Protocolo CÚBICO Visualiza la expresión de la proteína en la resolución de la celda individual en su totalidad para la piel Mount

Summary

Este informe describe un protocolo cúbico a aclarar las biopsias de espesor completo de piel de ratón, y visualizar los patrones de expresión de proteínas, células proliferantes, y sebocitos en la resolución de una sola célula en 3D. Este método permite una evaluación precisa de la anatomía y la patología de la piel y de los fenotipos anormales en la epidermis líneas de ratones modificados genéticamente.

Abstract

La piel es esencial para nuestra supervivencia. La capa externa de la epidermis se compone de la epidermis interfollicular, que es un epitelio escamoso estratificado que cubre la mayor parte de nuestro cuerpo, y anejos epidérmicos tales como los folículos pilosos y glándulas sudoríparas. La epidermis se somete a la regeneración de toda la vida y en respuesta a una lesión. Esto es posible gracias K14-expresión de poblaciones / células progenitoras madre epidérmicas basales que están fuertemente regulados por múltiples mecanismos reguladores activos dentro de la epidermis y entre la epidermis y la dermis. Este artículo describe un método simple para aclarar biopsias de espesor completo de ratón de la piel, y visualizar los patrones de expresión de proteínas K14, Ki67 etiquetados células en proliferación, Nile Red etiquetado sebocitos, y el etiquetado nuclear DAPI a una resolución de una sola célula en 3D. Este método permite una evaluación precisa y cuantificación de la anatomía y la patología de la piel y de los fenotipos anormales en la epidermis líneas de ratones modificados genéticamente. El protocolo cúbico es THe mejor método disponible hasta la fecha para investigar las interacciones moleculares y celulares en las biopsias de piel humana a una resolución de una sola célula.

Introduction

La piel es esencial para nuestra supervivencia. Se compone de tres capas principales la epidermis externa, la dermis y la hipodermis. La epidermis es un tejido altamente regenerativa. Es un epitelio escamoso estratificado, que consiste principalmente de los queratinocitos. Los queratinocitos nacen en la capa basal, y se mueven hacia arriba a través de las capas suprabasal vez que se diferencian, y, finalmente, que se desprenden de la capa córnea exterior alrededor de un mes después de su nacimiento. La epidermis se desarrolla una serie de apéndices incluyendo los folículos pilosos y las glándulas sebáceas. Los folículos pilosos también se regeneran de manera cíclica a lo largo de la vida ^1. La capacidad de regeneración de la epidermis está activado por la presencia de células madre y progenitoras que se encuentran en la capa basal de la epidermis interfolicular y folículo piloso ^2.

Muchas vías de señalización han sido implicados en el desarrollo epidérmico y la regeneración. Algunas de ellas tienen lugar dentro desólo la epidermis, tales como la vía de hedgehog. Otros eventos de señalización tienen lugar entre dermis y la epidermis ^3. Por ejemplo, se cree que las señales de Wnt de la dermis que es importante para el desarrollo del folículo del cabello, y que son secretadas por la papila dérmica en el inicio de la fase anágena para activar la proliferación de células madre / progenitoras folículo piloso bulto y crecimiento del folículo piloso ^4. Es importante comprender los mecanismos celulares y moleculares que controlan el desarrollo y la regeneración de la epidermis para comprender mejor la forma en que pueden ser perturbados en la enfermedad de la piel regenerativo como el cáncer de piel.

En este artículo se describe un Lear C, T nobstructed B cócteles Maging lluvia I y análisis omputational protocolo (cúbico) C ^5-7 para aclarar preparaciones para la piel todo el montaje, y visualizar los patrones de expresión de proteínas en 3 dimensiones con una resolución única célula mediante microscopía confocal. El método CUBIC implica la inmersión de la pieltejido en dos cócteles químicos a base de aminoalcohol. Estas soluciones se ajustan los índices de refracción en la muestra de piel, dejando el tejido transparente y las proteínas intactas, permitiendo la inmunodetección con una resolución de una sola célula.

El uso de este protocolo cúbico, la basal y la proliferación de poblaciones de queratinocitos en la epidermis interfolicular y en el folículo piloso se obtuvieron imágenes en biopsias completos de ratones de tipo salvaje utilizando anti-Keratin14 (K14) y anticuerpos anti-Ki67 de piel de espesor. glándulas sebáceas en biopsias de piel de tipo salvaje también se visualizaron mediante tinción con Rojo Nilo. Por último, las poblaciones de queratinocitos basales en wildtype y biopsias de piel YAP2-5SA-? C hiperplásicos se compararon ^8.

Este protocolo permite CÚBICO evaluación visual de la expresión de la proteína en las biopsias de piel de espesor total en la resolución de una sola célula, y es una herramienta importante tener en cuenta la anatomía de la epidermis y defectos morfológicos en la piel de organismos genéticamente modificadosratones, y para investigar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen en el desarrollo y la regeneración epidérmica.

Protocol

Ética Declaración: Todos los procedimientos que involucran sujetos animales siguen las directrices del Comité de Atención y Ética Animal (ACEC) en la UNSW Australia bajo protocolo aprobado ACEC 13 / 64B.

1. Preparación del tejido transparente de piel de ratón

Nota: Todos los ratones utilizados en este estudio estaban en un fondo 6 C57BL / genética

1. Colección de tejidos de la piel del ratón.
   1. Humanitariamente la eutanasia a los ratones por dislocación cervical.
   2. Retirar con cuidado los pelos de la zona de la piel con un condensador de ajuste relevante teniendo cuidado de no herir la piel.
   3. Lavar la piel para descontaminar con etanol 70% en tampón fosfato salino (PBS).
   4. Levantar la piel dorsal del cuello con unas pinzas y hacer la incisión con tijeras.
   5. Diseccionar un área grande de piel dorsal del ratón (aproximadamente 1,5 x 4 cm).
   6. Aplanar la piel dermis hacia abajo sobre un papel de filtro, y tomar nota de la orientación antero-posterior de la muestra.
   7. Trim papel de filtro alrededor de la piel disecada, y colocar en un tubo de 15 ml llena con una solución recién preparada de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS.
   8. Fijar durante 1 hora a temperatura ambiente, o durante la noche en el refrigerador a 4 ° C.
   9. Lavar la piel 2 x 5 min en PBS en un tubo de 15 ml.
      Nota: El siguiente (01/01/10 hasta 01/01/12) son pasos opcionales para el almacenamiento a largo plazo de los tejidos.
   10. Deshidratar la piel disecada en PBS con una concentración creciente de etanol (25%, 50% 70%) en un tubo de 15 ml durante los pasos de lavado 1-hr a temperatura ambiente.
   11. Almacenar la piel deshidratada en etanol 70% en PBS en un tubo de 15 ml a 4 ° C hasta su uso posterior.
   12. 4 horas antes de borrar, rehidratar tejido de la piel en PBS con disminución de la concentración de etanol (70%, 50%, 25%, 0%) en un tubo de 15 ml durante los pasos de lavado 1-hr a temperatura ambiente.
2. Eliminación de las biopsias de piel de ratón
   1. Preparar la solución de CUBIC1 compensación por disolución de 3,85 g de urea y 3,85 g de N, N, N ', N'-tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiamina en 5,38 ml de agua destilada en un calentador fijado a 60 - 70 ° C. Utilice un agitador caliente.
   2. Añadir 2,31 g de polietilenglicol mono-p-isooctilfenil éter / Triton X-100 a la solución una vez que es claro y se ha enfriado a temperatura ambiente.
   3. Cortar la piel del ratón con una cuchilla afilada en biopsias de dimensiones aproximadas de 0,2 x 0,5 cm, y sumergirse en 5 ml de solución CUBIC1 claro en un tubo de 15 ml. Para optimizar la visualización de los folículos pilosos, asegúrese de que el lado más largo de la biopsia se corta a lo largo de la dirección antero-posterior de la muestra.
   4. Colocar sobre una plataforma giratoria en un horno de hibridación a 37 ° C.
   5. Cambie la solución de aclaramiento después de 7 días. Preparar solución fresca CUBIC1 antes de su uso.
   6. Compruebe la transparencia de los tejidos después de 7 días. Si es necesario, deje biopsias en solución clarificadora CUBIC1 hasta que el tejido es totalmente transparente.
   7. Una vez que la biopsia de piel es transparente,eliminar la solución CUBIC1, y añadir 4 ml de PBS 1X para lavar el tejido 4 veces durante 6 horas a 37 ° C.
   8. Se lava el tejido de la piel en 20% w / v de sacarosa en PBS en un tubo de 15 ml durante 4 horas a 37 ° C.
   9. Congelar el tejido en el montaje de compuesto medio temperatura óptima de corte (OCT) en un tubo de 15 ml durante la noche en un congelador C -80 °.
      Nota: Este paso se incrementará la permeabilidad de la biopsia para la penetración anticuerpo en pasos posteriores.

2. La tinción de inmunofluorescencia

1. Descongelar tejido de 1.2.9) a temperatura ambiente durante 2 - 3 hr.
2. Lavar el tejido en el tubo de 15 ml con 5 ml de PBS durante 8 horas a temperatura ambiente para eliminar octubre Compuesto.
3. biopsias de la transferencia a un tubo de 2 ml, y se incuba el tejido en el conejo 1 ml anti-Keratin14 o anticuerpo anti-Ki67 de conejo, ambos diluidos 1: 100 en PBST (PBS + 0,1% de Triton-X100) durante 3 días en un agitador en un 37 ° C horno.
4. biopsias de transferencia a un tubo de 15 ml, unand lavar tejido 4 veces durante 6 h en 5 ml de PBST en un agitador en un horno de 37 ° C.
5. biopsias de transferencia a un tubo de 2 ml, añadir 1 ml de anti-conejo Alexa594 anticuerpo secundario diluido 1: 100 en PBST y se incuban 3 días en un agitador en un horno de 37 ° C.
6. biopsias de transferencia a un tubo de 15 ml, y se lavan tejido 4 veces durante 6 h en 5 ml de PBST en un agitador en un horno de 37 ° C.
7. biopsias de transferencia a un tubo de 2 ml, añadir 1 ml 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) solución de contraste nuclear (1: 1.000) en PBST y se incuba durante la noche en un agitador en un horno de 37 ° C.
8. Retire la solución contratinción DAPI, y añadir 1 ml de PBST al tubo 2 ml para lavar el tejido 4 veces durante 6 horas en un agitador en un horno de 37 ° C.
   Nota: Paso opcional: Las biopsias se pueden almacenar en la oscuridad en 1x PBS con azida de sodio 0,02% durante al menos 3 semanas.

3. La tinción con Rojo Nilo

1. Disuelva el polvo Rojo Nilo en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final de 1 mg / ml
2. Añadir 1 l solución de Rojo Nilo a 1 ml de PBS a una concentración final de 1 mg / ml.
3. Descongelar tejido de 1.2.9) a temperatura ambiente durante 2-3 horas, y lavar con 5 ml de PBS durante 8 horas a temperatura ambiente.
4. Transferencia biopsias a un tubo de 2 ml, y sumergir el tejido en 1 ml de solución colorante Rojo Nilo durante 2,5 horas a temperatura ambiente.
5. Lavar las biopsias de piel en el tubo de 2 ml con 1 ml de PBST 4 veces durante 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Retire la solución PBST del tubo de 2 ml, añadir 1 ml de solución DAPI nuclear contratinción (1: 1000) en PBST y se incuba durante la noche a temperatura ambiente.
7. Retire la solución contratinción DAPI, y añadir 1 ml de PBST en el tubo de 2 ml para lavar el tejido de la piel 4 veces durante 6 horas a temperatura ambiente.
   Nota: Paso opcional: Las biopsias se pueden almacenar en la oscuridad en 1x PBS con azida de sodio 0,02% durante al menos 3 semanas.

4. Imaging

1. Preparar la solución CUBIC2 de compensación, que contiene 50% De sacarosa, 25% (w / v) de urea, 10% (v / w) (w / v) 2,2 ', 2' '- nitrilotrietanol, y 0,1% (v / v) de Triton X-100.
2. Incubar el tejido de la piel en 1 ml de solución CUBIC2 en un tubo de 2 ml en un agitador durante 24 horas en un horno de 37 ° C. Este paso incluso el índice de refracción del tejido.
3. Verificar la claridad del tejido. Una vez que está claro, la posición de toda la biopsia de piel (0,2 x 0,5 cm) en su lado más largo sobre un cubreobjetos de vidrio, de manera que la dirección de la longitud de los folículos pilosos es paralela a la superficie de cubreobjetos (# 1 24 x 60 mm)
   Nota: Paso opcional: biopsias teñidas con anticuerpos se pueden almacenar en solución CUBIC2 durante aproximadamente 7 días. biopsias teñidas con rojo Nilo solamente se pueden almacenar en solución CUBIC2 para un máximo de 1 día, y deberían obtenerse imágenes tan pronto como sea posible.
4. Preparar cámara de imágenes (Figura 1)
   Nota: consumibles necesarios para la preparación de la cámara de imágenes son: blue tack, plastilina o similar, y 2 cubreobjetos (24 x 50 mm) (F1A igura).
   1. Prepare dos tiras delgadas de blue tack (diámetro de aproximadamente 1 mm x 2 cm), y dos cubreobjetos (Figura 1B).
   2. Coloque tiras de la tachuela azul en una hoja de la cubierta, dejando suficiente espacio para biopsia de piel (Figura 1C). 4.4.3)
   3. Coloque biopsia de la piel en tiras entre en el cubreobjetos en una gota de solución CUBIC2 (Figura 1C).
   4. Cubra biopsia de la piel con el segundo cubreobjetos (Figura 1D).
5. Coloque la cámara de formación de imágenes con la biopsia de la piel montado en la platina de un microscopio confocal y mover el tejido en la vía de la luz.
6. Analiza la muestra utilizando una fuente de luz de mercurio o halógeno y filtros de epifluorescencia estándar (por ejemplo, DAPI / GFP / CY3 / Cy5) para identificar las regiones con fluorescencia manchadas de interés.
7. Áreas de imagen de interés utilizando un objetivo 10X y 20X (NA 0,75) y las técnicas de imagen confocal de fluorescencia estándar (por ejemplo., Con DAmuestras PI manchado iluminan con un láser de 405 nm y recogen la señal de fluorescencia entre 425 - 475 nm, y con Alexa Fluor 594 o muestras teñidas con Rojo Nilo iluminan con un láser de 561 nm y recogen la señal de fluorescencia entre 570 - 620 nm).
8. Generar imagen Z-pilas de cada región de interés utilizando Z-pila de software de adquisición de imágenes de microscopio (por ejemplo., El uso de elementos de software de imágenes de NIS 4,13 como se describe a continuación).
   1. Asegurar la potencia del láser óptima y PMT HV / Offset ajustes se han seleccionado para recoger la fluorescencia de la muestra.
   2. Abra la barra de herramientas "ND Adquisición" de "Controles de adquisición".
   3. Seleccione la pestaña "Configuración Z serie" (asegúrese de que todas las otras fichas no están seleccionadas).
   4. Durante la exploración en vivo, se centran en la parte superior de la muestra y pulse el botón "Inicio".
   5. Enfoque a la parte inferior de la muestra y pulse el botón "Abajo".
   6. Entrada requerida tamaño de paso (o el botón de tamaño de paso de prensa optimizado).
   7. Press el "Ejecutar ahora" botón.
   8. Guardar resultantes Z-pilas como TIFF individuo imagen pilas (1 fluorocromo por imagen pila Z).
9. Usar imagen Z-pilas para reconstruir las regiones de volumen 3D de interés usando un software de análisis 3D (por ejemplo., Utilizando Imaris x64 7.2.3 tal como se describe más adelante).
   1. Iniciar el software de análisis.
   2. Elija el botón "Supera" en la barra de herramientas para la generación de volumen 3D.
   3. Abrir primera imagen en color Z-pila (por ejemplo., DAPI).
   4. Utilice la herramienta de 'añadir canal' para añadir canales adicionales de color, un canal por fluorocromo. Así, una muestra que contiene tanto DAPI y Alexa Fluor 594 fluorocromos requerirá dos canales.
   5. Utilice la herramienta de "Propiedades de imagen" para ajustar las dimensiones de píxeles correcta (voxel) (XYZ), tal como se determina en el punto 4.7 anterior.
   6. Utilice la herramienta de "Ajuste de pantalla" para cambiar los colores de los canales según sea necesario (por ejemplo, ajustar el canal de DAPI a azul, Alexa Fluor 594 de canal a rojo).
   7. para poposicionarlo el volumen 3D en la ventana de imagen, utilice el ratón del ordenador para hacer clic y arrastrar el volumen según sea necesario.
   8. Utilice la herramienta de "instantánea" en la barra de herramientas para generar capturas de pantalla de la imagen en 3D.
   9. Utilice la herramienta de "Animación" en la barra de herramientas para generar películas de rotación de la muestra 3D.

Results

Biopsias de piel de espesor completo dorsal de ratones de tipo salvaje adultos se aclararon, se tiñeron con una unión basal de queratinocitos marcador Keratin14 (K14) de anticuerpos, y los núcleos se contratiñeron con una solución de tinción DAPI (Figura 2 y la película 1).

Núcleos DAPI-positivos eran visibles a través de la muestra (Figura 2A, C), y K14 tinción fue visible exclusivamente en la capa basal de espesor de una célula de la epide...

Discussion

Los mecanismos de regulación que controlan el desarrollo y la homeostasis de la piel se estudian con más frecuencia en 2D usando seccionar los tejidos y la tinción histológica o etiquetado con anticuerpos, que permite solamente una apreciación restringido de la morfología de la piel, las poblaciones de células o la expresión de proteínas. Una serie de métodos se han desarrollado para mejorar la visualización de la organización espacial de las células y las proteínas con una resolución de una sola célula en 3 dimensiones...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6418
Etanol 96% (sin desnaturalizar)	Suministro químico	UN1170
Nilo Red	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N',N' -tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiamina	Merck Millipore	821940
Éter de polietilenglicol mono-p-isooctilfenilo	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389
Temperatura óptima de corte (OCT) Compuesto	Tissue-Tek	4583
anticuerpo anti-queratina14	Covance	PRB-155P
anticuerpo anti-Ki67	Abcam	ab16667
Burro anti-conejo Alexa 594	Life Technologies	A21207
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D2650
Urea	Merck Millipore	66612
2,2′,2′ '-nitrilotriethanol	Merck Millipore	137002
Microscopio Confocal	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Microscopio
cruZer6 Recortador Facial	Braun	Braun cruZer6 Cara
Azida sódica	Sigma-Aldrich