El modelo establecido de cateterización transuretral de ratones permite el estudio de patologías de vejiga, incluyendo infección del tracto urinario, pero puede realizarse solamente en las hembras. Un nuevo modelo de hombre instilación transuretral, presentado aquí, permitirá que la investigación en un área marcada por fuertes diferencias clínicas y epidemiológicas entre los sexos.
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Artículo de método
Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras
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Resumen
Resumen
Infecciones del tracto urinario (ITU) son extremadamente comunes en todo el mundo, incurriendo en gastos asociados de salud y morbilidad significativa. Pequeños modelos animales, que reflejan con precisión la progresión y el establecimiento de la enfermedad, permiten la disección de las interacciones huésped-patógeno y generación de inmunidad a la infección. En ratones, instilación intravesical de uropatógenos Escherichia coli, el agente causal en más del 85% de la comunidad adquirida UTI, recoge muchas de las etapas de la infección observada en los seres humanos. Hasta hace poco, sin embargo, IU podría solamente ser modelada en hembras. Esta limitación ha obstaculizado el estudio de las diferencias relacionadas con el sexo en UTI, así como otras patologías de vejiga, como el cáncer. Aquí, describimos un método para infundir ratones macho que permite la comparación directa entre los animales hembras y machos y proporcionan un protocolo detallado para evaluar el tejido de la vejiga mediante citometría de flujo como un medio para comprender mejor las respuestas del anfitrión a la infección. Juntos, estos enfoques ayudará a la identificación de factores de huésped que contribuyen al sexo sesgos observados en UTI y otras enfermedades asociadas a la vejiga.
Introducción
Infecciones del tracto urinario (ITU) son una de las infecciones más comunes en los países desarrollados1. Las tasas de infección son similares entre las hembras y los machos entre los recién nacidos y los ancianos2. Mujeres premenopáusicas, sin embargo, tienen una mayor incidencia de infección urinaria adquirida en la comunidad, en comparación con los hombres2,3. Dado que esta enfermedad afecta principalmente a mujeres, investigación fundamental y clínica ha centrado abrumadoramente en IU en las mujeres. Sin embargo, la infección urinaria en los hombres es un reto de salud importantes y escasamente4. De hecho, debido a infección urinaria en los hombres se asocian con mayor morbilidad, estas infecciones se definen habitualmente como complicado4,5.
Como nuestra comprensión del papel central de los sesgos de sexo en fisiología y patología evoluciona, nuevos métodos están obligados a explorar este aspecto anteriormente desatendida de la enfermedad. Diferencias de sexo juegan un papel esencial en la inmunidad y la infección; las hembras tienen mayor incidencia de enfermedad autoinmune, mientras que los machos son más susceptibles a ciertas infecciones, como tuberculosis, malaria y VIH6,7. Cáncer de vejiga, otra patología urológica, es significativamente más frecuente en hombres que en mujeres, y varios estudios han demostrado un papel de los andrógenos en el desarrollo de malignidad8,9,10,11 ,12. En particular, sin embargo, investigación de terapias intravesical para el cáncer de vejiga se realiza exclusivamente en hembras, debido a la imposibilidad de cateterizar repetidamente ratones machos13.
El estudio de la patogenia de la infección urinaria se apoya fuertemente en modelos de roedores de la infección (por ejemplo, ratones y ratas). Modelos murinos de infección urinaria pueden emplear patógenos originalmente aislaron de infecciones humanas, tales como uropatógenos Escherichia coli (UPEC), Klebsiella, enterococo, estafilococoo Proteus14. Por lo general, las bacterias se introducen en la vejiga por cateterización de la uretra. Después de la infección, vejiga y riñones pueden ser removida para evaluar parámetros específicos de infección, colonización bacteriana, daño tisular o anfitrión inmunorespuesta15,16. Universalmente, sin embargo, sólo los animales femeninos son utilizados para investigación UTI. De hecho, muchos estudios han señalado que, por razones anatómicas, cateterización de ratones machos no es posible13,17,18,19. Más recientemente, se ha descrito un abordaje quirúrgico a la instilación de macho, en que se abre el abdomen, la vejiga es desplazada externamente aplicando presión suave a la abertura en el abdomen y se inyectan las bacterias en la vejiga20. Este enfoque permite la infección del hombre, a costa de la intervención quirúrgica. Por lo tanto, una advertencia importante de este enfoque incluye la influencia de la inflamación, sobre el resultado de infección, como el potencial de inducir una respuesta antiinflamatoria cicatrizante a la incisión21. Como nuestros intereses incluyen comprensión sesgo sexual en respuesta a la enfermedad, se desarrolló un método de instilación intravesical bacteriana en ratones machos que más se parezca el abordaje transuretral no quirúrgico larga utilizado en roedores hembra22 .
Nuestro modelo se basa en una metodología establecida y ofrece la posibilidad de comparar directamente el anfitrión inmunorespuesta a UTI en animales hembras y machos. Este método permite la disección de diferencias basadas en el sexo en la infección y potencialmente ofrecer pistas moleculares y celulares a las pronunciadas diferencias en la susceptibilidad y respuesta a la infección entre los sexos. Además, este modelo tiene valor más allá de los estudios UTI, permitiendo el establecimiento de modelos para investigar otras enfermedades de vejiga asociados, tales como cáncer de vejiga, prostatitis, semi-activo bajo o sobre el síndrome de vejiga y cistitis intersticial.
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Protocolo
Se realizaron experimentos de ratón según aprobación de número de protocolo 2012-0024 el Comité d ' éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud (Comité ético de experimentación animal), en aplicación de la Directiva 2010/63 europeo UE.
1. preparación de los catéteres
- Preparar una cánula pediátrica de acceso intravenoso para cada grupo de ratones infectados. Utilizando el mecanismo de resorte incorporado, desprenderse de cada cánula de la aguja, según las instrucciones del fabricante. Deseche las agujas, conservando sólo el plástico cánula intravenosa.
- Esterilizar los catéteres en una campana de flujo laminar para ciclo de un ultravioleta (U.V.), típicamente 25-30 min.
Nota: Los catéteres pueden utilizarse para más de un ratón, sin embargo un nuevo catéter debe utilizarse entre grupos experimentales, sexos o cepas bacterianas.
2. preparación de uropatógenos Escherichia coli infección
- Al menos dos días antes de la infección, mediante un asa de inoculación estéril, racha UPEC de un stock congelado bacteriano sobre una placa de agar caldo de Luria (LB), que contengan antibióticos si procede. Incubar a 37 ° C durante la noche. Las placas pueden almacenarse a 4 ° C hasta una semana.
- En un erlenmeyer estéril de 100 ml, inocular 10 ml LB, que contengan antibióticos si es necesario, con una sola Colonia de la placa LB e incubar a 37 ° C durante la noche (aproximadamente 16-18 hr) de pie.
Nota: Pie culturas permiten la expresión de tipo 1 pili, que son necesarios para la infección23. Culturas crecidas agitación tendrá menos eficiente expresión de pili y por lo tanto, incoherentes tasas de infección. - Medir la densidad óptica (OD)600 de la cultura durante la noche y calcular el número de bacterias por ml con una curva de crecimiento determinado. Como ejemplo, para la cepa de la UPEC UTI89, OD600 = 0.35 es equivalente a 2 x 108 UFC / ml, por lo tanto, una cultura de la noche con un OD600 = 2.4 sería equivalente a 13.7 x 108 CFU por ml. determinar empíricamente la relación entre la OD600 y con cada nueva cepa empleada para la infección de bacterias viables.
-
Determinar la cantidad de bacterias necesarias teniendo en cuenta el número de animales infectados y que cada ratón debe recibir aproximadamente 107 unidades formadoras de colonias (UFC) en 50 μl de PBS. Incluir en el cálculo el ~ 130 μl volumen muerto de la jeringa y catéter nub y 100 μl debían determinar el inóculo.
- Hacer girar la suspensión bacteriana en una microcentrífuga de sobremesa a 17.000 x g durante 1 min y resuspender el precipitado bacteriano que resulta en 2 x 108 UFC / ml en PBS. En serie diluir una alícuota de esta suspensión y la placa en agar LB, con antibióticos si es necesario determinar el exacto inóculo para cada infección.
- Dibujar el inóculo bacteriano en una jeringa de 1 ml y coloque el catéter en el extremo de la jeringa. Golpee la jeringa para quitar cualquier aire y presione el émbolo para llenar el espacio de aire muerto en el catéter antes de iniciar la instilación.
3. preparación de los ratones
- Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 5 mg/kg xilacina. Se puede proporcionar calor suplementario.
- Asegúrese de que cada ratón es totalmente sedado apretando el bandolero con presión media. Ratones son totalmente sedados cuando no reaccionan y requieren 3-5 min para llegar a este estado.
- Coloque ratones supina y aplique presión mediana en la parte inferior del abdomen para vaciar la vejiga de la orina. Vejigas completos sensación como un guisante debajo de la piel entre la cresta ilíaca.
Nota: Isoflurano inhalado se ha utilizado para cateterizar ratones hembra15,22, sin embargo, no ha sido probado si ratones machos son suficientemente anestesiados por isoflurano inhalado para este procedimiento.
4. transuretral instilación de ratones femeninos
- Usando la mano no dominante, coloque el pulgar en la cola y un dedo de la misma mano en el abdomen del ratón y aplique presión suave en opuestas direcciones para mantener el ratón firmemente en su lugar.
-
Coloque la punta del catéter perpendicular al ratón en el orificio uretral. Con una ligera presión, deslice el catéter en la uretra, hasta el centro del orificio uretral, reduciendo simultáneamente la jeringa de modo que sea paralelo a la superficie de trabajo. El catéter no requiere lubricación. No empujar ni forzar el catéter en la uretra. El catéter debe deslizarse suavemente y fácilmente en la uretra, con poca o ninguna resistencia.
- Antes de aplicar el inóculo (paso 4.3), una vez que el catéter está en su lugar, muy suavemente Hale la piel del abdomen hacia la cabeza del ratón con el dedo desde el no-dominante de la mano ya está en el abdomen del ratón (paso 4.1). Si el catéter está en la uretra, el tejido que compone el orificio de la uretra no se mueve, mientras que si el catéter se coloca incorrectamente en la vagina, el tejido se moverá hacia arriba y fuera del catéter. Esta prueba rápida debe realizarse en cada ratón.
- Cuando el eje del catéter se encuentra con el orificio uretral, lentamente dispensar 50 μl del inóculo bacteriano. Una tasa de instilación lenta minimiza el reflujo vesicoureteral en el riñón. Retire lentamente el catéter para evitar fugas, más de una cuenta de 5. Lugar de ratones en sus jaulas en una posición supina.
5. transuretral instilación de ratones machos
- Coloque dos pinzas pulgar cranially y caudalmente a los genitales externos del ratón. Retraer el prepucio para exponer completamente el glande del pene. Una vez que el pene se coloca externamente, suelte la pinza del pulgar.
- Vuelva a colocar las pinzas para estabilizar el pene que sobresale perpendicularmente a los animales, el órgano suavemente pero tenso. Visualizar el meato uretral e introducir cuidadosamente el catéter en la pequeña abertura en la punta del órgano. Guiar suavemente el catéter en el pene, hacia el cuerpo del ratón, manteniendo tensión suave con el fórceps. El catéter no requiere lubricación. No forzar el catéter en el pene; el catéter debe deslizarse suavemente en la uretra, lo que indica la correcta colocación.
- Una vez que el eje del catéter se encuentra con la punta del pene, muy lentamente dispensar 50 μl del inóculo, mientras mantiene la posición del pene. La calidad de la instilación puede señalarse en este momento según una puntuación de calidad de instilación predeterminado, como se muestra en la figura 2.
- Retraiga el catéter lentamente, sobre un conteo de 5, para evitar la fuga del inóculo. Lugar de ratones en sus jaulas en una posición supina. Animales deben empezar a recuperar 30-45 min después de la administración de la anestesia.
6. determinación de UFC en órganos infectados
- En momentos predeterminados, ratones de sacrificio utilizando aprobaron procedimientos normalizados de trabajo (por ejemplo, la dislocación cervical o sobredosis de dióxido de carbono). Humedezca el abdomen con etanol al 70% para minimizar la contaminación por piel.
- Hacer una incisión en el tercio inferior del abdomen del ratón de menos de 2 cm con unas tijeras y extraiga de forma aséptica la vejiga y cualquier otro órganos deseados, incluyendo pero no limitado a, los riñones, testículos, vesículas seminales o glándulas prepuciales, en 5 ml tubos con tapón de polipropileno snap que contiene 1 ml PBS estéril. Mantener las muestras en hielo.
- Homogeneizar los órganos con un homogeneizador handheld hasta que no quede casi tejido sólido, aproximadamente de 15-60 segundos dependiendo del órgano. La grasa no homogeneizar bien y es fácilmente reconocible como tejido beige-blanco brillante. Deseche la grasa antes o después de la homogeneización. Lave el homogeneizador en etanol seguido de PBS entre cada experimental o grupo de órganos.
Nota: Normalmente, utilizar homogeneizadores portátiles u Homogeneizadores de molino de grano. Mientras que todos estos sistemas han dado resultados similares, según lo determinado por la comparación directa de bacteria UFC en 24 horas post infección, las condiciones óptimas para homogeneizar el tejido del anfitrión mientras que preserva la viabilidad bacteriana deben determinarse empíricamente antes de realización de este protocolo rutinario. - Realizar diluciones seriadas de suspensiones homogeneizadas de órgano. Diluciones en placas de agar LB, que contengan antibióticos cuando sea apropiado, la placa e incubar durante la noche (~ 15 hr) a 37 ° C. Cepas UPEC poseen tiempos de doblaje muy rápidos y como tal, debe tener cuidado para no incubar las placas de agar demasiadas ya que esto dificultará la capacidad de contar las colonias individuales.
7. flujo cytometric del análisis del tejido de la vejiga
- Preparar el tampón de digestión con colagenasa en 34 unidades/mL y DNasa en 100 μg/mL en PBS. Mantener en hielo. Preparar un tubo cónico de 15 ml por animal a analizar y alícuota 1 ml del tampón de digestión por el tubo.
- En horarios predeterminados, ratones de sacrificio utilizando aprobaron procedimientos normalizados de trabajo (por ejemplo, la dislocación cervical o sobredosis de dióxido de carbono). Humedezca el abdomen con etanol al 70% para minimizar la contaminación por piel.
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Hacer una incisión en el tercio inferior del abdomen del ratón de menos de 2 cm con unas tijeras y quitar la vejiga entera. Picadillo con las tijeras, cortar la vejiga en 2-3 mm2 tamaño de piezas, generalmente de 8 piezas.
- Añadir una picada vejiga por tubo con tampón de digestión. Agitar para lavar el tejido de la vejiga picada en el buffer de digestión. Mantenga en hielo hasta que todos están disecados y picada.
- Incubar picadas vejigas para 60-75 min a 37 ° C, con vigoroso a mano 5 s cada 15 minutos. Cuando el tejido tiene una apariencia vidriosa transparente, papel de tejido mojado, que se asemeja a la digestión es completa. Digestión prolongada elimina proteínas de la superficie de las células necesarias para la identificación y debe evitarse.
- Inactivar las enzimas de la digestión mediante la adición de 2-3 mL de tampón de citometría de flujo helado (PBS conteniendo 2% de suero bovino fetal (FBS) y 0,2 mM EDTA) y mezclar suavemente. Coloque los tubos en hielo.
- Para asegurar una suspensión unicelular y para quitar cualquier tejido conectivo, pasar el contenido del tubo a través de un filtro de 100 μm en un tubo cónico de 15 mL. Presione suavemente cualquier tejido remanente a través del filtro con el extremo de un émbolo de la jeringa. Lavar el filtro con un búfer de citometría de flujo 2 mL adicionales. Mantener las muestras en hielo.
- Las muestras de lavado por centrifugación durante 7 min a 200 x g, 4 º C. Resuspender el pellet en 100 μl flujo cytometry con Fc bloque de amortiguamiento, diluido a 5 μg/mL y transferir a un pozo de 96 placa de fondo redondo. Después de 10-15 minutos, agregar 100 μl deseado anticuerpo cóctel para cada muestra. Incubar las muestras durante 30-45 min, en hielo, protegidos de la luz.
Nota: El bloque Fc es un reactivo utilizado para prevenir el atascamiento de la porción Fc de los anticuerpos a las células que expresan receptores Fc. Su objetivo es minimizar la Unión inespecífica del anticuerpo. Determinación de anticuerpos a utilizar dependerá de la hipótesis ensayada en el experimento y debe ser seleccionado con la entrada de la literatura. En la figura 3, para medir la infiltración de células inmunes en general, se empleó un anticuerpo anti-CD45, que es una proteína de la célula inmune al pan. - Las muestras de lavado por centrifugación durante 7 min a 200 x g, 4 º C. Resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón de citometría flujo y pasan las muestras a través de un tamiz de célula 40 μm en un tubo de poliestireno de 5 ml antes de la adquisición en un citómetro de flujo.
- Recoger toda la muestra en el citómetro de flujo. Una buena digestión producirá 200.000-400.000 células, con 8.000-10.000 CD45+ las células inmunes de vejigas de ratón ingenuo, mientras que órganos infectados contendrá más de las células16 (figura 3).
Nota: Las muestras preparadas para análisis cytometric del flujo no pueden utilizarse para evaluar UFC. No se recomienda separar la vejiga en dos partes ya que no existen pruebas que demuestran la colonización UPEC o infiltración de células inmunes es uniforme en todo el tejido.
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Resultados
En el desarrollo de este protocolo, cohortes de mujeres y hombres ratones C57Bl/6 años 6 a 8 semanas carga inculcada y bacterianas evaluadas en vejigas en momentos que van desde 1 hora a 30 días. Los resultados de estos estudios se detallan en otro lugar (Zychlinsky Scharff et al., pendiente). Aquí, presentamos datos representativos de las infecciones de 24 horas. En particular, la carga bacteriana fue equivalente entre ratones machos y hembras en 24 horas post infección (
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Discusión
La instilación transuretral de ratones machos ofrece muchas nuevas oportunidades de investigación en la influencia del sexo en la enfermedad de la mucosa vesical, pero también presenta varios desafíos. Primero, una limitación es que la instilación puede inicialmente resultar técnicamente difícil, resultando en inflamación excesiva durante la inserción del catéter. Mejora en la técnica puede lograrse mediante la instilación de ratones muertos con una solución coloreada, como colorante azul de Evans. Para confirmar que la ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Matthieu Rousseau lectura crítica del manuscrito y el laboratorio de Inmunobiología dendríticas para sus ideas útiles durante el desarrollo de este protocolo y proyecto. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la Unión Europea séptimo programa Marie Curie de acción del marco (PCIG11-GA-2012-3221170 y la empresa LabEx inmuno-Oncología (MAI).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BD Insyte Autoguard Catéteres intravenosos blindados de 24 g, 0,7 mm de diámetro externo, 14 mM de largo | BD Medical | 381811 o 381411* | * El número de catálogo depende del país |
| Asa de inoculación | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Caldo Miller | Difco | 244620 | |
| LB Agar Miller | Difco | 244520 | |
| Cubetas | Bio-rad | 223-9955 | |
| jeringas | B Braun | 9166017V | |
| Pinzas de pulgar (Adson) | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| tubos de 5 ml, polipropileno | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor sondas desechables | Qiagen | 990890 | |
| Tubos de tapa abatible de 15 ml | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | deben ser alícuotas y almacenarse a -20 ° C para evitar la congelación-descongelación repetida |
| 100 µ M MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible con tubos de 15 ml, preferido |
| 100 y micro; Filtros de células M | Falcon | 352360 | compatible con tubos de 50 ml, si no se dispone de MACS Smart Strainers |
| Placa de 96 pocillos | Falcon | 353077 | |
| Fc bloque | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anticuerpo CD45 anti-ratón | BD Biosciences | 561487 | muchas opciones diferentes de conjugación fluorescente disponibles |
| Tubos de 5 ml de poliestireno con tapón de filtro | Falcon | ||
| jeringa de insulina | Terumo | BS05M2913 | |
| homogeneizador de mano | Qiagen | 9001272 | TissueCitómetro |
| flujo | Ruptor BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Software de citometría de flujo | BD Biosciences | N/A | Diva |
Referencias
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