a 520 nm), utilizando una cámara y software capaz de cuantificar la intensidad de cualquier región de interés (ROI) dentro del campo de visión de el microscopio.

2. La estimulación eléctrica de las Culturas

NOTA: La configuración básica para la estimulación eléctrica se muestra en la Figura 1. Una hoja de la cubierta en la que el cultivo neuronal se ha cultivado durante aproximadamente 14 días se coloca en una placa de Petri con un microscopio de fluorescencia. La actividad eléctrica de las neuronas se forma la imagen utilizando colorantes sensibles al calcio, mientras que se aplica un voltaje a través de dos pares de electrodos de baño que se colocan fuera de la cultura. Los electrodos son accionados por comogenerador ignal cuya salida es amplificada por un amplificador de canal dual. Control de tensión para la estimulación se prefiere sobre el control de la corriente más estándar 25, 26 debido a que los vectores de campo eléctrico se determinan directamente, permitiendo así que la suma de vectores sencillo y combinación. Esto requiere un cuidadoso control de la uniformidad del campo eléctrico, que puede ser realizada sobre toda la muestra para el caso de control de tensión. Cuando se utiliza el cuidado de control de voltaje se debe tomar para evitar cualquier bucles de tierra y la homogeneidad del campo eléctrico debe ser verificada (ver 2.2 más abajo).

  1. Para la estimulación eléctrica con un campo eléctrico homogéneo de utilizar un par de hilos de electrodos paralelos.
    1. Utilice electrodos de platino con un espesor del orden de 0,005 '' (127 m). Cuando se utiliza con los cubreobjetos de 13 mm, asegurar que la distancia entre los dos electrodos es de alrededor de 11 mm, y la posición del electrodos 1 mm por encima del cultivo.
      NOTA: Para hacer el soporte del electrodo (figuras 5A y 6A) utilizar politetrafluoroetileno (PTFE). Perforar orificios estrechos a través del PTFE para insertar los electrodos. El dispositivo debe ser más alta que la solución extracelular de manera que el extremo superior, donde se exponen los electrodos, nunca va a entrar en contacto con la solución. Para el aislamiento, el uso de pegamento epoxi en cualquier parte de los conductores de electrodos que podrían estar expuestos.
    2. Utilice una forma de impulso cuadrado con un ciclo de trabajo del 50%, sin componente de corriente continua para evitar la electrólisis. Variar duración de impulso entre 10 microsegundos y 4 ms para causar estimulación efectiva sin quemar la cultura. Asegúrese de que la amplitud es del orden de ± 22 V (véase la Figura 5). El pulso cuadrado se puede observar en un osciloscopio conectado en paralelo a los electrodos.
      NOTA: Para facilitar la programación de cualquier forma de onda deseada, utilice un software de edición de forma de onda comercial (véase la lista de materiales
  2. Para la prueba de homogeneidad de campo emplea un electrodo de sonda. Usar una rejilla de al menos 1 mm x 1 mm para permitir que la sonda se puede mover en la zona entre los electrodos y medir el potencial eléctrico.
    1. Medir el potencial eléctrico. Utilizar figure-protocol-1 para calcular el campo eléctrico. Utilice uno de los electrodos como un electrodo de referencia. Medir el campo eléctrico con diferentes duraciones de pulso entre 100 mu s a 4 ms (véase la figura 5B para un ejemplo de duración del pulso 100 mu s) para verificar que el campo es homogéneo dentro de la gama de duraciones estimulantes.
      NOTA: Véase la Figura 5D para un ejemplo de una homogeneidad del campo eléctrico medido cuando la duración del impulso fue de 1 ms.
  3. Utilice 2 pares perpendiculares de electrodos de baño para producir más complicadas formas de campo eléctrico, y paraser capaz de orientar el campo en diferentes direcciones (véase la Fig. 6B). Se utilizará el dispositivo con 2 pares de electrodos, y se observó la señal en cada par de los electrodos en dos osciloscopios separadas.
    1. Coloque los electrodos 1 mm por encima de la cultura y a una distancia de 10 - 11 mm uno de otro. Asegúrese de que ambos pares de electrodos son flotantes (no tener conexión a tierra), y no tienen ningún terreno común mediante la medición de la resistencia entre cualquier conjunto de electrodos y verificar la ausencia de cortocircuitos entre cualquiera de los electrodos. Compruebe que todo el equipo usado, que está conectado a los electrodos (tales como los osciloscopios, los amplificadores, los generadores de señales, etc.) está flotando con respecto a tierra mediante la comprobación de que todo el equipo está flotando y que ninguno de los electrodos de referencia está tocando cualquier equipo con conexión a tierra.
    2. Para cambiar la orientación del campo, variar la amplitud de la tensión alimentado a los dos pares de electrodos con res(Véase la figura 7A ). Por ejemplo, para 0 ° usar ± 22 V en el par de electrodos que son perpendiculares al patrón y 0 V para el otro electrodo. Para 45 °, utilice ± 15,6 V en ambos pares de electrodos sin desfase, para una suma de vector de amplitud de 15,6 2 + 15,6 2 = 22 2 .
    3. Para aplicar un campo giratorio utilice una única forma de onda de un impulso de tensión senoidal y una única forma de onda de un impulso de tensión coseno a los dos pares de electrodos para producir un campo eléctrico giratorio de amplitud fija (véase la Figura 6B ).
      NOTA: Como se puede ver en la Figura 6B , cuando se usa un ciclo de una onda sinusoidal con ± 22 V en un electrodo y un ciclo de una onda coseno con ± 22 V en el otro electrodo, la suma vectorial es un campo eléctrico giratorio con La duración del ciclo igual que las ondas seno y coseno, y con una amplitud de ± 22 V.
  4. Para medir y calcular ChronAXIe y Reobase de los axones en el cultivo neuronal vs. dendritas en la misma cultura realizan los siguientes pasos.
    1. Utilizar un colorante fluorescente sensible al calcio para obtener imágenes de calcio como se describe en la Tabla de Materiales / reactivos y en 1,5) con un cultivo 1D modelado en fino (170 m), largo (10 mm) líneas. colorante sensible al calcio se aplicará a la cultura, y se incubó durante 45 minutos. El colorante se lava mediante la sustitución con una solución de grabación fresco.
    2. Desconectar la red para lograr las estadísticas de población de la respuesta directa a la estimulación eléctrica, sin el efecto de la transmisión sináptica. Para hacerlo, aplicar una combinación de 40 M de bicuculina, la acción inhibidora de ácido gamma-aminobutírico-A (GABA A) receptores que bloquea, 10 mM de 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX) , para bloquear la α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA) y kainato y 20? M de (2R) -amino-5-phosphonovaleácido ric (APV), que bloquea la N-metil-D-aspartato (NMDA). Los bloqueadores se añaden a la solución de grabación.
    3. Aplicar un pulso cuadrado como se describe en 2.1 y 2.3 con diferentes duraciones de tiempo de entre 100 mu s y 4 ms. La señal se puede observar en el osciloscopio.
    4. Utilice un microscopio de fluorescencia con un programa de adquisición de imágenes (ver 1.5) para supervisar la intensidad de los transitorios de calcio en varios ROIs, conteniendo cada una unos pocos cientos de neuronas. Adquirir imágenes con una cámara EMCCD sensibles (véase la lista de materiales), capaz de una velocidad de adquisición de imagen de al menos 20 fotogramas por segundo. El cambio en la intensidad de la luz es proporcional a la cantidad de neuronas que fueron estimuladas. Estimar la fracción de las neuronas estimuladas utilizando el cambio relativo en la intensidad.
    5. Para cada duración de impulso (100 mu s a 4 ms), cambiar la amplitud de la tensión aplicada a los electrodos a partir de una tensión, donde no se observa cambio en la intensidad (algunos voltios), a thtensión e donde los cambios en la intensidad debido a la tensión aplicada ha saturado (hasta ± 22 V).
      NOTA: El cambio de intensidad se distribuirá como acumulativa gausiana 5 con respecto a la tensión aplicada para la estimulación para cada tiempo de duración del impulso de tensión.
    6. Ajustar una distribución de Gauss acumulativa para la intensidad frente a la tensión aplicada para cada duración y extraer la media de Gauss de esta forma.
      NOTA: Este medio es la tensión representativa a la que respondieron las neuronas.
    7. Al final de este proceso de obtener para cada duración de la estimulación de una tensión media a la que respondieron las neuronas. Usar estos pares de duraciones y fortalezas para trazar las curvas de fuerza-duración (véase la Figura 7).

3. Estimulación Magnética de culturas

Nota: La configuración básica para la estimulación magnética se muestra en la Figura 2. En la parte superior derecha se muestraun microscopio de fluorescencia invertida que se utiliza para colorantes sensibles imagen de calcio en las neuronas. La bobina magnética (círculos azules) se coloca aproximadamente 5 mm concéntricamente por encima de una cultura anillo neuronal, (contorno azul). Una bobina de recogida (círculo rojo) en la circunferencia de la placa de Petri supervisa la tensión inducida por el pulso magnético. En la parte superior izquierda se muestra la dinámica de medida de la bobina de estimulador magnético (MS) con una carga de tensión del condensador de 5,000 kV, como integrado a partir de la bobina de recogida. El campo eléctrico inducido (calculado para un radio de anillo de 14 mm) se representa en verde, mientras que el campo magnético se representa en azul. En la parte inferior se muestran las imágenes de la cultura neuronal. En la parte inferior izquierda es una imagen de campo brillante de un patrón de 24 mm cubreobjetos. Las áreas blancas son las neuronas. El patrón fotografiado consta de cultivos de anillos concéntricos con diferentes radios. En la parte inferior derecha es un zoom sobre un segmento corto de los anillos, que muestra las neuronas individuales. Para una escala, wid de los anillosº es de aproximadamente 200 m.

  1. Cultivar las neuronas en un patrón de anillo circular (grabado al agua fuerte tal como se describe en 1.2.5) para la estimulación cultura 1D. Use un calcio colorante fluorescente sensible para la formación de imágenes de calcio (tal como se describe en la sección 1.5) con un cultivo 1D modelado en fino (170 m), (10 mm) líneas largas.
    1. Utilice una bobina magnética circular y la posición de una placa de Petri de aproximadamente 5 mm por debajo y concéntricos con la bobina. Utilice una bobina costumbre de 30-mm (diámetro interior, 46 mm de diámetro exterior) de la bobina aproximadamente con una inductancia de L = 90 mH impulsado por una MS caseras o comerciales cargados con una tensión máxima de 5 kV.
    2. Descargar un alto voltaje y la corriente a través de una bobina conductora utilizando un interruptor de alta corriente de alto voltaje para estimular magnéticamente cultivos neuronales. El estimulador magnético (MS) se puede construir como se describe en 21 el uso de grandes condensadores, del orden de 100 mF, para obtener un alto voltaje de de 1 - 5 kV. Alternativamente, puede utilizar un comercialmenteMS disponible (ver Tabla de Materiales / Reactivos ).
      NOTA: Utilice un alambre de cobre rectangular recubierto de poliéster de 0,254 mm de espesor y 6,35 mm de ancho para fabricar una bobina hecha en casa 21 . Haga girar los alambres en marcos hechos a la medida, aislados con fibras de vidrio y fundidos en epoxi (ver Tabla de Materiales / Reactivos ). Alternativamente, utilice bobinas disponibles en el mercado (ver Tabla de Materiales / Reactivos ).
  2. Utilice campos magnéticos giratorios para estimular cultivos 2D.
  3. Ahora, use los campos magnéticos giratorios para estimular culturas 2D. Disparar el TMS sin cultivo en el plato, a diferentes intensidades, para mostrar la correlación lineal de la lectura de la bobina con las intensidades.
  4. A continuación, mientras registra transitorios de calcio con un cultivo neuronal, comienza a disparar el TMS a intensidades crecientes mientras se registran tanto los transitorios de calcio como la bobina. Al principio, las ráfagas de la red observadas como grandes transitorios de calcio, shoULD no sincronizar con recoger los picos de bobina de EMT. Continuando para aumentar la intensidad, en algún momento, los transitorios de calcio comienzan a ser sincronizado con los picos de TMS. Alternativamente, o además, después de lograr una respuesta sincronizada, empezar a disminuir las intensidades hasta que se abolió la sincronización, para determinar el umbral de TMS.
    Nota: Las condiciones deben mantenerse estrictamente fijan para cada una de las configuraciones, utilizando el volumen exacto cada vez, los mismos vasos y bobina posiciones exactas y orientaciones.
    1. Montar la bobina de recogida en la base del plato de grabación de modo que está en un plano paralelo a la cultura neuronal y en una posición fija con respecto a la cultura.
      NOTA: Esto asegura que la dependencia de la colocación de la bobina de captación con respecto al imán es fiel a la posición de la cultura y que cualquier discrepancia en el posicionamiento será insignificante en las lecturas de la bobina captadora.
      1. Utilizar dos bobinas independientes que sonposicionado perpendiculares entre sí (Figura 8B) para generar un campo eléctrico magnético e inducido giratorio. Conectar cada bobina para sus propios MS. Asegúrese de que los estimuladores descargan corrientes similares en un retardo de fase de 90 grados (Figura 10A), lo que resulta en un campo magnético giratorio que escanea 270 grados del espacio real en un campo máximo de ~ 270 V / m (Figura 10B).
      2. Coloque el cultivo neuronal dentro de un recipiente de vidrio esférico lleno de la solución de registro externa (EM).
      3. Monitor de estimulación (cambio en la intensidad de fluorescencia de las neuronas) con la cámara como se describe en el paso 2.4.4.
      4. En el caso de las bobinas cruzadas (Figura 8B), la posición de la bobina captadora paralelo y a una distancia específica por debajo de la cultura neuronal. cuidadosamente mantener esta configuración en todos los experimentos.
  5. Calcular analíticamente el campo eléctrico para Configura 1Dción por E max = k 1 Br, donde E max es la amplitud máxima del campo eléctrico inducido y se dirige a lo largo de la tangente de los anillos con radio r. B es la amplitud del impulso magnético y k 1 es una constante de proporcionalidad dimensional que puede ser medido usando la bobina de recogida (Figura 8A).
  6. Use un paquete de simulación numérica (véase la lista de materiales) para simular numéricamente el campo eléctrico 21.

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Resultados

El protocolo presentado permite la fácil patrón de cultivos neuronales. Cuando se combina con varios métodos que hemos desarrollado para la estimulación, que permite hacer mediciones de algunas propiedades de las neuronas intrínsecas tales como cronaxia y Reobase 5, para comparar las propiedades de las neuronas sanas y enfermas 27, para encontrar formas óptimas para estimular las culturas como una función de su estructura y muchos más nuevo...

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Discusión

patrón 1D es una herramienta importante que se puede utilizar para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, hemos utilizado 1D patrón para crear puertas lógicas a partir de cultivos neuronales 29 y más recientemente para medir la cronaxia y Reobase de neuronas de hipocampo de rata 5, y la ralentización de la velocidad de propagación de la señal de la actividad de disparo en Down neuronas síndrome del hipocampo en comparación con el de tipo salvaje (WT) neuronas del hipoc...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef y Eitan Reuveny de discusiones muy útiles. Los autores agradecen a Ilan Breskin y Jordi Soriano para el desarrollo de las primeras versiones de la tecnología. Los autores agradecen a Tsvi Tlusty y Jean-Pierre Eckmann para obtener ayuda con los conceptos teóricos. Esta investigación fue apoyada por la Fundación Minerva, el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Israel, y por la Fundación de Ciencias de Israel subvención 1320-1309 y la beca de la Fundación Nacional de Ciencias Bi-2008331.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
APVSigma-AldrichA8054Desconecte la red. Mencionado en la sección 2.4.2
B27 suppGibco17504-044Medio de recubrimiento. Mencionado en la sección 1.1.1
bicucullinaSigma-Aldrich14343Desconecte la red. Mencionado en la sección 2.4.2
Bórax (tetraborato de sodio decahidrato)Sigma-AldrichS9640Tampón de borato. Mencionado en la sección 1.1.2
Ácido bóricoFrutarom LTD5550710tampón de borato. Mencionado en la sección 1.1.2
CaCl2 , 1 MFluka 21098Solución de grabación extracelular. Mencionado en la sección 1.5.2
CNQXSigma-AldrichC239Desconecte la red. Mencionado en la sección 2.4.2
COMSOLCOMSOL IncMultifísica 3.5Simulación numérica. Mencionado en la sección 3.5.2
D-(+)-glucosa, 1 MSigma-Aldrich65146Medio de recubrimiento, solución de registro extracelular. Mencionados en las secciones 1.1.1 y 1.5.2
celulares D-PBSSigma-AldrichD8537. Mencionado en las secciones 1.2.4 y 1.2.6
FCS (FBS)Gibco12657-029Medio de recubrimiento. Mencionado en la sección 1.1.1
FibronectinaSigma-AldrichF1141Bio Coating. Mencionado en la Sección 1.2.6
Tecnologías Fluo4AMLifeF14201Imágenes de actividad espontánea o evocada. Mencionado en las secciones 1.5.1, 1.5.3 y 1.5.5
FUDRSigma-AldrichF0503Cambio de medio. Mencionado en la sección 1.4.1
GentamicinaSigma-AldrichG1272Medio de recubrimiento, Medio de cambio, Medio final. Mencionado en la Sección 1.1.1
GlutaMAX 100xGibco35050-038Medio de recubrimiento, Medio de cambio, Medio final. Mencionado en la sección 1.1.1
Hepes, 1 MSigma-AldrichH0887Solución de registro extracelular. Mencionado en la Sección 1.5.2
HI HSBI04-124-1AMedio de recubrimiento, Medio de cambio, Medio final. Mencionado en las secciones 1.1.1, 1.4.1 y 1.4.2
KCl,  3 MMerck1049361000solución de registro extracelular. Mencionado en la sección 1.5.2
Laminin Sigma-AldrichL2020Bio Recubrimiento. Mencionado en la Sección 1.2.6
MEM x 1Gibco21090-022Medio de recubrimiento, Medio de cambio, Medio final. Mencionado en la sección 1.4.1      1.4.2
MgCl2 , 1 MSigma-AldrichM1028Solución de registro extracelular. Mencionado en la sección 1.5.2
NaCl, 4 MBio-Lab19030591solución de registro extracelular. Mencionado en la sección 1.5.2
OctadecanetiolSigma-Aldrich01858Limpieza de cubreobjetos recubiertos de Cr-Au (cultivos 1D). Mencionado en la sección 1.2.3
pluracare f108 nf prillBASF Corparation 50475278Recubrimiento de biorrechazo, bio recubrimiento. Mencionado en las secciones 1.2.4 y 1.2.6
Solución de poli-L-lisina al 0,01% Sigma-Aldrich  P47075Promover la división celular. Mencionado en la sección 1.1.4
Sacarosa, 1 MSigma-AldrichS1888Solución de registro extracelular. Mencionado en la sección 1.5.2
Thiol Sigma-Aldrich1858. Mencionado en la sección 1.2.3
URIDINASigma-AldrichU3750Cambio de medio. Mencionado en la Sección 1.4.1
Máquina pulverizadoraAJA International, IncATC Orion-5Series Recubrimiento de vidrio con finas capas de metal. Mencionado en la Sección 1.2.2
Trazador de plumas Hewlett Packard HP 7475AGrabado del patrón en el cubreobjetos recubierto. Mencionado en la sección 1.2.5
Electrodos hilos A-M Systems, Carlsborg WA767000Estimulación eléctrica de cultivos neuronales. Mencionado en las secciones 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4.5
Generador de señalesBKPrecision4079Conformación de la señal eléctrica. Mencionado en la Sección 2.3
AmplificadorcaseroAmplificación de voltaje de la señal desde el generador de señal hasta los electrodos. Mencionado en la Sección 2.3
de alimentación MPS-3005 LK-3 Fuente de alimentación a la máquina de pulverización catódica. Mencionado en la sección 1.2.2.3
Estimulación magnética transcranealMagstim, Spring Gardens, Reino UnidoRapid 2Estimulación magnética del cultivo neuronal. Mencionado en las secciones 3.1, 3.3 y 3.4
EpoxiCognisVersamid 140Fundición de bobinas caseras. Mencionado en la sección 3.4
Carcasa epoxiEPON 815 Fundición de bobinas caseras. Mencionado en la sección 3.4
Alambres de platino de 0,005 '' de espesor; Sistemas A-M,   Carlsborg WA  767000Estimulación eléctrica de cultivos neuronales. Mencionado en la Sección 2.1
Bobina magnética circularCaseraEstimulación magnética del cultivo neuronal. Mencionado en la sección 3.3
WaveXpress SWB& K Precisión Software de edición de formas de onda. Mencionado en la Sección 2.1.32
Xion Ultra 897AndorCámara EMCCD sensible. Mencionado en la sección 2.4.4
CultivosRecubrimiento de biorrechazo Matriz

Referencias

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