El análisis automatizado de C. elegans Comportamiento de la nadada El uso de software Célest

Resumen

Se describe una metodología eficiente y simple para el análisis computarizado de comportamiento natatorio nematodos en líquido. El método requiere poca o ninguna inversión para C. elegans laboratorios. El hardware utilizado es estándar, y los programas de ordenador para el análisis del comportamiento (Celeste) es un código abierto uno.

Resumen

La disección de los circuitos neuronales y neuromusculares que regulan el comportamiento sigue siendo un reto importante en la biología. El nematodo Caenorhabditis elegans ha demostrado ser un organismo modelo muy valiosa para ayudar a hacer frente a este reto, de inspirar enfoques tecnológicos, la construcción de la conectoma cerebro humano, de arrojar luz sobre realidad los conductores moleculares específicas de los patrones funcionales básicos. La mayor parte de los estudios de comportamiento en C. elegans se han realizado sobre sustratos sólidos. En forma líquida, los animales exhiben patrones de comportamiento que incluyen el movimiento en un rango de velocidades en 3D, así como los movimientos de partes del cuerpo, como un rizo posterior sin cambio de forma anterior, que introducen nuevos retos para la cuantificación. Las etapas de un procedimiento sencillo, y el uso de un software que permite el análisis de alta resolución de C. elegans nadar comportamiento, se presentan aquí. El software, llamado Celest, utiliza un programa informático especializado que realiza el seguimientovarios animales a la vez y proporciona nuevas medidas de C. elegans la locomoción en líquido (natación). Las medidas se basan en su mayoría en la postura de los animales y se basan en las matemáticas utilizadas en la visión por computador y reconocimiento de patrones, sin requisitos computacionales para el umbral de puntos de corte. La herramienta de software puede ser utilizado tanto para evaluar la destreza general nadar en cientos de animales de los ensayos pequeños lotes combinados y revelar nuevos fenotipos mutantes genéticos, incluso en bien caracterizados. La preparación de muestras para análisis con Celest es simple y de baja tecnología, lo que permite la adaptación de ancho por la comunidad científica. Por lo tanto, el uso del método de cálculo descrito aquí debe contribuir a la mejor comprensión de la conducta y circuitos de comportamiento en el modelo C. elegans.

Introducción

Definiendo cómo el comportamiento de la genética, la epigenética, la experiencia y la influencia ambiente es un reto importante en la biología moderna. Los modelos simples, genéticamente susceptibles que pueden ser computacionalmente rastreados y medidos pueden hacer contribuciones importantes para alcanzar esta meta. Los nematodo Caenorhabditis elegans es uno de estos modelos. El propósito de este artículo es demostrar cómo C. elegans natación locomoción pueden ser rastreados y se cuantifica para extraer información sobre ocho nuevas características con relevancia biológica.

C. elegans tiene una vida útil relativamente corta de aproximadamente 2 - 3 w y un período reproductivo de aproximadamente 4 d a 20 ° C ^1,2. En cultivos de laboratorio estándar, este nematodo microscópico se cultiva en placas de Petri que contenían Nematodo Medios de Crecimiento (NGM) que se propagan con una fuente alimentaria bacteriana ^3,4. animales WT N2 se mueven activamente en las ondas sinusoidales elegantes en placas de agar-llenado; cambian rata movimientoes en itinerancia (búsqueda de alimento), la vivienda (navegación), o recuperándose de una comida (saciedad quiescencia inactivo) ^5. Deterioro ⁶ ó ^7-12 años de edad pueden alterar dramáticamente el movimiento de las placas.

Los genes que modulan el comportamiento, Healthspan o el envejecimiento, se pueden caracterizar funcionalmente por análisis de C. elegans los patrones de movimiento o locomoción. Un enfoque para medir healthspan es clasificar adultos mayores en tres categorías (por ejemplo, A, B, y C) de acuerdo con su locomoción en placas, con la actividad física vigorosa ser de clase A y parálisis ser de clase C ^7,8,13. Aunque tal clasificación cualitativa es útil para revelar las diferencias en la forma física, las categorías son amplias y sin límites claros y por lo tanto su puntuación está sujeto a sesgo del experimentador.

Un número cada vez mayor de seguidores han elevado la objetividad, la sofisticación y la precisión del análisis del movimiento de C. elegansen medios sólidos ^{de 14-18.} C. elegans locomoción en placas se restringe principalmente al plano en el que el animal entra en contacto con la superficie sólida de los medios de comunicación. (C. elegans también puede inducir la exploración mediante el levantamiento de la cabeza del resto del cuerpo que todavía está en contacto con una superficie sólida, el posicionamiento del cuerpo en múltiples planos. Sin embargo, este comportamiento es inusual.) Cuando se coloca en un líquido, este nematodo inicia un movimiento ondulatorio, o la natación, que cuenta con más extenso movimiento dimensional, una mayor gama de velocidad y la profundidad de movimiento, y un aumento de la incidencia con la edad de movimiento anterior diferente a posterior en comparación con animales en superficies sólidas. Como un rápido análisis de la condición física y la respuesta al nuevo entorno, un experimentador puede colocar un animal individual en una gota de líquido y anotar la frecuencia de su cuerpo se dobla bajo el microscopio de disección. La grabación de vídeo puede facilitar scoring presentes y futuras de la natación el vigor de laanimal. Sin embargo, el enfoque manual de limitar el número de características que se pueden puntuar, y está totalmente restringido a punto de marcar un animal a la vez.

La locomoción en líquido ha sido menos explorada de la locomoción en medios sólidos. De hecho, hay pocas opciones de software que son robustos y fáciles de implementar en el laboratorio para medir la locomoción en líquido ^19-24. El software de Celest (C. elegans prueba de natación) ofrece simplicidad de uso y las medidas matemáticos basados en los datos que entregan (puntuaciones de curvatura) directamente relacionadas con la naturaleza del movimiento ^8; (descripción detallada de las características y ventajas en Restif et al. ^8). Además, el análisis computacional permite la elucidación de las características fenotípicas que son imposibles para el ojo humano a marcar. En este caso, los datos que ejemplifican la resolución de este método de análisis se presentan y un fácil de poner en práctica el protocolo para grabar pruebas de nado se describe para el análisis posterior Célest.

Protocolo

1. El crecimiento de los nematodos y manipulación

1. C. elegans crecer en placas de Petri que contenían estándar NGM manchado con OP50-1 Escherichia coli como fuente de alimento ^1-3.
2. Mantenga culturas en una incubadora que mantiene la temperatura deseada. C. elegans crece bien de 15 a 25 ° C, con 20 ° C siendo la temperatura de crecimiento estándar.
   NOTA: La natación es un fenotipo robusta, sin embargo nadar vigor puede verse afectada por factores ambientales como la contaminación en las placas y el sobrecalentamiento de las culturas y las diapositivas. debe hacerse un gran esfuerzo para mantener condiciones estables.
3. Usar un pico nematodo casera hecha de un alambre de platino llama sellada en una varilla de vidrio para manejar la transferencia de los animales individuales ^4.

2. Puesta en funcionamiento para el Análisis de la nadada

1. Utilizar un sistema integrado que consiste en un microscopio estereoscópico, cámara digital CCD y el software de grabación de vídeo digital. El software de CA Célestn ser utilizado en un equipo independiente.
   1. Cubra el microscopio con un paño oscuro (por ejemplo, fieltro) para evitar el deslumbramiento en el área de colocación de natación en el portaobjetos de un microscopio y mejorar la calidad de la imagen.
   2. Ajustar la distancia de trabajo del microscopio y la ampliación de la vista de la zona de baño, y el espejo de base para obtener agudo contraste de los animales contra el fondo. Ajuste la iluminación de campo oscuro para visualizar los cuerpos de los adultos como blanco contra el fondo negro, que funciona muy bien para la visualización computacional y el seguimiento con el software de análisis de natación.
   3. Tenga cuidado de mantener el área de trabajo, portaobjetos de microscopio, y nadar caer muy limpio. Los desechos pueden interferir con el análisis mediante la oclusión de la natación libre de los adultos, y de finos hilos de fibra puede ser detectada como actora animales durante el seguimiento.

3. Preparación de los animales para el análisis de la condición física en Líquido

1. Pipeta de 60 l Otampón f 1x M9 en un anillo de 10 mm preimpreso sobre un portaobjetos de microscopio. Asegúrese de que la caída cubre por completo la zona interior del anillo. El software extrae más información natación uso de este tamaño de gota contenida en un portaobjetos de lo que sería si la utilización de placas de múltiples pocillos.
2. Recoger nematodos adultos individuales y transferirlos a la caída de tampón 1x M9, reduciendo al mínimo el transporte de bacterias que pueden enturbiar el líquido. Reducir al mínimo las bacterias colocando primero los animales para su transferencia a un lado de la placa que no contiene mucho césped bacteriano, dejando que se arrastran, y luego suavemente levantándolos.
   1. Cuando la transferencia de los nematodos en la gota, utilizar un microscopio de disección cerca de la estación de análisis para reducir la duración del tiempo de natación, que puede afectar el comportamiento de los animales ^25.
   2. Coloque sólo 4 adultos en la gota si se mueven vigorosamente y se cruzan a menudo. Como orientación para minimizar la superposición de los nadadores (que confunde el análisis computacional), considerar la colocación de4 animales por caída cuando son tan activos como los adultos jóvenes sanos, WT y 5 animales por caída cuando son más grandes y muestran menos vigor.
      NOTA: nematodos WT saludable instinto empiezan a nadar poco después de ser colocado en un líquido. Con la ayuda de un pick nematodo, separar suavemente los adultos en el descenso si se amontonan.

4. Análisis de la Condición Física en líquidos - Grabación de vídeo de Natación

1. Coloque el portaobjetos cargado con los adultos sobre la base del microscopio para grabar su natación. 30 s detalles de captura de videos de la conducta de un animal individual en líquido (Video 1), y toma de muestras de un gran número de tales registros se logra fácilmente cuando con la ayuda de software de Celest ^8,26; sin embargo, ya nadan períodos pueden ser ideal para otros estudios de comportamiento específicos ^25. Es importante destacar que, asegúrese de mantener el mismo aumento a lo largo de todas las grabaciones ya que las diferencias de aumento afecel análisis y la comparación de natación t sesgo voluntad.
   NOTA: Estos pasos se proporcionan como orientación usando el software de grabación de vídeo digital que aparece en la Tabla de Materiales; software de acceso abierto VirtualDub podría sustituir, aunque no hemos probado esto.
   1. Utilice los siguientes parámetros como guía para el análisis de natación éxito: tamaño de la imagen de 696 x 520 píxeles, resolución de imagen de 0,02 mm / pixel, y una tasa de 18 frames / s. Versiones de mayor resolución de estos ajustes pueden facilitar el seguimiento pero no afectará a las medidas calculadas por el programa.
      NOTA: La zona de natación proporcionado por la caída de 60 l de tampón 1x M9 en el portaobjetos de microscopio no tiene mucha profundidad, lo que minimiza hacia arriba y hacia abajo movimiento de natación.
2. En Configuración, vaya a 'Grabación', set 'Secuencia límite de tamaño "a" 545 marcos en el disco'. En la misma partida, marque la casilla 'Usar Recording Manager'. Haga clic en "Editar recor actualguión ding ... "botón, y bajo 'Comandos', seleccione 'Frame Grab', y bajo condiciones de parada '', introduzca 'parada después de 0: 00: 30.00".
3. Para grabar, seleccione "Nueva secuencia en la memoria RAM 'bajo el título principal y oprima el botón' Record 'rojo. El software se agarra 545 marcos de más de 30 s con la cámara digital y los mantienen en la memoria RAM.

5. Análisis de la condición física en líquidos - Tratamiento de vídeo

1. Fragmentar el video en una secuencia de cuadros de imagen haciendo clic en el encabezamiento principal y seleccionando 'secuencia completa Exportar a ... "en el software de grabación de vídeo.
   NOTA: El software de grabación de vídeo digital puede guardar los fotogramas como .bmp, .jpg, .tif, o .png, todo lo cual puede ser leído por el programa de análisis de natación que aquí se presenta. Tenga en cuenta que los archivos .tif utilizan más espacio de almacenamiento, pero algunos formatos como .jpg pueden degradar la calidad de imagen.
2. Poner en marcha el programa de análisis de natación desde MATLAB by hacer clic en el botón de ejecución.
3. En la pantalla principal del programa de análisis de nadar, utilizar el "Añadir un vídeo" o "Añadir varios vídeos 'botones para cargar secuencias de cuadros de imagen de uno en uno o en grupos, mientras que sujetan las etiquetas pertinentes, tales como el genotipo, la fecha, el juicio y la duración . El software crea una base de datos de las secuencias marcadas.
4. Habilitar el seguimiento simultáneo de múltiples animales en las secuencias subidas haciendo clic en '1. Proceso de vídeos '. En la nueva pantalla, seleccionar los vídeos que desee en el cuadro de la izquierda y haga clic en "Añadir a la lista '. Para cada vídeo, haga clic en su nombre en la lista de arriba a la derecha para mostrar la primera imagen del vídeo en la parte inferior derecha. Demarcar la zona de la piscina mediante la selección de 3 puntos en el interior del anillo, e iniciar el procesamiento haciendo clic en "Proceso de todos los vídeos que aparecen más arriba '. Ver el progreso del procesamiento en la parte inferior central.
5. Una vez completado, "Cerrar" la pantalla de procesamiento de vídeo.

6. Análisis de la Condición Física en líquidos - Medición

1. Haga clic en "2. medidas de cómputo 'para abrir una nueva pantalla en la que se pueden subir los vídeos procesados, uno a la vez, para validar o rechazar el seguimiento de animales individuales. Los vídeos que se han procesado aparecerán en la lista de la izquierda, donde el nombre del vídeo se puede hacer clic para cargar ese video.
2. Utilice este paso manual para centrarse en las áreas de seguimiento (bloques rojos) perdidas en contraste con el seguimiento de éxito (bloques verdes).
   NOTA: Como alternativa, se puede confiar en la salida automatizado de seguimiento válido ya que el software tiene un estricto sistema de seguimiento (94,1% validez como se observa en 2.020 animales de 404 vídeos ^8).
   1. Encuentra la «validez del cuerpo segmentado 'en la primera barra de color a través de la pantalla en la mitad inferior. El porcentaje de "marcos válidos 'está en verde, y el porcentaje de tramas rechazadas' 'está en rojo. ≥80% de tramas válidas que implica el seguimiento informaciones utilizado para calcular las medidas proviene de al menos 432 marcos de cada 540 en unos 30 s nadar ensayo registrado a 18 frames / s.
   2. Fácil de navegar y modificar los bloques de validez / rechazado marcos que utilizan el 'siguiente bloque', 'Cambiar validez "," bloque de Split', y las opciones de 'frame' Aislar. En el raro caso de que 2 animales se cruzaron en una zona de baño con poca gente, cambiar su número de identificación en un intervalo de trama específico con el botón 'Cambiar'.
   3. Ver los gráficos de barras en la mitad inferior de la pantalla para obtener información adicional sobre el seguimiento y las actuaciones que se solapan. La longitud del cuerpo segmentado (de animales longitud del cuerpo por trama) se correlaciona con la incidencia superpuestas.
3. Si ningún puntos brillantes en el video interfieren con el análisis, ajuste áreas brillantes en la zona de la piscina mediante la selección de la función de las «zonas de deslumbramiento.
4. Haga clic en "Guardar y medidas Calcular 'para guardar la entrada de validez antes de que acabecargar otro de vídeo procesada. En esta etapa el software calcula, en el fondo (que no se muestra al usuario), mapas de curvatura de la rendimiento de la natación de los animales individuales y los parámetros indicados a continuación (Video 2).
   NOTA: Los parámetros medidos que se centran en que aquí se describen en la Tabla 1. La tasa de iniciación de la onda, número de la onda del cuerpo, la asimetría, estiramiento, y curling se calculan sobre la base de los mapas de curvatura que el software calcula para los animales; la velocidad de desplazamiento, movimiento del cepillo, y el índice de actividad parámetros no están basados ​​en mapas de curvatura.
5. Haga clic en "Cerrar" para salir de la pantalla '' Calcular medidas.

7. Análisis de la Condición Física en líquido - Salida de los resultados

Nota: El software puede informar sobre múltiples medidas del movimiento de natación, que abarcan desde manifiestos a muy sutiles rasgos de comportamiento no anotados fácilmente por el ojo (Videos 3 y 4). Aquí elatención se centra en 8 parámetros que suelen mostrar un buen rango dinámico: Onda tasa de iniciación, número de la onda del cuerpo, la asimetría, Stretch, Curling, Velocidad de desplazamiento, movimiento del cepillo, y el índice de actividad.

1. En la pantalla principal del programa, haga clic en "3. Mostrar resultados 'para obtener el resultado del análisis.
2. Crear grupos de la muestra para el tratamiento estadístico mediante la selección de las secuencias analizadas deseados de marcos en el cuadro de la izquierda y su traslado a un grupo de muestra nueva o existente haciendo clic en los botones 'Añadir a la muestra seleccionada' o 'Añadir a la nueva muestra.
3. Haga clic en "mostrar gráficas de estas muestras 'para ir a una segunda pantalla que muestra los gráficos y estadísticas clave de las muestras para cada uno de los 8 parámetros de selección en la parte superior de la pantalla.
   1. Si lo desea, ajuste la representación de los gráficos de barras en la parte superior izquierda de la pantalla utilizando los 'Colores', '# de histogramas' y '#' de gusanos selectores.
4. Utilizar'' Histogramas 2D para trazar combinaciones de cualquiera de los dos parámetros a través de la 'medida en el eje X' y 'Medida en el eje Y' menús desplegables a la izquierda de la pantalla. Haga clic en "Cerrar" para salir y regresar a la pantalla "Mostrar resultados".
5. Utilice el "Exportar ..." botón en la parte superior izquierda de la pantalla para guardar los datos numéricos detallados como archivo .csv para abrir y manipular aún más en un programa de hoja de cálculo.
6. pantalla 'Cerrar' 'los resultados de visualización' para volver a la pantalla principal y haga clic en "Salir" para garantizar el ahorro de la base de datos que contiene las secuencias de vídeo analizados.

Resultados

Mediante el análisis de la locomoción en líquido (natación), fenotipos que no son fácilmente evidentes en medios sólidos (rastreo) pueden ser dilucidados. Para cuantificar la locomoción natación hemos desarrollado un software específico que mide diez nuevos parámetros de comportamiento natatorio ^8. Los ocho más útil de estos parámetros se describen en detalle en la Tabla 1. Estos parámetros se denominan Wave tasa de iniciación, número de la onda del cuerpo, Asimétrico, estiramiento, Curling, Velocidad de desplazamiento, movimiento del cepillo, y el índice de actividad. Los estudios que ejemplifican el poder del software han definido el deterioro funcional de cientos de envejecimiento adultos con WT, fondos de comportamiento o de longevidad mutante ^8, y han analizado el bien estudiado mutantes longevidad edad-1 (hx546) y daƒ-16 (mgDƒ50), los cuales albergan mutaciones que alteran la vía normal de señalización de la insulina. La edad-1 gen codifica para una phosphatidylinositide 3-quinasa (PIK3) Subunidad catalítica, y, cuando se alberga el hx546 mutación, provoca prolongación de la vida y la resistencia al estrés ^27-29. El gen daƒ-16 codifica para un factor de transcripción forkhead cuadro de O (FOXO) que acorta la vida útil y deteriora la respuesta al estrés cuando se suprime ^30-33.

Ciertos parámetros de la natación como Wave tasa de inicio, la velocidad del viaje, del movimiento del cepillo y el índice de actividad disminuyó gradualmente con la edad, incluso en contextos genéticos favorables (Figura 1). De acuerdo con los conocimientos actuales, de larga vida con la edad (1) hx546 mutantes mostraron un rendimiento físico más vigoroso que WT en edades avanzadas y muy viejos. También como se había anticipado, de corta vida daƒ-16 (mgDƒ50) mutantes visualizan en peligro el rendimiento, especialmente a edades muy antiguas. Sorprendentemente, fue sólo bajo el escrutinio de la visión por ordenador y el paquete de Celest algoritmo matemático que el superiorendimiento de la natación r-1 de edad mutantes (hx546) era detectable en el inicio de la edad adulta. El hecho de que los resultados en mejora del rendimiento físico en la vida adulta temprana edad-1 (hx546) sugiere que esta mutación afecta el desarrollo normal y / o fenotipo de adultos jóvenes de una manera no apreciado anteriormente (Figura 1).

Número de la onda del cuerpo, la asimetría, estirar y Curling parámetros mostraron una tendencia aumenta con la edad en el WT y el envejecimiento de los adultos mutantes (Figura 2). Curiosamente, el nivel de resolución del software reveló rasgos de comportamiento más finos como la simetría sostenido de mutantes a lo largo de su vida útil y la incapacidad de los viejos-16 daƒ mutantes extremas (mgDƒ50) edad-1 (hx546) para estirar y enroscarse en la medida en la misma WT y la edad-1 (hx546) -Edad adultos hacen.

Además de la pérdida inevitable total de perfo físicarmance debido a la edad, cada individuo adulto muestra un patrón único a través de la progresión del proceso de envejecimiento, incluso cuando la genética y el medio ambiente son prácticamente homogénea ^7. (Mediante el control de la genética y el medio ambiente, los posibles efectos de confusión de estos factores se reducen al mínimo, al presentar la importante contribución de la estocasticidad a la degeneración relacionada con la edad.) A C. elegans población sincronizada de los antecedentes genéticos similares que son mantenidas en un ambiente controlado todavía contiene una mezcla de diferentes clases de individuos de acuerdo con sus peculiaridades envejecimiento. A pesar de todo el comienzo como adultos sanos, algunos pierden rápidamente su condición física (malos gerentes, clase C), mientras que otros mantienen el vigor para el período más largo de tiempo (gerentes agraciado, clase A). por lo tanto malos gerentes parecen tener un healthspan considerablemente más corto que quinceañeros agraciado.

Como se detalla más adelante en nuestro estudio ^8, gerentes agraciados mantienen fitn física juveniless como se observa por comparación con el perfil de natación de los adultos más jóvenes (Figuras 3, 4 y 5). Esta aptitud sostenida es comparable con el rendimiento físico de edad-1 mutantes (hx546) de larga vida en la era post-reproductiva (D 11) (Figuras 1 y 2). Por el contrario, los malos gerentes pierden drásticamente gran parte de su capacidad física poco después de la reproducción, que se realiza en niveles similares a los de los adultos de edad extremas y progeric daƒ-16 (mgDƒ50) (Figuras 1 - 4). Estas similitudes se pueden extraer por comparación bruta, sin embargo, las firmas particulares son fácilmente perceptibles a una mirada más cercana. Por ejemplo, aunque hay alguna correlación entre el grado de tanto estiramiento y rizado en los tipos silvestres de edad extremas y los mutantes de envejecimiento (Figura 2), esta relación no se observa en los malos gerentes (Figuras 4 y 5), que muestran mayor propensión a enroscarse pero hastade no estirar en las muestras ensayadas. El software se presenta por lo tanto añade dimensión al análisis de la condición física o la capacidad de locomoción, proporcionando las herramientas para estudios más sofisticados que no eran tratables antes. En resumen, Celest proporciona lecturas completas en forma de ocho nuevas medidas destacadas aquí, que definen la huella digital del comportamiento del concreto genética, epigenética, y fondos ambientales, lo que permite la identificación de patrones de parámetros únicos y comunes que pueden ser las firmas de condiciones específicas ( ambiental, farmacológico, nutricional), biológicos u organismo estados como healthspan.

Figura 1: Informes de software Célest en onda Iniciación Rate (A), el Índice de Actividad (B), Pincelada (C) y Velocidad de desplazamiento (D) de WT, edad-1 (hx546), y daƒ-16 (mgDƒ50) Adultos D 4 (edad adulta), 11 (post-reproducción) y 20 (extrema de edad). '#' 'En la serie' medios eje y. WT son de color gris, la edad-1 en verde y daƒ-16 en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). WT-edad Same y mutantes de envejecimiento se compararon de significación estadística utilizando ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Dunnett. **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 en cada punto de datos de cuatro ensayos independientes. Tenga en cuenta que aquí, y para la Figura 2, cada uno de 30 s de vídeo se realiza con 4 animales, y para cada ensayo que anotar un total de 16 animales a partir de 4 vídeos de natación, esto se hace para 4 repeticiones biológica para cada punto de datos se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Informes de software en el cuerpo Número de onda (A), Asimétrico (B), Estiramiento (C), y se encrespa (D) para WT, edad-1 (hx546) y (mgDƒ50) Adultos D 4 16 daƒ-(jóvenes la edad adulta), 11 (post-reproducción) y 20 (extrema de edad). '#' 'En la serie' medios eje y. WT son de color gris, la edad-1 en verde, y daf-16 en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). WT-edad Same y mutantes de envejecimiento se compararon de significación estadística utilizando ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Dunnett. *, P = 0,01 - <0,05; **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 en cada punto de datos a partir de cuatro independientes, 30 s nadan ensayos.e.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Informes de software en la onda de Iniciación Rate (A), Índice de Actividad (B), Pincelada (C), y Velocidad de desplazamiento (D) para los adultos WT jóvenes (D4), y de la misma edad agraciado y Bad Age (D10 y 11). '#' 'En la serie' medios eje y. WT jóvenes son de color gris, clase A agraciados gerentes en verde, y de clase C malos gerentes en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). Clase A elegantes y gerentes de clase C malos gerentes se compararon con D 4 adultos jóvenes usando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. ****, P <0,0001. n = 27 en cada punto de datos de dos independientes, 30 s nadan ensayos. Gráfico se modifica ligeramente de Restif et al. (2014) ^8, que fue publicado bajo el creativoCommons Reconocimiento (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ licencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Informes de software en el cuerpo Número de onda (A), Asimétrico (B), y Curling (C) para WT adultos jóvenes (D 4), y de la misma edad Age elegantes y Bad (D 10 y 11). '#' 'En la serie' medios eje y. WT jóvenes son de color gris, clase A agraciados gerentes de gerentes verde y de clase C malas en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). Clase A elegantes y gerentes de clase C malos gerentes se compararon con D 4 adultos jóvenes usando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. **, P = 0,001 - <0,01; ****, P <0,0001; et al. (2014) ^8, que fue publicado bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) licencia http: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Informe sobre el estiramiento de software para adultos WT joven (D4), y de la misma edad agraciado y Bad Age (D 10 y 11). WT jóvenes son de color gris, clase A agraciados gerentes de gerentes verde y de clase C malas en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). Clase A gerentes elegantes y de clase C malos gerentes se compararon con D 4 yos jóvenes adultos utilizando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. n = 27 en cada punto de datos de dos ensayos independientes. Gráfico se modifica ligeramente de Restif et al. (2014) ^8, que fue publicado bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) licencia http: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Natación de un grupo representativo de C. elegans adultos. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

Video 2: Celest Software Cálculo de mapas individuales curvatura de las Actuaciones de natación de los animales ensayados. Los mapas de curvatura se calculan en el fondo; que no aparecen en la interfaz de software con el usuario. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

Video 3: Software de cálculo de las medidas de baño individuales basados en mapas de curvatura. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

Video 4: Cálculo Software de Medidas de natación que no dependen de la curvaturaMapas. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

Discusión

El uso de C. elegans como sistema modelo sigue aumentando debido a su maleabilidad genética, la trazabilidad y la anatomía experimental anotadas, en detalle meticuloso. Por ejemplo, la estructura neuronal y la conectividad de la C. elegans hermafrodita está claramente trazaron ^34-36, facilitando enormemente la investigación de los circuitos neuronales específicos que controlan conductas particulares. 302 neuronas constituyen el sistema nervioso del adulto hermafrodita, que procesar una amplia gama de entradas sensoriales en salidas de comportamiento básicas como la locomoción. La estructura del sistema nervioso más complejo masculina también se ha descrito ^37, lo que permite circuitos sexo-específicas que deben abordarse. ³⁷

C. elegans comportamiento ha sido ampliamente estudiado en placas de cultivo estándar que contienen medio sólido. Desde WT C. elegans se mueve en ondas sinusoidales previsibles en las placas de agar-llenado, las desviaciones de lapatrón general puede ser detectada por el ojo y obtuvo manualmente. Este enfoque, sin embargo, está sujeta a criterio del experimentador y mucha mano de obra. Herramientas de hardware y software diseñados para rastrear y medir C. elegans locomoción en medios sólidos eliminar el sesgo de subjetividad y permite estudios a gran escala, lo que permite cuestiones biológicas más sofisticados que deben abordarse. La base de datos del comportamiento reciente creado por el laboratorio Schafer ¹⁶ es un excelente ejemplo de la extensión y profundidad de análisis que se ha logrado con un sistema computacional para la locomoción en los platos.

Cuando WT C. elegans se coloca en forma líquida, el animal se adapta rápidamente su movimiento al nuevo entorno, iniciando un baño. C. elegans natación utiliza un mayor rango de movimiento que se arrastra y puede ser más irregular ^8. Software como Célest pretende llenar el hueco para el análisis detallado de C. elegans comportamiento en estado líquido, permitting cuantificación de parámetros de movimiento asociado a que no se miden fácilmente por el ojo de la ONU con ayuda de, o que se pueden lograr con mayor rapidez que la calificación manual. En 8 h dura un individuo puede procesar hasta 200 videos, ~ 1.000 registros por día.

El software define parámetros que evalúan la natación que sirven como una huella digital completa de la condición física y el comportamiento. Además de enriquecer la comprensión de las complejas facetas de C. elegans comportamiento en el líquido y sus vías moleculares subyacentes, este software puede ser utilizado para explorar varios aspectos de la biología incluyendo respuestas farmacológicas, el envejecimiento, y el comportamiento distintos. Que aquí se presenta, el resumen de los cambios cuantificados que se producen en el rendimiento físico de C. elegans adultos, ya que la edad es un ejemplo de tal aplicación del software (para una descripción más detallada, ver Restif et al. ^8). En el contexto del envejecimiento, algunos parámetros medidos disminuyeron mientrasotros aumentaron o no cambiar constantemente de tipo salvaje. Las tendencias se confirmaron en gran medida por el perfil de cálculo de los mutantes de la longevidad, y los perfiles relativos de cohortes ager agraciado y malos de las poblaciones de la misma edad mantenidos en condiciones ambientales uniformes. La alta resolución del software también puede revelar fenotipos sutiles previamente desconocido en los mutantes ampliamente caracterizados (por ejemplo, la edad-1 (hx546) en la Figura 1).

Hay algunos pasos particularmente críticos del protocolo descrito. El mantenimiento de un ambiente de temperatura constante entre el entorno de la piscina y el cultivo en placa de presión es importante para la reproducibilidad de natación, por lo que los experimentadores se les anima a ir a grandes esfuerzos para evitar los cambios de temperatura al azar. medios de natación deben estar a la misma temperatura que las placas. Del mismo modo, una cuidadosa atención al tamaño de la gota para el nado ayudará a asegurar la reproducibilidad. Por último, es prudente pensar enavanzar sobre la descarga de los archivos de video grandes que se acumulan. Se recomienda el procesamiento de imágenes en un sitio aparte del equipo de captura de vídeo.

El uso del software que aquí se presenta para el análisis de baño tiene ciertas limitaciones. En primer lugar, si bien los programas pueden rastrear simultáneamente múltiples animales, si hay más de cinco animales se analizan en conjunto, hay una mayor probabilidad de que los animales van a nadar a través de uno al otro en las imágenes de vídeo. Cuando el programa no puede determinar de forma inequívoca qué animal era que, según censura esas tramas de datos. Aunque esta característica programa asegura que los datos de los animales individuales son de alta calidad, que limita el rendimiento. En segundo lugar, las imágenes deben ser bastante limpio, que está libre de polvo, manchas y resplandor de las luces, como señales asociadas también pueden confundir el análisis de imágenes. Como se ha señalado en la sección 2.1.1 de protocolo, una inversión muy baja tecnología que puede ayudar en gran medida la captura de imágenes mediante la eliminación de las complicaciones con las fluctuaciones in ambiental de la iluminación es para cubrir el área del escenario con una tela oscura que no permite que la luz ambiente para llegar a la etapa. En tercer lugar, el programa está optimizado para los animales en la etapa adulta. Joven larvas nadan muy rápido y tienen cuerpos pequeños, lo que aumenta error del programa. En cuarto lugar, algunos de los software utiliza MATLAB, y cuando hay actualizaciones de versiones y / o actualizaciones del sistema operativo, algunos enlaces de programa puede ser interrumpido. Actualmente, el software está optimizado para su uso en MATLAB 2015b y Mac OS versión 10.10, pero esperamos pronto para publicar una versión de software que es más robusto frente a tales cambios. Por último, los archivos de datos de vídeo pueden llegar a ser grandes rápido, y requieren espacio de almacenamiento que ha de adjudicarse.

En resumen, se presenta aquí es una metodología sencilla que se puede implementar fácilmente por cualquier laboratorio sin mucha inversión para crear vídeos de C. elegans que nadan para el análisis Célest. Características del paquete de software incluyen una amplia automatización de seguimiento a través deanálisis, el seguimiento de múltiples animales simultánea, y el uso de bases matemáticas (es decir, medidas de curvatura) para la cuantificación de la mayoría de los parámetros de locomoción. El software es de código abierto, con código y demos a disposición del público como se detalla en Restif et al. ^8. A pesar de que el programa cuenta con el análisis de la visión por ordenador avanzado de búsqueda, otros sistemas de seguimiento publicado (por ejemplo, Greenblum et al., 2014 ³⁸⁾ son compatibles con el análisis de parámetros del software que aquí se presenta. Futuras mejoras serán dirigidos hacia convertir el software en un paquete más robusto que no restringe el uso de las versiones específicas de los sistemas operativos mencionados anteriormente (también indicados en la Tabla de Materiales).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
REACTIVO
N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		C. elegans WT (ancestral).
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Nivel de bioseguridad: BSL-1.
OP50-1 Escherichia Coli	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Cepa resistente a la estreptomicina de OP50.  Nivel de bioseguridad: BSL-1.
Sal de sulfato de estreptomicina	Sigma-Aldrich	S6501
Portaobjetos de microscopio impresos	Los	microportaobjetos de anticuerpos fluorescentes Thermo Fisher Scientific Gold Seal: 3032-002	tienen dos círculos grabados de 10 mm de diámetro delineados con tinta cerámica blanca
Medio de crecimiento de nematodos (NGM)	Para 1 L: 17 g de agar, 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 1 mL 1 m de CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Colesterol en etanol, 25 mL 1 M KPO4 tampón, 1 mL 1 M MgSO4, H2O a 1 L. Esterilizar en autoclave.		Stiernagle, T. Mantenimiento de C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
Búfer M9	Para 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O a 1 L. Esterilizar en autoclave.		Stiernagle, T. Mantenimiento de C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
EQUIPMENT
CeleST	Driscoll Lab, Rutgers University	C. elegans Swim Test	Open Source, ver http://celestmod.github.io/CeleST/ y http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLAB	www.mathworks.com/downloads	MatLab versión 2015b (best)	La versión de CeleST que se muestra aquí tiene la mejor funcionalidad con Mac OS 10.10 y MatLab 2015b. MATLAB 2015B introdujo cambios en la forma en que MATLAB manejaba los gráficos, incluida una nueva convención de codificación y sintaxis. Estos cambios resolvieron un problema que no se podía resolver de manera elegante (principalmente porque los componentes internos de MATLAB realmente necesitaban la revisión de gráficos importante implementada en MATLAB 2015B). Por este motivo, CeleST siempre debe ejecutarse en MATLAB 2015B o versiones posteriores. Sin embargo, para los usuarios que no tienen acceso a la versión 2015B o posterior de MATLAB (o a MATLAB en absoluto), hemos creado un programa CeleST que no necesita MATLAB en el equipo en al. El posible usuario descarga un instalador y luego se instala en la computadora a través de un par de indicaciones, como la mayoría de los programas.
Mac OS		www.apple.com versión 10.10	Actualmente, CeleST ha sido portado a los principales sistemas operativos (Windows, Mac y Linux). El código actual se puede ejecutar en cualquiera de los sistemas operativos y existen versiones para cada sistema operativo que ni siquiera requieren que los usuarios tengan MATLAB para usar CeleST (esta versión requiere una descarga grande). La versión de Windows es la que menos se ha probado y es la más propensa a los errores como tal. Linux ha sido moderadamente probado. Y Mac ha sido y sigue siendo probado exhaustivamente (principalmente porque es el sistema operativo de nuestro laboratorio).
Microscopio estereoscópico	Zeiss	Stemi 2000-C
Instrumentos de diagnóstico	base de luz transmitida	TLB 3.1
Cámara CCD digital	QImaging	Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
Software de grabación de video digital	Norpix	Streampix versión 3.17.2