Artículo de método

El trabajo con células auditivas HEI-OC1

DOI:

10.3791/54425

⸱

3 de septiembre de 2016

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1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

En este artículo

Resumen

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House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) es una de las pocas líneas celulares auditivas de ratón actualmente disponibles para fines de investigación. Este protocolo describe cómo trabajar con células HEI-OC1 para investigar los efectos citotóxicos de los fármacos farmacológicos, así como las propiedades funcionales de las proteínas del oído interno.

Resumen

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HEI-OC1 es una de las pocas líneas celulares auditivas de ratón disponibles para fines de investigación. Originalmente propuesto como un sistema in vitro para el cribado de fármacos ototóxicos, estas células se han utilizado para investigar las vías apoptóticas activadas por fármacos, la autofagia, la senescencia, el mecanismo de protección celular, las respuestas inflamatorias, la diferenciación celular, los efectos genéticos y epigenéticos de los fármacos farmacológicos, los efectos de la hipoxia, el estrés oxidativo y del retículo endoplásmico y la expresión de canales moleculares y receptores. Entre otros marcadores importantes de las células ciliadas cocleares, las células HEI-OC1 expresan endógenamente prestina, la proteína motora paradigmática de las células ciliadas externas. Por lo tanto, pueden ser muy útiles para dilucidar nuevos aspectos funcionales de esta importante proteína auditiva. Las células HEI-OC1 son muy robustas y su cultivo no suele presentar grandes complicaciones. Sin embargo, requieren algunas condiciones especiales, como evitar el uso de cócteles antibacterianos comunes que contengan estreptomicina u otros antibióticos, así como la incubación a 33 °C para estimular la proliferación celular y la incubación a 39 °C para desencadenar la diferenciación celular. Aquí, describimos cómo cultivar células HEI-OC1 y cómo usarlas en algunos ensayos típicos, como proliferación celular, viabilidad, muerte, autofagia y senescencia, así como cómo realizar mediciones de capacitancia no lineal y de fijación de parche.

Introducción

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House Ear Institute-órgano de Corti 1 células (IES-OC1) se derivan del órgano de la audición de un 1,2 ratón transgénico. La incubación de cualquier célula de este ratón transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condiciones permisivas) induce la expresión de un gen de inmortalización que desencadena de-diferenciación y la proliferación acelerada; mover las células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condiciones no permisivas) conducen a disminución de la proliferación, la diferenciación y, por lo menos en el caso de HEI-OC1, la muerte celular 2,3.

células HEI-OC1 fueron clonados y caracterizados en nuestro laborat....

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Protocolo

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1. Cultura de la célula

Nota: Todos los protocolos de cultivo celular deben realizarse mediante técnicas de cultivo celular adecuados (para referencia ver los 3 primeros capítulos de Biología Celular: Un Manual de Laboratorio, Volumen I 10). células HEI-OC1 no requieren ningún recubrimiento adicional o el tratamiento de las placas de cultivo celular para la adherencia y el crecimiento adecuado. Muy importante: no utilice platos de vidrio para fines de cultivo de células; el fenotipo y la respuesta biológica de las células a los fármacos farmacológicos cambiarán (G Kalinec & F Kalinec, no publicado); Se recomiendan las placas de c....

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Resultados

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En un par de publicaciones recientes se informó de un amplio conjunto de estudios dirigidos a evaluar la respuesta de las células HEI-OC1 a varios medicamentos farmacológicos de uso común, así como la investigación de la función prestina 8,9. En estos estudios hemos hecho uso de todos los protocolos descritos en las secciones anteriores.

Uno de los resultados de estos estudios anteriores era que las células HEI-OC1 .......

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Discusión

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En este informe se describe cómo la cultura células HEI-OC1 y las utilizamos para evaluar los mecanismos de citotoxicidad inducida por fármacos y para investigar las propiedades funcionales de prestina, el motor molecular de las CCE coclear. Los procedimientos técnicos, sin embargo, son lo suficientemente generales como para ser adaptado fácilmente a diferentes estudios.

Todos los protocolos descritos aquí requieren el uso correcto de técnicas de cultivo celular bien establecidos 10.

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses existentes o potenciales.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01-DC010146 y R01-DC010397 de los NIH. Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
HEI-OC1TODOS LOS KITS DE ENSAYO, EQUIPOS 
Cabina de seguridad biológica de clase IIThe Baker CompanySterilgard IIIY LAS EMPRESAS INDICADAS EN LA
Centrífuga refrigeradaEppendorf5810RLAS 2 COLUMNAS ANTERIORES SON SOLO
Microscopio invertidoZeissAxiovert 25EJEMPLOS, Y CUALQUIER OTRO PRODUCTO SIMILAR
Baño de aguaStovallHWB115PODRÍA UTILIZARSE.
Contador de célulasNexcelomCellometer Auto T4
Dos (2) incubadoras de células, una a 33 ° C/10% CO2 y otros a 39 ° C/5% CO2Forma Scientific3110
Placas de cultivo celular, PS, 100 mm x 20 mm con rejillas de ventilaciónGreinier Bio-One664-160
Placas de cultivo celular, PS,  60 mm x 15 mm con rejillas de ventilación Greiner Bio-One628160
Matraces de cultivo de tejidos Cellstar  250 mlGreiner Bio-One658-175
Cellstar tissue cultur  matracesGreiner Bio-One660-175
  Placa de cultivo celular de 6 pocillos, con tapa-CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest Placa de cultivo de tejidos, 96 pocillos, fondo plano con tapaBecton Dickinson353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 pocillos blanco, fondo transparenteGreiner Bio-One655098
50 ml Tubo cónico de polipropileno con tapón CellstarsBecton Dickinson 352070
15 ml Tubos cónicos de polipropileno con tapón-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7,4 (1x) Life Technologies10010-023
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)Life Technologies11965-084
Suero fetal bovino (FBS) HycloneSH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, sin rojo fenolGibco/Invitrogen21083-027
Tripsina, 0.25% Life Technologies25200-056
TACS MTT Kit de ensayo de proliferación celularTrevigen4890-25-K
Caspasa-Glo 3/7 Ensayo  kitPromega  G8091 
Kit de ensayo de proliferación celular BrdU Cell Signaling6813
Solución de disociación celular no enzimática Sigma-AldrichC5789
Cell-Tox Green Kit de ensayo de citotoxicidad Promega  G8741 
Instrumento FACSAriaIII BD Biociencias  FACSAriaIIICon excitación de 488 nm (láser azul)
Escáner digital de transferenciaLI-CORC-DiGit
Unidad de electroforesis y transferenciaHoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 Lector de placas con software Soft Max Pro 5.2Molecular DevicesSpectraMax 5
Amplificador de pinza de parcheHEKAEPC-10
para la preparación electrodos de parcheSutter InstrumentsP-97
Células

Referencias

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  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell li....

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Etiquetas

Cultivo celularEnsayo de proliferaci nEnsayo de viabilidadPatch clampCapacitancia no linealExpresi n de la prestinaCitometr a de flujoIncubaci n a temperaturaDiferenciaci n celular

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