Flexor murino Lesión del tendón y Cirugía de reparación

Resumen

Los tendones flexores de la mano se lesionan con frecuencia, dando lugar a alteración de la función de la mano. Sin embargo, la respuesta de curación de la cicatriz de tejido no está bien caracterizado. Un modelo murino de la curación del tendón flexor se demuestra aquí. Este modelo se puede mejorar la comprensión global del proceso de curación y evaluar enfoques terapéuticos para mejorar la curación.

Resumen

Tendon conecta el músculo esquelético y el hueso, lo que facilita el movimiento de casi todo el cuerpo. En la mano, tendones flexores (FTS) permiten la flexión de los dedos y la función de la mano en general. Las lesiones en el FTS son comunes, y la curación satisfactoria a menudo se ven mermadas por el exceso de tejido cicatrizal y adherencias entre el tendón y el tejido circundante. Sin embargo, poco se sabe acerca de los componentes moleculares y celulares de la reparación FT. Para ello, un modelo murino de reparación FT que recapitula muchos aspectos de la cicatrización en seres humanos, incluyendo alteración de la amplitud de movimiento y la disminución de las propiedades mecánicas, se ha desarrollado y descrito previamente. A continuación se proporciona una demostración en profundidad de este procedimiento quirúrgico, que implica la transección y la posterior reparación del tendón flexor largo de los dedos (FDL) en la pata trasera murino. Esta técnica se puede utilizar para llevar a cabo el análisis de linaje de diferentes tipos de células, evaluar los efectos de la ganancia o pérdida de genes de función, y para probar la eficacia de las intervenciones farmacológicas en el proceso de curación. Sin embargo, hay dos limitaciones principales para este modelo: i) el tendón FDL en la porción media de la pata trasera murino, donde se producen la transección y reparación, no está rodeado por una vaina sinovial. Por lo tanto, este modelo no tiene en cuenta la contribución potencial de la funda para el proceso de formación de la cicatriz. ii) Para proteger la integridad de la zona de reparación, el FT es liberado en la unión miotendinosa, disminuyendo las fuerzas mecánicas del tendón, probablemente contribuyendo a un aumento de la formación de cicatrices. Aislamiento de células suficientes de tejido de granulación de la FT durante el proceso de curación para el análisis de citometría de flujo ha demostrado ser un desafío; centrifugación citología para concentrar estas células es un método alternativo utilizado, y permite la generación de preparaciones de células en el que puede llevarse a cabo el etiquetado de inmunofluorescencia. Con este método, la cuantificación de células o proteínas de interés durante la curación FT se hace posible.

Introducción

Los tendones flexores de la mano de obra en concierto con los músculos flexores del antebrazo y vainas digitales para permitir la flexión de los dedos y agarrar la función de la mano. Los tendones flexores corren a lo largo de la cara palmar de la mano; esta ubicación relativamente superficial a menudo resulta en lesiones de los tendones flexores durante un traumatismo en la mano. Los tendones se curan a través de una respuesta del tejido de la cicatriz en lugar de la regeneración de tejido del tendón normal de ^1. Aunque este tejido cicatricial proporciona continuidad en el tendón, la función se reduce drásticamente con respecto al tendón sano. Materiales compuestos de tejido del tendón-cicatriz se caracterizan por propiedades mecánicas reducidas ^1, lo que hace que los tendones reparados más propensos a romperse. Además, el tejido de cicatriz carece de la organización de la estructura de fibra de colágeno de tendón nativo, dando como resultado un aumento en el tamaño del tendón y a granel. Dadas las limitaciones anatómicas de la unidad de tendón-vaina, incluso un modesto incremento en el tamaño tendón puede drásticamente rojoUCE la función de deslizamiento del tendón, y por lo tanto rango dígitos de movimiento y la función de la mano.

Antes de las lesiones del 1960 a los tendones flexores, en particular los de la Zona II de la mano, no fueron reparados de forma rutinaria debido a las graves complicaciones en la cicatrización que surgieron con estas reparaciones ^2. Esta zona de la mano se conoce como 'tierra de nadie' ^3. Sin embargo, las mejoras en las técnicas quirúrgicas, los patrones de sutura y los protocolos de rehabilitación de terapia física han mejorado dramáticamente los resultados de la reparación del tendón flexor ^2. A pesar de estos avances, hasta el 40% de las reparaciones resultado la formación de una adherencia suficiente para impedir la función de la mano ^4. Por lo tanto, se requiere un enfoque biológico para mejorar la cicatrización. Por desgracia, se sabe muy poco sobre el proceso de curación del tendón a nivel celular y molecular. Por lo tanto, el objetivo fue desarrollar un modelo murino que se podría utilizar para mejorar la understandin fundamentalg de los componentes celulares y moleculares de la curación del tendón flexor y la respuesta la formación de cicatrices, como un medio para identificar nuevas dianas terapéuticas, para mejorar la curación.

modelos animales de mayor tamaño han sido fundamentales para fomentar la comprensión del proceso de curación del tendón flexor. Canina y de conejo estudios han demostrado tanto la capacidad de curación intrínseca y extrínseca de tendones flexores ^5,6, la importancia de movimiento pasivo controlado temprano en la minimización de la formación de adherencias con relación a la inmovilización ^7, así como los efectos de diferentes patrones de sutura en el proceso de curación ^{8 , 9.} Además, el modelo canino ha sido útil en el ensayo de enfoques de ingeniería de tejidos de la traducción para mejorar la cicatrización ^10. Sin embargo, hay varias ventajas importantes en el uso de un modelo murino con respecto a un modelo animal grande, incluyendo el costo relativo, la disponibilidad de reactivos específicos murinos, y la facilidad de generar KNOC mundialk-outs o construcciones de deleción / sobreexpresión específicos de tejido. Por otra parte, las similitudes funcionales entre humanos y ratones con respecto a los tendones flexores ¹¹ indican la utilidad potencial en el desarrollo de un modelo murino.

Desarrollo de un modelo murino de la transección del tendón flexor y reparación imita muchos aspectos de la curación clínica, incluyendo la formación de tejido cicatricial abundante y propiedades mecánicas reducidas. El modelo descrito aquí no es un verdadero recapitulación de la práctica clínica debido a la transección de la FDL en la unión miotendinosa el fin de proteger el sitio de reparación. Además, este modelo no tiene en cuenta la contribución de las células de la vaina sinovial de la respuesta de curación, ya que no hay vaina sinovial que cubre la porción media del tendón donde se produce la reparación. A pesar de estas limitaciones, este modelo tiene la ventaja de rango de generación de adherencias que limita el movimiento, el cual aún no se ha demostrado en modelos murinos que más closEly aproximar el escenario clínico. Este modelo ha sido utilizado para evaluar los modelos de ratón knock-out ^12,13, y para probar diferentes enfoques farmacológicos para mejorar la cicatrización ^14-17. Análisis histológicos de este modelo, mediante inmunohistoquímica e hibridación in situ, puede proporcionar importantes conocimientos en la localización de genes y proteínas clave durante la curación. Sin embargo, la histología proporciona sólo un análisis espacial de la sección transversal y no permite la cuantificación en todo el tejido. La citometría de flujo representa un enfoque más cuantitativo, pero sólo un número muy limitado de células puede ser aislado a partir del tejido del tendón de la curación en el modelo de ratón, y este número se reduce aún más durante la fijación, permeabilización, y etapas de lavado. Teniendo esto en cuenta a, citometría de flujo se convierte en un enfoque inviable debido a la cantidad de animales que se requeriría. Un método alternativo es necesario para preservar la mayor parte de esta pequeña población de células con el finpara caracterizar mejor el medio de curación. El método utilizado para lograr esto, se muestra aquí, implica la concentración de las células aisladas mediante centrifugación citología en un portaobjetos de vidrio, seguido por inmunocitoquímica. En el presente estudio EdU (5-etinil-2'deoxyuridine, un análogo de la timidina) se utilizó incorporación y posterior etiquetado para determinar el estado de proliferación relativa de células en el sitio de curación. Este enfoque se puede aplicar para probar la eficacia de los tratamientos farmacológicos en la proliferación celular, el gen knock-out o sobreexpresión, o para identificar y cuantificar diferentes poblaciones de células.

Protocolo

El Comité Universitario de Investigación Animal de la Universidad de Rochester aprobó todos los experimentos con animales. Diez-12 semanas de edad C57BL / 6J se utilizaron.

1. Preparación de los animales para la cirugía del tendón flexor (~ 15 min)

1. instrumentos quirúrgicos autoclave para esterilizar, usan guantes estériles en todo, y mantienen un campo quirúrgico estéril.
2. Anestesiar al ratón a través de inyección intraperitoneal (ip) con un volumen de ketamina (80 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) que corresponde al peso corporal. Confirmar profundidad de la sedación a través de la ausencia de reflejo dedo del pie-pellizco.
3. Administrar analgesia preventiva (buprenorfina, 0,05 hasta 0,1 mg / kg) por vía subcutánea. Aplique una pomada oftálmica para evitar que los ojos se sequen.
4. Preparar el sitio quirúrgico por el recorte de la piel en toda la extremidad posterior. Esterilizar la piel mediante lavado secuencialmente con yodo de povidona, seguido de 70% de etanol, y de nuevo con yodo povidona.

2. Flexor murino Lesión del tendón y Cirugía de reparación (~ 10 min)

1. Encuentra el tendón flexor largo de los dedos (FDL), visto superficialmente en la cara medial de la pantorrilla. El uso de un bisturí, hacer un pequeño 0,5-1 cm incisión en la piel con micro-tijeras para exponer el tendón.
2. El uso de fórceps para separar el tendón FDL del tejido circundante y rastrear hasta la unión miotendinosa. Cortar el tendón en este cruce con tijeras de primavera para liberarlo, teniendo cuidado de evitar la arteria tibial posterior.
3. Cierre la piel con suturas de nylon 5-0.
   Nota: La transección y reparación (pasos 2.4) FDL deben llevarse a cabo utilizando un microscopio estereoscópico.
4. Hacer una incisión de 3 mm sobre la cara posterolateral de la pata trasera usando primavera micro-tijeras. retraer con suavidad el tejido blando circundante y el músculo con una pinza, asegurándose de minimizar el daño tisular, e identificar el tendón FDL.
   1. levante suavemente el tendón FDL y seccionar por completo el uso de micro-tijeras. Suturar los extremos del tendón FDL juntos en un patrón Kessler modificada con 8-0 suturas, evitar el secado de la tendón humedeciendo periódicamente con solución salina.
   2. Reemplazar el tejido blando y el músculo sobre el tendón, a continuación, cerrar la incisión con suturas de nylon 5-0.
5. Coloque los ratones en un portaobjetos conjunto más caliente de 37 ° C, para mantener la temperatura corporal hasta que se recupere de la anestesia.
6. Monitorear los ratones después de la operación para detectar signos de deterioro o infección, incluyendo el aumento de la vocalización y el pelo erizado. Inyectar buprenorfina (50 l / ratón) como analgésico cada 12 h hasta que los ratones ya no muestran signos de dolor o angustia.
7. Permitir que los ratones se curen por un período de 10 días después de la cirugía antes de continuar con los pasos siguientes.
   Nota: Las células se pueden cosechar en cualquier punto de tiempo posterior a la cirugía. Aquí, 10 días son elegidos para estos experimentos representativos dada la relativamente alta celularidad del tejido en este momento.

3. Labeling del ciclo de las células (~ 10 min)

1. Preparar EdU (5-etinil-2'deoxyuridine) solución (10 mg / ml en solución salina tamponada con fosfato estéril [PBS] + 1% dimetil sulfóxido [DMSO] para aumentar la solubilidad).
2. Inyectar ratones con 100 l EdU (50 mg / kg) mediante inyección ip 24 hr antes del sacrificio.

4. Las células de cosecha para Citología centrifugación (2,5 h, ~ 30 min manos a tiempo)

1. Preparar 3 mg / ml de colagenasa I en PBS.
2. La eutanasia del ratón a través de asfixia con dióxido de carbono a una velocidad de flujo de no más de 3 L / min, y llevar a cabo la dislocación cervical como una medida secundaria.
3. Localizar el tendón reparado utilizando paso 2.4 anterior, y aislar tejido del tendón por el corte aproximadamente 2 mm a cada lado de la zona de la lesión con micro-tijeras.
   1. tejido de carne picada con el escalpelo en una placa de Petri con 1 ml de 3 mg / ml de colagenasa, a continuación, pasar la mezcla a través de una aguja de 18 G varias veces para romper el tejido. Recoger mezcla en un tubo de centrífuga de 1.5 ml.
   2. Digerir tejido del tendón durante 1 hora a 37 ° C con agitación.
   3. tejido de la vuelta hacia abajo (300 xg durante 5 min), colagenasa aspirado, a continuación, volver a suspender las células / tejido con albúmina de suero bovino 500 l 3% (BSA) en PBS pipeteando arriba y abajo varias veces.
   4. suspensión de células de filtro a través de un filtro de células de 70 micras para eliminar los residuos y grandes trozos de tendón, y dejar de lado en una incubadora a 37ºC.
   5. Coloque el tejido del tendón en otro tubo de centrífuga de 1,5 ml, y refrescar con 1 ml de solución de colagenasa, la pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
   6. Incubar el tejido otra hora a 37 ° C con agitación.
   7. Girar el tejido del tendón digerida (300 xg durante 5 min), a continuación, volver a suspender en 500 l de 3% de BSA en PBS pipeteando arriba y abajo varias veces.
   8. Filtrar la suspensión celular a través de un filtro de células de 70 micras, se combinan con la suspensión aislado en 4.3.3, a continuación, contar las células con un hemocitómetro.
   9. Lavar las células una vez más con 3% de BSA en PBS, a continuación, volver a suspender a 3-6x 10 ^4/100 l.
4. Coloque un embudo de citología a un portaobjetos con carga positiva y bloqueo en el soporte de diapositivas. Inserte todo el aparato en una centrífuga de citología y añadir la suspensión de células 100 l al embudo. Centrifugar a 300 xg durante 5 min para dispersar las células en el portaobjetos.

5. La inmunocitoquímica para detectar Edu (2 h, ~ 45 min manos a tiempo)

Nota: Todos los pasos de incubación se deben realizar en la oscuridad para limitar photobleaching de fluoróforos.

1. células de círculo con un lápiz barrera hidrófoba para minimizar solución necesaria para las siguientes etapas, a continuación, fijar inmediatamente con 150 l 3% de paraformaldehído en PBS 15 min a temperatura ambiente (RT).
   1. Lavar dos veces durante 5 minutos con 150 l 3% de BSA en PBS.
   2. células permeabilizar con 0,5% Triton X-100 en PBS 20 min a TA.
   3. Repita el paso de lavado como en 5.1.1.
2. Preparar EdU bu reacciónail acuerdo con las instrucciones del kit de no más de 30 minutos antes de su uso.
   1. Añadir cóctel de 150 l a cada diapositiva, incubar 30 min a TA.
   2. Repita el paso de lavado como en 5.1.1.
3. Incubar con 150 l contratinción nuclear Hoechst33342 diluido 1: 2000 en PBS 30 min a TA.
   1. Lavar dos veces por 5 min con 150 l de 1x PBS.
4. Añadir 1-2 gotas de medio a las células de montaje anti-fade, luego poco a poco cubreobjetos inferior para evitar burbujas.
   1. Permitir medio de montaje para curar toda la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.
   2. Utilizar esmalte de uñas transparente para sellar el cubreobjetos al portaobjetos.
5. Las diapositivas de imágenes en un aumento de 40X utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros de excitación / emisión capaces de detectar DAPI (Hoeschst33342), y Texas Red (Alexa Fluor 594).

Resultados

El flexor largo de los dedos (FDL) muscular, situado en la pantorrilla, actúa para flexionar los dedos de la pata trasera del ratón a través del tendón flexor (esbozado en azul en la Figura 1A, y se muestra histológicamente en la Figura 2A), que se extiende proximalmente desde el miotendinosa unión y termina en las falanges distales. En este modelo de cicatrización del tendón flexor, el tendón FDL se secciona y se repara en la parte media del pie, proxim...

Discusión

El procedimiento quirúrgico para un modelo murino de la transección completa y la reparación del tendón flexor largo de los dedos se presenta en este estudio. Además, se demostró una nueva aplicación de la concentración de las poblaciones de células pequeñas con centrífuga citología, lo que permite el análisis inmunocitoquímico cuantitativa del entorno celular durante la cicatrización del tendón flexor. Este modelo de reparación del tendón flexor demuestra una respuesta de curación reproducible, que se puede utilizar pa...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Preparación quirúrgica
C57BL/6J ratones	Laboratorios Jackson	000664
Ketamina	Hospira	NDC # 0409-2051-05
Xilacina	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorfina	por Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
Riego con cloruro de sodio al 0,9%	Hospira	NDC# 0409-6138-03	Para la preparación de soluciones de ketamina/xilacina y buprenorfina
Jeringa de 1 ml	BD	309659
Aguja de 30 G	BD	305106
Povidona Solución de yodo	Aplicare	82-226
70% etanol
Ungüento oftálmico veterinario Puralube	Dechra Productos Veterinarios	NDC# 17033-211-38
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Herramientas quirúrgicas
Balanza portátil 200 g	Ohaus	SP202
Tijeras de resorte	Fine Science Tools	15124-12
Pinzas Dumont #5	Fine Science Tools	11251-30
Portaagujas	Fine Science Tools	91201-13
Micro tijeras de resorte	Fine Science Tools	15003-08
Micro portaagujas	Fine Science Tools	12061-02
Suturas de nailon 5-0	Ethicon	668G
8-0 suturas de nailon para microcirugía	Ethicon	2808G
Lab-Line calentador de portaobjetos	Barnstead International	26025
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Cytospin fuerte
Tipo I, Life Technologies liofilizado		1700-017
Albúmina sérica bovina	Tecnologías de señalización celular	9998S
1x PBS	Thermo Fisher	10010-023
embudos de citología	Fisher HealthCare	10-354
Portaobjetos de microscopio HistoBond+	VWR	16005-110
Centrífuga Cytospin 2	Shandon	SH-CYTO2
Name	>Company	Número de catálogo	Comentarios
Immunocytochemistry
Bandeja de tinción deslizante con tapa negra	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Technologies	C10639	incluye EdU y   Hoeschst 33342
Immedge bolígrafo barrera hidrofóbico	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond medio de montaje	Thermo Fisher	P36970
Cubreobjetos de vidrio 24 x 50 mm #1.5
Esmalte

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