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Artículo de método

El concepto Terroir interpretada a través de baya de la uva metabolómica y transcriptómica

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DOI:

10.3791/54410

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5 de octubre de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este artículo se describe la aplicación de la metabolómica no focalizados, transcriptómica y análisis estadístico multivariado para transcripciones de bayas de uva y metabolitos con el fin de profundizar en el concepto de terroir, es decir, el impacto del medio ambiente sobre los rasgos de calidad de las bayas.

Resumen

Terroir se refiere a la combinación de factores ambientales que afectan a las características de los cultivos como la vid (Vitis vinifera) de acuerdo con hábitats particulares y prácticas de gestión. Este artículo muestra cómo ciertas firmas de terroir se pueden detectar en el metaboloma de bayas y transcriptoma de la Corvina vid cv utilizando el análisis estadístico multivariado. El método requiere en primer lugar un plan de muestreo apropiado. En este caso de estudio, se seleccionó un clon específico del cultivar Corvina para minimizar las diferencias genéticas, y las muestras se obtuvieron de siete viñedos que representan las tres macro zonas diferentes durante tres temporadas de cultivo diferentes. Un enfoque metabolómica LC-MS no directo se recomienda debido a su alta sensibilidad, acompañado de procesamiento de datos eficiente utilizando software MZmine y una estrategia de identificación de metabolitos basado en análisis de árbol de fragmentación. Análisis completo transcriptoma se puede lograr utilizando microarrayssondas que contienen cubriendo ~ 99% de todos los genes de vid predichos, lo que permite el análisis simultáneo de todos los genes expresados ​​diferencialmente en el contexto de diferentes terroirs. Por último, el análisis de datos multivariados basado en métodos de proyección se puede usar para superar el efecto fuerte-vendimia específica, permitiendo que los metabolómica y datos transcriptómica a integrarse y se analizaron en detalle para identificar correlaciones informativos.

Introducción

análisis de datos a gran escala basado en los genomas, proteomas y transcriptomes, metabolomes de plantas ofrece una visión sin precedentes en el comportamiento de los sistemas complejos, tales como las características de terroir del vino, que reflejan las interacciones entre plantas de vid y su entorno. Debido a que el terroir de un vino puede ser distinto, incluso cuando los clones de vid idénticas se cultivan en diferentes viñedos, el análisis de la genómica es de poca utilidad debido a que los genomas clonados son idénticos. En cambio, es necesario tener en cuenta las correlaciones entre la expresión génica y las propiedades metabólicas de las bayas, que determinan las características de calidad de vino. El análisis de la expresión génica a nivel de los beneficios del transcriptoma de las propiedades químicas similares de todas las transcripciones, lo que facilita el análisis cuantitativo mediante la explotación de características universales tales como la hibridación con sondas inmovilizadas en microarrays. En contraste, los métodos analíticos universales en la proteómica unand metabolómica son más difíciles debido a la enorme diversidad física y química de las proteínas y los metabolitos individuales. En el caso de la metabolómica esta diversidad es aún más extrema porque metabolitos individuales difieren enormemente en tamaño, polaridad, la abundancia y la volatilidad, así que no hay proceso de extracción simple o método de análisis ofrece un enfoque holístico.

Entre las plataformas de análisis adecuado para metabolitos no volátiles, los basados ​​en cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS) son mucho más sensibles que otras alternativas tales como HPLC con rayos ultravioletas o de diodos detectores de matriz (HPLC-UV, HPLC-DAD ) o espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), pero el análisis cuantitativo por HPLC-MS puede ser influenciada por fenómenos tales como el efecto de la matriz y la supresión de iones / mejora 1-3. La investigación de tales efectos durante el análisis de bayas de uva Corvina por HPLC-MS usando una fuente de ionización por electropulverización (HPLC-ESI-MS), mostró que los azúcares y otras moléculas con los tiempos más bajos de retención fueron fuertemente subregistro, probablemente también refleja el gran número de moléculas en esta zona, y que la abundancia de otras moléculas se puede subestimar, sobrestimado o no afectado por el efecto de la matriz , pero la normalización de datos para el efecto de la matriz parecía tener un impacto limitado en el resultado global de 4,5. El método descrito en este documento se optimiza para el análisis de metabolitos a medio de polaridad que se acumulan en altos niveles en las bayas de uva durante la maduración, y que se ven afectados significativamente por el terroir. Ellos incluyen antocianinas, flavonoles, flavan-3-oles, procianidinas, otros flavonoides, resveratrol, estilbenos, ácido hidroxicinámico y ácidos hidroxibenzoico, que en conjunto determinan el color, el sabor y las propiedades relacionadas con la salud de los vinos. Otros metabolitos, tales como azúcares y ácidos orgánicos alifáticos, son ignorados debido a la cuantificación por HPLC-MS es poco fiable debido a la matriz efect y la supresión de iones fenómenos 5. Dentro de la gama de polaridad seleccionado por este método, el enfoque es no directo en que tiene por objeto detectar como muchos metabolitos diferentes como sea posible 6.

Transcriptómica métodos que permiten a miles de transcripciones de vid para controlar de forma simultánea se ven facilitadas por la disponibilidad de la secuencia completa del genoma de la vid 7,8. métodos transcriptómica temprana basada en la secuencia de ADNc de alto rendimiento se han desarrollado con el advenimiento de la secuenciación de próxima generación en una colección de procedimientos que se describen colectivamente como tecnología de RNA-Seq. Este enfoque se está convirtiendo rápidamente en el método de elección para estudios de transcriptómica. Sin embargo, una gran cantidad de literatura sobre la base de microarray, que permiten a miles de transcripciones para ser cuantificados en paralelo por la hibridación, se ha acumulado para la vid. De hecho, antes de RNA-Seq se convirtió en una tecnología dominante, muchas plataformas de microarrays comerciales dedicados habían sidodesarrollado permitiendo transcriptoma de la vid a inspeccionar con gran detalle. Entre la gran variedad de plataformas, sólo dos, efectuar análisis de transcriptoma en todo el genoma 9. La matriz más evolucionado permitió la hibridación de hasta 12 muestras independientes en un solo dispositivo, lo que reduce los costes de cada experimento. Los 12 sub-series compuestas cada 135.000 sondas 60-mer que representan 29.549 transcripciones de vid. Este dispositivo ha sido utilizado en un gran número de estudios 10-24. Estas dos plataformas se han interrumpido, sino una nueva costumbre de microarrays se ha diseñado recientemente y representa un desarrollo más reciente, ya que contiene un número aún mayor de las sondas que representan los genes recién descubiertos vid adicionales 25.

Los conjuntos de datos de gran venta producidas por la transcriptómica y metabolómica análisis requieren métodos estadísticos adecuados para el análisis de datos, incluyendo las técnicas multivariantes para determinar las correlaciones entre la forma diferentes de datos. Las técnicas multivariantes más utilizados son los basados en la proyección, y estos pueden ser sin supervisión, tales como el análisis de componentes principales (PCA), o supervisado, como la proyección ortogonal bidireccional a las estructuras latentes análisis discriminante (O2PLS-DA) 26. El protocolo presentado en este artículo utiliza PCA para el análisis exploratorio de datos y O2PLS-DA para identificar las diferencias entre los grupos de muestras.

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Protocolo

1. Seleccionar los materiales adecuados y construir un plan de muestreo

  1. Comenzar el experimento mediante el desarrollo de un plan de muestreo apropiado. No existe un enfoque genérico y universal, de modo de evaluar cada plan sobre una base caso por caso. Asegúrese de que el plan de muestreo indica los lugares de toma de muestras, los tiempos y el procedimiento de muestreo preciso. Véase la Figura 1 para el plan de muestreo utilizado en este estudio de caso.
    NOTA: En este estudio de caso, las bayas de uva a partir de un único clon (. Vitis vinifera cv Corvina, clon 48) se obtuvieron de siete viñedos comerciales en tres diferentes zonas horarias de macro en la provincia de Verona (Lago Garda, Valpolicella y Soave). Las principales características de cada viñedo se resumen en la Tabla 1. Las bayas se recogieron durante tres temporadas de crecimiento (2006, 2007, y 2008) en tres puntos de tiempo, correspondiente a la pinta (el inicio de la maduración), a mediados de la maduración y bayas maduras.
    1. Para cada una de las adhesiones (vineyard / año / grado de maduración), cosecha 30 grupos de diferentes posiciones a lo largo de dos hileras de vid, con alturas y ubicaciones en la planta aleatorios.
    2. Seleccione tres bayas al azar de cada grupo, evitando aquellos con daños y / o signos de infección visible.
    3. Repita los pasos 1.1.1 y 1.1.2 para obtener tres piscinas independientes.
    4. Deseed las bayas y congelar el pericarpio inmediatamente en nitrógeno líquido.
    5. Crush 10 bayas congeladas de cada grupo con una amoladora automática de molino, y dividir cada muestra en polvo en dos partes iguales, una para el análisis de transcriptómica y uno para el análisis de la metabolómica.
    6. Almacenar los polvos a -80 ° C.
A.M licenciado en Letras BM CS FA Minnesota PM
Macrozona Soave lago de Garda Valpolicella lago de Garda Valpolicella Valpolicella Soave
Altura (m) 250 120 450 100 130 250 130
Rizoma 41B S04 K5BB 420A 420A K5BB 41B
dirección de la fila EW NS EW EW EW NS NS
sistema de formación Sistema de sobrecarga (Pergola) Sistema de sobrecarga (Pergola) Posicionamiento Vertical disparar (Guyot) Sistema de sobrecarga (Pergola) OverheSistema de publicidad (Pergola) Posicionamiento Vertical disparar (Guyot) Posicionamiento Vertical disparar (Guyot)
Tipo de suelo arcilla limosa Marga Arcilla Marga Franco arcilloso franco limoso franco arcilloso
Diseño de la plantación (m) 3.20 x 1.00 4.50 x 0.80 4.00 x 1.25 3.50 x 1.20 3,50 x 0,75 2.80 x 1.00 1.80 x 0.80
Cal Total% 3.9 19.3 18.3 14.4 31 5.9 27.9
Caliza activa% 0,5 2.6 9.4 6.3 11.3 3.1 8.3
Sand% 15 47 66 42 29 13 36
marga% 43 36 21 37 39 67 36
arcilla% 42 17 13 21 32 20 28
El pH del suelo 8.3 7.9 7.8 8.2 8.2 7.8 7.9
Sustancia orgánica (%) 2.9 2.5 2.2 1.2 2.9 1.6 2.5
Fósforo intercambiable (mg / kg) 26 73 73 68 48 47 64
Potasio intercambiable (mg / kg) 190 376 620 230 168 154 126
Magnesio intercambiable (mg / kg) 272 468 848 623 294 293 183
Calcio intercambiable (mg / kg) 6500 5380 7358 6346 4652 10055 2878
Berry Azúcares Reductores 2006 211.25 ± 1.20 176.20 ± 0.42 187.40 ± 0.00 203.70 ± 1.13 212,55 ± 0,64 195.20 ± 0.00 211.65 ± 0.64
Berry Azúcares Reductores 2007 190.00 ± 1.27 165.25 ± 0.49 153.00 ± 0.42 203,60 ± 0,71 210,90 ± 0,71 192,25 ± 0,64 188,70 ± 1,84
Berry Azúcares Reductores 2008 191.35 ± 0.64 178,90 ± 0,57 170,05 ± 0,49 205.15 ± 1.48 188.70 ± 0.57 169.35 ± 0.49 108.05 ± 1.06
Berry pH 2006 3.01 ± 0.01 2,96 ± 0,01 2.84 ± 0.00 2,9 ± 0,00 2.98 ± 0.00 3.02 ± 0.00 3,06 ± 0,01
Berry pH 2007 2.97 ± 0.00 3.00 ± 0.00 2.74 ± 0.00 3,07 ± 0,01 2.98 ± 0.00 2,87 ± 0,01 3.09 ± 0.00
Berry pH 2008 2.83 ± 0.00 3,04 ± 0,01 2.71 ± 0.00 2,98 ± 0,01 2.98 ± 0.00 2.82 ± 0.00 3.11 ± 0.00
Fecha de cosecha 2006 2007 2008
envero 8 de agosto 18-Jul 12-Aug
mediados de maduración 4-Sep 8 de agosto 2-Sep
Maduro 18-Sep 29-Ago 23-Sep

Tabla 1: Principales características de cada viñedo ymuestra de la colección fechas. m = metros, EW = Coma-Oeste, NS = Norte-Sur.
figure-protocol-1
Figura 1:. Representación esquemática del procedimiento de muestreo de la producción de vino de tres macro zonas están situadas en los alrededores de la ciudad de Verona, región de Véneto, Italia. Los tres puntos de tiempo son envero (V) que representa el inicio de la maduración en la viticultura, a mediados de la maduración (MR) y bayas maduras (R). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparar polvo de la baya Extractos, Analizar los metabolitos y procesar los datos

  1. Preparar las muestras de polvo de la baya para el análisis.
    1. Preparar los extractos metabólicos de las muestras de bayas a temperatura ambiente en tres volúmenes (w / v) de metanol acidificado con 0,1% (v / v) paraácido micrófono en un baño de ultrasonidos a 40 kHz durante 15 min. Use agua LC-MS-grado y el ácido fórmico y metanol grado HPLC.
    2. Centrifugar los extractos a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    3. Diluir el sobrenadante de la etapa 2.1.2 en dos volúmenes (v / v) de agua desionizada y pasar a través de un filtro de 0,2-m.
  2. Analizar los extractos de baya por HPLC-ESI-MS.
    1. Configurar el sistema de HPLC-ESI-MS de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
      NOTA: En este estudio de caso, la configuración compuesta por un sistema de HPLC equipado con un muestreador automático, conectado en línea con un espectrómetro de masas de trampa de iones y fuente de ionización por electrospray.
    2. Conectar el sistema de HPLC con una columna de guarda C18 (7,5 x 2,1 mm 2) y una columna de fase inversa C18 (150 x 2,1 mm 2, tamaño de partícula 3 micras).
    3. Preparar los disolventes utilizados como fase móvil. Usar 5% (v / v) de acetonitrilo, 0,5% (v / v) de ácido fórmico en agua como disolvente A y 100% de acetonitrilo como solvent B. Uso acetonitrilo LC-MS-grado, agua y ácido fórmico.
    4. Ejecutar la separación por HPLC con un gradiente lineal de disolventes A y B a un caudal constante de 0,2 ml min -1 utilizando un volumen de inyección de muestra de 30 microlitros.
      1. Inicialmente equilibrar la columna con 100% A. disolvente Después de la inyección de la muestra, establecer un gradiente de 0% a 10% de disolvente B en 5 min, de 10% a 20% de disolvente B en 20 min, de 20% a 25% de disolvente B en 5 min, y del 25% al ​​70% de disolvente B en 15 min.
      2. Analizar cada muestra por duplicado. Selección aleatoria de análisis de la muestra para evitar los efectos del instrumento impulsado. Permitir 20 min para re-equilibrado con 100% de disolvente A entre cada análisis.
    5. Adquirir los espectros de masas en modos de ionización positivo y negativo alternos. Para los resultados descritos en este estudio de caso, establecer los parámetros que en la Tabla 2. El ajuste de la máquina depende de la plataforma específica.
      NOTA: Como alternativa, utilice otro palométodos capaces de acuerdo con la plataforma específica.
      1. En todos los casos, como con cualquier plataforma de separación, asegúrese de usar un tiempo de re-equilibrio adecuado, con el fin de tener tiempo de retención reproducibilidad. Cuando el número de muestras es alta (por encima de diez muestras), analizarlos en lotes de 9-10 muestras, con los programas de limpieza de la columna cromatográfica (gradientes lentos entre los dos disolventes de elución) entre cada lote. Para tener suficiente reproducibilidad tiempo de retención, asegúrese de que el primer análisis cromatográfico de cada lote es un análisis en blanco (es decir, el análisis del disolvente).
    6. También adquirir los espectros de masas en modo de iones negativos y positivos fragmentados Ajuste de las opciones de fragmentación (dos precursores de iones, EM 3). Anotar los metabolitos de análisis del árbol de fragmentación (MS / MS y MS 3) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Este es particularmente adecuado para metabolitos de las plantas, ya que son a menudo glicosilados, Therntes de la primera fragmentación (MS / MS) tiende a eliminar los restos de azúcar que salen del ion aglicona libre, y la posterior fragmentación (MS 3) ayuda a identificar la aglicona contra una auténtica biblioteca estándares.
    7. Adquirir MS / MS y MS 3 espectros en el intervalo m / z 50-1,500 con una amplitud de fragmentación de 1 V. Alternativamente, utilizar otros métodos adecuados de acuerdo con la plataforma específica.
    8. Para cada señal de m / z, comparar la MS / MS y MS 3 patrones de fragmentación y los tiempos de retención a la auténtica biblioteca normas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Muchos tipo de plataformas incluyen las instalaciones de software para construir este tipo de bibliotecas a través del análisis de patrones auténticos. Esto debe identificar muchas de las señales, pero no todas las señales será anotada.
    9. Para las señales anónimas restantes, comparar los patrones de MS 3 fragmentación / MS y MS con los publicados en la literatura, searcHing, para valores de m / z (es decir, el dígito "m / z 353" para buscar publicaciones en las que las moléculas con tales m / z se mencionan) con cualquiera de los motores de búsqueda común de libre disposición, o utilizar bases de datos en línea, como MassBank (www .massbank.jp / es / database.html) y la Base de Datos Metaboloma humano (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
Componentes del espectrómetro de masas Función parámetros
Fuente de ionización electrospray nebulización de gas 50 psi, 350 ° C
gas de secado 10 L min -1
trampa de iones y el detector Escanear Modo de barrido completo, 13.000 m / z por segundo, 50-1,500 gama m / z
Objetivo de masas 400 m / z
colisión de gas Helio
La presión de vacío 1,4 x 10 -5 mbar
fuente capilar 4000 V
Placa final compensado -500 V
Desnatadora -40 V
salida Cap -121 V
Oct 1 pb -12 V
Oct 2 pb -1.7 V
1 lente 5 V
Objetivo 2 60 V
CPI para modo de ionización positiva 20.000
CPI para el modo de ionización negativa 7.000

Tabla 2: Principales conjunto de parámetros para la adquisición de espectros de masas.

Operación Selección Función parámetros Valores
detección de pico detección de masas centroide Nivel de ruido 3.500
constructor cromatograma El punto más alto de datos lapso de tiempo mínimo 0.15
altura min 4.000
m / z tolerancia 0,3
detección de pico deconvolución pico Búsqueda mínimo local umbral cromatográfico 70
Buscar mínimo en el rango de RT (min) doce y cincuenta
altura relativa mínima 15%
Altura mínima absoluta 4.000
proporción mínima del pico superior / EDGE 2
gama Duración (min) 0-10
isótopos picos isotópicos mero - m / z tolerancia 1.2
la tolerancia RT doce y cincuenta
forma monótona No
La carga máxima 3
representante de isótopos No
Alineación Únete alineador - m / z tolerancia 1.2
Peso de m / z 10
Retención de tolerancia de tiempo doce y cincuenta
Peso para la RT 5
Requerir mismo estado de carga No
Requerir mismo ID No
Comparar el patrón de isótopos No
relleno de espacios buscador de pico - tolerancia a la intensidad 20%
m / z tolerancia 0,9
Retención de tolerancia de tiempo doce y cuarenta
corrección de RT No
Filtración Duplicar filtro de pico - m / z tolerancia 1.2
la tolerancia RT doce y media
Requerir misma identificación No

Tabla 3: Flujo de trabajo MZmine con valores específicos para procesar archivos de datos de bayas de uva LC-MS negativos.

  1. Procesar los datos de LC-MS.
    1. acceso odescargar un paquete de software de procesamiento de datos que puede extraer información relevante de muchos cromatogramas primas y construir una matriz de datos en la que cada metabolito detectado es cuantificada en cada muestra.
      NOTA: El protocolo pasos a continuación están diseñados para el código abierto de software v2.14 MZmine (http://mzmine.sourceforge.net). Es un software de código abierto para el procesamiento de datos de espectrometría de masas, con el foco principal en los datos LC-MS. 27
    2. Transformar los datos del cromatograma LC-MS en formato netCDF mediante el software proporcionado por el fabricante del equipo. Para los resultados descritos aquí, utilizar la v5.2 Bruker Daltonics Esquire y softwares v3.2 de análisis de datos y realizar los pasos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Otros convertidores pueden usar varios convertidores (free-mercancías están disponibles).
    3. Importar los archivos .cdf en el software.
    4. Poner en práctica los procedimientos de filtrado de detección de picos, de alineación, de carencias y de pico con el PARAMETERS exponen en la Tabla 3.
      1. Como primer paso, seleccione un archivo de .cdf importada, y luego ir a la visualización → TIC / XIC visualizador. Ponga el cursor sobre la base del pico más pequeño en el cromatograma y tomar nota sobre la señal de intensidad mínima de la base de iones. A continuación, vaya a métodos de datos sin procesar → detección de picos.
      2. Seleccione detección de masas y llenar el nivel de la señal para detectar iones individuales para cada exploración y crear una lista de iones.
        NOTA: Compruebe el algoritmo antes de realizar la detección de masas - que depende del espectrómetro de masas. En nuestro caso, seleccionamos Centroide.
      3. Seleccionar Cromatograma Constructor y rellenar con el nivel de señal para conectar los puntos de datos de la lista de iones y construir un cromatograma para cada valor de la masa. Ver los parámetros especificados en el manual del espectrómetro de masas para ajustar el Intervalo de tiempo mínima y la tolerancia m / z.
      4. A continuación, vaya a pico Lista de métodos de detección de pico → → Cromatograma Deconvolución. Seleccione el algoritmo adecuado (en este caso, la búsqueda local mínimo) para permitir la separación de cada cromatograma en picos individuales.
      5. inspeccionar manualmente los cromatogramas para averiguar los valores adecuados para los parámetros siguientes. Establecer el umbral cromatográfico al 30% para eliminar el ruido y la mínima en Buscar RT rango de 2 (mínimo) para identificar la presencia de los locales mínimos para discriminar dos picos.
      6. Conjunto Mínimo Altura Relativa a 2,0. inspeccionar manualmente el cromatograma para identificar la altura absoluta mínima de la señal que corresponde a un pico y no al fondo; establecer este valor como Absoluto Altura (por ejemplo, 10.000 en el experimento presentado).
      7. Establecidos de la relación mínima de pico superior / Borde de 1,1 a afirmar la relación mínima entre la parte superior y las intensidades de los puntos de datos más bajos de un pico a ser reconocido como un pico verdadero.
      8. inspeccionar manualmente los cromatogramas para ver cuál es la duración mínima de los diversos picos en el cromato utilizadocondiciones ographic (por ejemplo, entre 0,2 y 2 min, dependiendo del compuesto, en los experimentos presentados), y por lo tanto utilizan estos valores como Pico Duración Rango (min) para establecer el rango de longitud de pico aceptable como la duración.
      9. A continuación, vaya a Pico métodos de listas → → Los isótopos isotópica Picos Mero al grupo de los isótopos en un pico, por lo general en el más intenso. Nota: Los parámetros dependen de la resolución del espectrómetro de masas y la reproducibilidad de los tiempos de retención.
      10. Por último, vaya a Pico Lista Métodos de alineación → → Únete alineador para alinear los picos en función de su m / z y tiempo de retención usando una puntuación de correspondencia.
    5. Después de alinear los picos, llenar las lagunas en los datos haciendo clic en el Pico de métodos de listas → → relleno de espacios Buscador de pico. Por último, el filtro de duplicar los puntos de datos, haga clic en Lista de pico Métodos → Filtrado → Duplicar filtro de picos.
    6. Exportar el conjunto de datos resultante como un .csv archivo.
    7. Cambiar manualmente la. Extensión csv a una. Txt. Si no hay extensiones de archivo son visibles, cambiar la configuración del ordenador para revelar las extensiones de archivo. Ir al archivo del explorador Opciones → Ver → Configuración avanzada y desactive la casilla "Ocultar las extensiones para tipos de archivo conocidos".
    8. Importar los archivos .txt en una hoja de cálculo. Esto produce una matriz de datos en la que todos los metabolitos detectados, reconocidos por un tiempo el número de identificación, m / z valor y la retención, se cuantifican en todas las muestras en términos de sus valores de área de pico.

3. Preparar polvo de la baya extractos para el análisis del transcriptoma y procesar los datos

  1. Extraer el ARN total de las muestras de bayas y determinar la calidad del ARN.
    1. Extraer el ARN total de las muestras de bayas.
      NOTA: En este estudio de caso, un kit de propiedad y un procedimiento modificado que garantiza la eliminación completa de moléculas que interfere con el análisis de ARN, tales como polisacáridos y polifenoles, se utilizaron. Las siguientes instrucciones son específicas para este kit 18.
      1. Pesar 400 mg de polvo de bayas para cada muestra, se divide en dos porciones y colocar 200 mg cada una en dos tubos de microcentrífuga.
      2. Añadir 900 l de la solución de lisis que contenía β-mercaptoetanol (proporcionado en el kit) a cada 200 mg de polvo y agitar inmediata y vigorosamente durante al menos 30 seg. Calentar la muestra a 56 ° C durante 5 min con agitación a 800 rpm.
      3. Centrifugar las muestras a la velocidad máxima en una microcentrífuga de sobremesa durante 10 minutos para sedimentar los restos celulares.
      4. Pipetear 700 l del sobrenadante en la columna de filtración proporcionado en el (anillo azul de retención) kit sentado en un tubo de recogida de 2 ml. Cerrar el tapón y centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga de mesa para 1 min para eliminar los desechos residuales. Repita este paso dos veces utilizando la misma columna de filtración pero un tubo de recogida fresco, resultando en tres tUBE conteniendo cada uno ~ 700 l de lisado clarificado.
      5. Pipetear 750 l de solución de enlace (suministrado en el kit) en cada tubo de lisado clarificado y mezclar inmediatamente por la pipeta hacia arriba y hacia abajo por lo menos cinco veces. Transferir 700 l de esta mezcla a la columna de unión proporcionado en el (anillo de retención rojo) kit sentado en un tubo de recogida de 2 ml. Cerrar el tapón y centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga de mesa para 1 min de obligar a la ARN.
      6. Se decanta la fracción de flujo continuo, invierta el tubo de recogida y pulse brevemente sobre una almohadilla limpia de papel absorbente para drenar el líquido residual.
      7. Retorno de la columna para el tubo de recogida y pipetear la mezcla restante en la misma columna y repetir la centrifugación y etapas de decantación. Repetir hasta que toda la mezcla se ha filtrado en la misma columna de unión rojo.
      8. Ahora siga las instrucciones restantes del kit y eluir el ARN en tampón de elución de 50 l (suministrado en el kit) y almacenar it a -80 ° C listo para los pasos de control de calidad.
    2. Determinar la cantidad y pureza del ARN usando un espectrofotómetro. Registrar los razón de absorbancia que revelan el grado de contaminación con proteínas (A 260/280) y polifenoles / polisacáridos (A 260/230).
      NOTA: ARN adecuado para la hibridación de microarrays debe marcar al menos 1,8 para ambas relaciones.
    3. Determinar la integridad del ARN.
      NOTA: Varios sistemas pueden ser utilizados. A adquirente digital que realiza una carrera de electroforesis capilar en combinación con un colorante fluorescente se utilizó en este estudio de caso. RNA adecuado para la hibridación de microarrays debe tener un número de integridad del ARN (RIN) de al menos 8.
  2. Preparar muestras e hibridar el RNA a una costumbre de microarrays.
    1. Establecer el importe de partida de ARN total para el análisis de microarrays a 200 ng por dilución de la solución de ARN obtenido en la etapa 3.1.1.8 con agua desionizada libre de ARNasa. Añade elcantidad apropiada de RNA a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en un volumen final de 1,5 l.
    2. Añadir 2 l de mezcla pico diluido a cada muestra de ARN y siga las instrucciones del fabricante para sintetizar la primera cadena de ADNc, transcribir esto en cRNA y la etiqueta de la cRNA con 3CTP cianina.
    3. Se purifica el cRNA marcado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluye en 30 l de agua libre de RNasa.
    4. Determinar el rendimiento y la actividad específica de cada cRNA mediante el registro de tres valores en un espectrofotómetro: cianina 3 concentración de colorante (pmol l -1), la pureza de ARN (A 260/280) y la concentración cRNA (ng l -1). Utilice las fórmulas dadas en el manual de instrucciones del fabricante para calcular el rendimiento de cRNA (g) y la actividad específica (pmol Cy3 por g cRNA).
      NOTA: Se recomienda rendimientos y actividades específicas difieren sobre la base del formato de microarray específico. En este estudio de caso un formato 44K paquete de 4 eraelegido, el rendimiento recomendado era 1,65 y la actividad específica era 9.
    5. Diseñar el microarray personalizado utilizando el software adecuado para el diseño de la sonda.
      1. Para los resultados descritos en este estudio de caso, preparar una nueva costumbre de microarrays, diseñado en el formato 44K 4-Pack mediante una aplicación basada en web para los diseños de encargo de microarrays de oligonucleótidos y bibliotecas. Sondas de diseño para que coincida con 34,651 transcripciones de destino, incluyendo 29.971 transcripciones de la Pinot Noir serie V1 predijo, 4.500 nuevos loci identificados en el cultivar Pinot Corvina por la reconstrucción del transcriptoma y 180 genes Corvina privadas 25.
        NOTA: Esto implicó la producción de sondas específicas 34,651 60-mer, que comprende 29.798 Pinot Noir predijo transcripciones, 4,392 nuevos loci Pinot y 179 genes Corvina privadas.
    6. Preparar el montaje hibridación basado en las especificaciones de formato 4-pack de la siguiente manera.
      1. Colocar 1,65 g de cRNA marcado con Cy3 en un volumen final de 41,8l de agua desionizada libre de ARNasa. Añadir 11 l de 10x Agente bloqueador y 2,2 l de 25x tampón de fragmentación. Incubar a 60 ° C durante 30 min en un baño termostático a fragmento de ARN. Inmediatamente enfriar en hielo durante 1 minuto.
      2. Por último, añadir 55 l de tampón de hibridación 2x, mezclar bien pipeteando y centrifugado durante 1 min a 15.500 xg a TA. Prontitud colocar el tubo de microcentrífuga en hielo. Utilizar inmediatamente, no lo guarde.
    7. Cargar la costumbre de microarrays de la siguiente manera.
      1. Cargar una diapositiva junta con la etiqueta hacia arriba en la base de una cámara de hibridación. cargar lentamente 100 l de muestra de hibridación obtenidas en la etapa 3.2.6.2 en cada junta así, dispensar el líquido con la punta de la pipeta, evitando las burbujas.
      2. Lentamente coloque la costumbre de microarrays hacia abajo, lo que garantiza que el código de barras numérico esté hacia arriba. Asegúrese de que el par de sándwich está correctamente alineado. Por último colocar la tapa de la cámara de hibridación en el intercaladodiapositivas y de la mano a apretar la abrazadera sobre la cámara. Girar la cámara de ensamblado para evaluar la movilidad de burbujas.
    8. Coloque la cámara de deslizamiento montado en un asador en un horno de hibridación fijado a 65 ° C. Ajuste el rotor para girar a 10 rpm. Permitir la hibridación de proceder durante 17 horas.
    9. Proceder con el lavado de microarrays de diapositivas de la siguiente manera.
      1. En primer lugar, preparar tres platos deslizables manchas y llenarlos con los tampones de lavado apropiados: 2 platos con tampón de lavado 1 a RT y 1 plato con pre-calentado (37 ° C) Tampón de lavado 2.
      2. Desmontar la cámara de hibridación y retire el sándwich. Con el código de barras numérico microarray diapositiva hacia arriba, sumergir el emparedado en el primer plato deslizable tinción lleno de tampón de lavado 1 a la temperatura ambiente y, con la ayuda de pinzas limpias, separar la junta de la diapositiva de microarrays. transferir rápidamente los microarrays de diapositivas en una cubeta de portaobjetos y lo coloca en el segundo plato deslizable tinción llena de tampón de lavado 1a TA.
      3. Poner el plato deslizable tinción en un agitador magnético y lavar 1 min con agitación moderada. transferir rápidamente la parrilla corrediza en el tercer plato deslizable tinción lleno de pre-calentado (37 ° C) Tampón de lavado 2 y lavar 1 min con agitación moderada.
      4. Retire lentamente el soporte del plato deslizable manchas y retirar con cuidado la corredera de la cremallera, evitando las gotitas.
        NOTA: No añadir Triton X-102 a los tampones de lavado y omitir la etapa de lavado acetonitrilo.
    10. Almacenar el chip se lava en la oscuridad a temperatura ambiente.
  3. Analiza los microarrays y extraer las características más destacadas.
    1. Colocar el portaobjetos en un escáner de microarrays adecuado y escanear cada array usando los ajustes de los parámetros recomendados en el manual de instrucciones del fabricante de microarrays. Para los resultados aquí descritos, coloque cada microarray de diapositivas en un portaobjetos a facilitar el proceso de escaneado.
    2. Importar la salida .shppresentar en un software apropiado que es capaz de convertir una señal digital en valores numéricos fluorescentes. Compruebe el informe de control de calidad para garantizar que el procedimiento de hibridación se ha realizado correctamente.
      1. Para los resultados aquí descritos, utilice los ajustes de los parámetros recomendados en el manual de instrucciones del software de extracción de características e inspeccionar el informe de control de calidad para garantizar que los parámetros que se enumeran en la Tabla 4 se encuentran dentro del rango normal indicada por el fabricante.
Nombre métrica Limite superior Límite inferior Descripción
AnyColorPrcntFeatNonUnif 1.00 N / A Porcentaje de características que se incluyen los valores extremos no uniformidad en cualquiera de los canales
Límite de detección 2.00 0.10 más media 1 desviación estándar de las ins pico por debajo del intervalo de concentración lineal
absGE1E1aSlope 1.20 0.90 Absoluto de la pendiente del ajuste de la señal frente a la concentración de las sondas E1a
MedCVProcSignal 8.00 N / A % CV mediana para la señal procesada
gNegCtrlAveBGSubSig 5.00 -10.00 Media de antecedentes y resta la señal de todos los controles negativos inlier (BGSubSignal se calcula restando un valor llamado BGUsed de la característica de la señal media)
gNegCtrlAveNetSig 40.00 N / A Promedio de la señal neta de todos los controles negativos inlier
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00 N / A desviación estándar deantecedentes y resta señales de todos los controles negativos inlier
gNonCntrlMedCVProcSignal 8.00 N / A % CV mediana para la señal procesada de las sondas de control no
gSpatialDetrendRMSFilter 15.00 N / A Residual de fondo eliminar la tendencia ajuste

Tabla 4: Principales parámetros de comprobación para verificar la calidad de la hibridación de microarrays.

  1. Procesar los datos de microarrays.
    1. Una vez que todas las diapositivas de microarrays se han escaneado y el control de calidad ha sido evaluada positivamente, preparar una matriz de datos delimitado por tabuladores mediante la selección de los valores de cada archivo gProcessedSignal resultado de un solo subconjunto, que representa la intensidad de fluorescencia de cada sonda primas.
    2. En una hoja de cálculo, normalizar los datos sobre el percentil 75 de cada array (valores de p) y calculcomió el promedio de todos los valores de p entre todas las diferentes sub-series para calcular la relación R.
    3. A continuación, en la misma hoja de cálculo, normalizar cada valor gProcessedSignal a la relación R de su propia sub-matriz.

4. Llevar a cabo el análisis detallado de Estadística de la metabolómica y transcriptómica de Datos

  1. Preparar el software de análisis estadístico.
    NOTA: En este estudio de caso, un software capaz de realizar la ACP se utilizó PLS-DA-DA y O2PLS.
    1. Importar los datos de la metabolómica y la transcriptómica. Ir a Archivo → Nuevo proyecto Regular → Nuevo proyecto regular para importar la matriz de datos obtenida con el software MZmine. A continuación, haga clic en Editar → Transportar toda la matriz → Hogar y asignar la identificación → acabado principal y secundaria apropiada.
    2. La media de centrar los datos y escalar utilizando la escala de Pareto. En la ventana de inicio, vaya a Editar → M1 y cambiar el pará apropiadatros en función de los datos. Para los resultados aquí descritos, cambiar la escala de la unidad de diferencia a la par.
    3. Escalar los datos transcriptómica utilizando el ajuste de varianza unitaria.
  2. Llevar a cabo el análisis estadístico multivariado.
    1. Implementar el PCA como se muestra en la FIGURA 2. En este estudio de caso, PCA revela las principales diferencias entre las muestras, lo que refleja las diferentes etapas de maduración y estaciones de crecimiento.
      1. En la ventana Plan de trabajo, seleccione PCA-X como el tipo de modelo. Presione Autofit. Prestar atención a la R2X (cum) y Q2 (cum) Los valores, ya que dan una idea de la calidad del modelo.
        NOTA: Por lo general, cuanto mayor sea el valor mejor es el modelo, pero los modelos con muy alta R2X (cum) podrían exceso de ajustar los datos. Como regla empírica, dejamos de añadir componentes principales cuando el valor (cum) Q2 empieza a disminuir.
      2. A continuación, seleccione → Decenas de dispersión para ver el diagrama que muestra la posible agrupación de las muestras.
      3. Inspeccionar el PCAPuntuación Terreno. Si se obtiene un buen modelo (Q2cum> 0,5), usar las mismas clases de muestras para construir un modelo O2PLS-DA (paso 4.2.2).
    2. La construcción de dos modelos O2PLS-DA utilizando las muestras clasificadas por macro-zona y validar los modelos usando una permutación de prueba con 200 permutaciones.
      1. Asignar las clases por ir a la ventana de Inicio → Nueva Como → → M1 Observaciones. Establecer las clases deseadas. A continuación, cambie el tipo de modelo de PCA-X para O2PLS-DA. Presione Autofit. Asegúrese de que el número de componentes del modelo PLS-DA es la misma que la de la O2PLS-DA.
      2. Para validar el modelo O2PLS-DA, vaya a analizar CV-ANOVA y ver el valor de p derecha. Por otra parte, haga clic en Nuevo Al igual que en la ventana Inicio → M2 y cambiar el tipo de modelo de O2PLS-DA a PLS-DA. Presione Autofit.
      3. Ir a → Analizar y realizar permutaciones permutaciones 200 (de-seleccione la opción Recalcular permutaciones).
        Nota: La salida final muestra una ventana en la que el valor de R2 should generalmente golpeó el eje Y en valores por debajo de 0,4, mientras que el Q2 debe golpear la parte negativa del eje y. Si los valores de R2 y / o Q2 son incorrectos, reducir el número de componentes, tanto en los modelos de PLS-DA y O2PLS-DA.
      4. Proceda a seleccionar M2 en la ventana del proyecto y haga clic en Marcadores → dispersión para ver la trama y la posición de las clases de muestra. Para observar lo metabolitos caracterizan una o más clases específicas, vaya a Parcela / Lista → dispersión.
      5. Seleccione cambiar el tipo de datos a las observaciones y las cargas → Añadir Series y modifican el artículo en el eje X y la serie en pq (corr) y Pred Comp en 1 y 2 o más componentes, cuando están presentes, respectivamente.
      6. Con el botón derecho del ratón pulsado sobre el terreno, ir a la propiedad → Color y seleccione Por Términos de distinguir los símbolos de la trama entre las moléculas y las clases. Ir a la presentación → Formato → Eje Parcela y / o estilos de modificar la parcela con las características deseadas.
    3. Sobre la base de los resultados de los análisis de la metabolómica O2PLS-DA, presentan diferencias en los niveles relativos de metabolitos específicos o clases de metabolitos como histogramas.
    4. Con base en los resultados del análisis de transcriptómica O2PLS-DA, recuperar y asignar los genes diferencialmente moduladas a Gene Ontología (GO) Clasificaciones 28.
    5. Identificar las relaciones entre los niveles de metabolitos y la expresión génica de forma manual.

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Resultados

El estudio de caso descrito en este artículo produjo una matriz de datos final que comprende 552 señales (m / z características) incluyendo iones moleculares más sus isótopos, aductos y algunos fragmentos, relativamente cuantificados entre 189 muestras (7 viñedos x 3 estados de madurez x 3 estaciones de crecimiento x 3 réplicas biológicas). El número total de puntos de datos, por lo tanto era 104.328. Análisis del árbol de fragmentación dio lugar a la anotación de 282 funciones ...

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Discusión

Este artículo describe las metabolómica, transcriptómica y protocolos de análisis estadísticos utilizados para interpretar el concepto de terroir baya de la uva. análisis metabolómica por HPLC-ESI-MS es lo suficientemente sensible para detectar un gran número de metabolitos al mismo tiempo, pero la cuantificación relativa se ve afectada por el efecto de la matriz y de iones de supresión / mejora. Sin embargo, un enfoque similar ya se ha utilizado para describir el proceso de maduración y fulminante post-cosecha de bayas...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo se benefició de las actividades de creación de redes coordinadas en el marco de la COST ACTION FA1106 "Un enfoque de sistemas integrados para determinar los mecanismos de desarrollo que controlan la calidad de la fruta carnosa en tomate y vid". Este trabajo ha sido apoyado por el proyecto 'Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale', financiado por la Fundación CARIVERONA Bank, y por el proyecto 'Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)', financiado por el Ministerio de Políticas Agrícolas y Forestales de Italia. SDS fue financiado por el Ministerio de Universidad e Investigación de Italia FIRB RBFR13GHC5 proyecto "La plasticidad epigenómica de la vid en las interacciones entre genotipos y entornos".

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Molino MolinoIKAA11 básico
HPLC MuestreadorBeckman Coulter -System Gold 508 Automuestreador
Sistema HPLCBeckman Coulter -System Gold 127 Solvente Módulo HPLC
C18 Columna de protecciónGrace -Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 μ m) Columna de protección
C18 ColumnaGrace -Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm; 3 μ m)
Espectómetro de masasBruker Daltonics -Bruker Esquire 6000; El espectrómetro de masas estaba equipado con una fuente ESI y el analizador era una trampa de iones.
Disolventes de extracción y tampones de HPLCSigma34966Metanol grado LC-MS
Sigma94318Ácido fórmico grado
LC-MS Sigma34967Acetonitrilo grado
Sigma39253Agua  Filtros de
(0.2 μ m)Sartorius17764
Programas informáticos para la recopilación (a) y el procesamiento de datos (b)Bruker Daltonics-BrukerDaltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Análisis de datos y MzMine 2.2 softwares (b)
Kit de ARN total de la planta de espectroSigma-AldrichSTRN250-1KTPara la extracción de ARN total de pericarpios de uva
Nanodrop 1000Thermo Scientific1000
BioAnalyzer 2100Agilent TechnologiesG2939A
ARN 6000 Nano ReactivosAgilent Technologies5067-1511
Chips de ARNAgilent Technologies5067-1511
Tampón de lavado de expresión génica Agilent 1Agilent Technologies5188-5325
Tampón de lavado de expresión génica Agilent 2Agilent Technologies5188-5326
LowInput QuickAmp Kit de etiquetado Un colorAgilent Technologies5190-2305
Spike In - Agilent de un colorAgilent Tecnologías5188-5282
Kit de hibridación de expresión génicaAgilent Technologies5188-5242
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104para purificación de ARNc
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer MicroarrayAgilent TechnologiesG2514F-048771 
eArrayAgilent Technologies-https://earray.chem.agilent.com/earray/
Guías de juntasAgilent TechnologiesG2534-60012Enable Agilent SurePrint Microarray Baño termostático de hibridación de 4 matrices
deJulabo
Agilent TecnologíasG2534-60001
Horno de hibridación de microarraysAgilent TechnologiesG2545A
Horno de hibridación Rack rotadorAgilent TechnologiesG2530-60029
Varilla de conversión de rack rotadorAgilent TechnologiesG2530-60030
Kit de tinciónBio-Optica10-2000Plato de tinción de portaobjetos y gradilla de portaobjetos
Dispositivo agitador magnéticoAREX Agitador magnético de calentamiento F20540163 
Horno termostáticoThermo ScientificHeraeus - 6030
Agilent Escáner de micromatrices AgilentTechnologiesG2565CA
Carrusel de escáner, 48 posicionesAgilent TechnologiesG2505-60502
PortaobjetosAgilent TechnologiesG2505-60525
Software de extracción de características v11.5Agilent Tecnologías-dentrodel escáner de microarrays Agilent G2565CA
SIMCA + V13 SoftwareUmetrics
automático de columna LC-MS jeringa Minisart RC 4 de grado LC-MS Cámara hibridación

Referencias

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