Un protocolo para utilizar un poli (N-iso propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro recubierto para la captura eficaz y la liberación de respuesta térmica de las células tumorales circulantes viables (CTC) se presenta. Este método permite la captura de CTC de la sangre de los pacientes y la posterior liberación de CTC viables para el cultivo aguas abajo fuera del chip, análisis y caracterización.
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Artículo de método
Captura y Liberación de viables células tumorales circulantes de la sangre
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Resumen
Resumen
Se demuestra un método para la captura basado tamaño de viable circulantes de células tumorales (CTC) de la sangre entera, junto con la liberación de estas células de chip para análisis y / o cultivo de aguas abajo. La estrategia emplea el uso de una novela parileno C microfiltro poro ranura membrana para capturar CTC y un revestimiento de poli (N-iso propilacrilamida) (PIPAAm) para termosensible liberación viable de la CTC capturado. La captura de células vivas se habilita al aprovechar el diseño de una geometría de poro ranura con dimensiones específicas para reducir la tensión de corte típicamente asociados con el proceso de filtración. Mientras que el microfiltro exhibe una alta eficacia de captura, la liberación de estas células no es trivial. Típicamente, sólo un pequeño porcentaje de las células se liberan cuando se utilizan técnicas tales como el flujo inverso o raspado celular. La fuerte adhesión de estas células cancerosas epiteliales a la membrana de parileno C es atribuible a la interacción electrostática no específica. Para contrarrestar THes efecto, hemos empleado el uso de recubrimiento PIPAAm y explotaron sus propiedades interfaciales de respuesta térmica para liberar las células del filtro. La sangre se filtró primero a temperatura ambiente. Por debajo de 32 ° C, PIPAAm es hidrofílico. A partir de entonces, el filtro se coloca en cualquiera de los dos medios de cultivo o un tampón mantenido a 37 ° C, lo que resulta en la PIPAAm girando hidrófobo, y posteriormente la liberación de las células electrostáticamente consolidados.
Introducción
La enfermedad metastásica es responsable de la mayoría de las muertes por cáncer. El desarrollo de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico compañero para la metástasis es crucial en el manejo y tratamiento del cáncer. Las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel central en la diseminación tumoral y la metástasis. Además, al ser de fácil acceso como un biomarcador 'biopsia líquida', CTC en pacientes con cáncer de la sangre periférica ha ido en aumento como un "caldo de cultivo" para la investigación de biomarcadores de cáncer. CTC han sido bien validado como un biomarcador de pronóstico en diversos entornos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, de próstata y el cáncer colorrectal 1-3. Sin embargo, los recientes avances en el campo de CTC ha indicado que la simple enumeración de estas células raras ha limitado la utilidad clínica, como se muestra en los ensayos clínicos de intervención 4. Por lo tanto, hay una necesidad emergente de tecnologías que permiten la caracterización molecular y funcional de CTC. En la actualidad, sólo existen pocas tecnologías que permiten for antígeno no sesgada, la captura viable y liberación de CTC, lo que permite robusto 5,6 análisis molecular y funcional de aguas abajo. La mayoría de estos dispositivos microfabricados se acoplan a las plataformas de microfluidos y por lo tanto tienen un factor limitante en la cantidad de sangre que que se pueden procesar, que oscila desde 2 hasta 4 ml 7-10. CTC son eventos raros en un único tubo de extracción de sangre (7,5 ml), por lo tanto reduciendo aún más la cantidad de sangre que puede ser procesada, dificulta en gran medida las posibilidades de capturar y aislar estas células de interés.
Hemos desarrollado dos tipos de dispositivos de microfiltro de membrana parileno C para la captura de CTC que explotan las diferencias de tamaño entre las células tumorales más grandes y las más pequeñas células sanguíneas normales 11,12. Hemos informado anteriormente en el filtro de poro enumeración ronda y lo comparó con una plataforma aprobada por la FDA, en el que el microfiltro se demostró que era superior en eficiencia de la captura de CTCpara las muestras de sangre de pacientes de cáncer 13,14. Sin embargo, una limitación del filtro redondo es la necesidad de utilizar un fijador a base de formaldehído antes de la filtración. Este proceso conserva la morfología de las células, mientras que lo que les permite resistir el esfuerzo cortante y presión durante el proceso de filtración. Mientras que la enumeración y los estudios moleculares se pueden realizar en el chip 13, el fijador deteriora la capacidad para llevar a cabo la caracterización funcional. Para hacer frente a esta limitación, hemos desarrollado un filtro de poro ranura que niega la necesidad de fijar las células antes de la filtración (Figura 1). La geometría de poros ranura (6 m de ancho x 40 micras poros de ranura longitud) permite que las células tumorales a ser capturados mientras ocluir sólo parcialmente un poro y por lo tanto aún permite el paso libre para otras células de la sangre y aliviar el aumento de presión que daría lugar a daño celular y eventual ruptura 15,16 El cartucho de poro ranura se compone de 2 piezas de acrílico que sándwichel filtro de poro ranura entre la pieza superior e inferior con polidimetilsiloxano (PDMS) que actúa como una junta para proporcionar una fuga sello a prueba de 14,15 (Figura 1).
Mientras que la eficacia de la captura del filtro de poro ranura es alta, (Tabla 1), el CTC capturado están unidos a la membrana de parileno C por fuertes interacciones electrostáticas no específicas en lugar de la matriz extracelular (ECM) de adhesión 15 mediada. Métodos tales como el flujo inverso o el uso de rascadores de células no liberan eficazmente las células del filtro, o resultar en el daño celular y la muerte celular. Exploramos un uso no convencional de PIPAAm para formular una estrategia de liberación 15. PIPAAm es un polímero que experimenta una transición de fase reversible de temperatura de solución crítica inferior (LCST) a una temperatura de la solución de 32 ° C 17. Tradicionalmente, esta propiedad de PIPAAm ha sido ampliamente explorada para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Típicamente, las células sonsuperficies cultivadas en PIPAAm revestido a 37 ° C cuando PIPAAm es hidrófobo. Las células luego se pueden separar como una hoja cuando la temperatura de cultivo se desplaza por debajo de 32 ° C, donde la superficie de PIPAAm recubierto se hidrata 17,18. Hemos explotado esta propiedad térmica mediante la realización del proceso de filtración a temperatura ambiente (por debajo de 32 ° C) y luego permitiendo la liberación de células colocando el filtro en medios de cultivo se mantuvo a 37 ° C. A esta temperatura, la capa de polímero PIPAAm se convierte en hidrófobo, liberando de este modo las células unidas electrostáticamente 15 (Figura 1).
Aunque el método sensible a la temperatura, así como otros métodos se han aplicado con éxito para lograr la captura de CTC viable y liberar 19 - 21, un inconveniente potencial de clave compartida por estas tecnologías reportados es que todos ellos emplean un principio dependiente de antígeno para la captura de CTC. Antígeno de captura CTC base, como se muestra pestaba viendo anteriormente, puede dar lugar a 11,14 sesgado análisis de CTC. Por ejemplo, muchas tecnologías basadas en la afinidad emplean anticuerpo que se une EpCAM para la captura de CTC. Sin embargo, CTC se ha demostrado que expresan varios niveles de EpCAM, que conduce a la omisión de EpCAM baja y EpCAM CTC negativa por estas tecnologías. Además, las limitaciones se pueden producir cuando CTC de origen no epitelial es de interés, tal como en la configuración de CTC de melanoma y el sarcoma. Por lo tanto, una tecnología que permite la captura y liberación CTC viables y sin sesgo potencial introducido por captura basada antígeno es altamente deseable.
Es importante destacar que el dispositivo de captura de microfiltro es puramente basado tamaño y la estrategia de liberación es agnóstico a la presencia de ciertos marcadores de superficie. Creemos que el empleo del microfiltro recubierto PIPAAm ayudará a ampliar nuestra comprensión del proceso metastásico, a través de proporcionar la capacidad de capturar y liberar CTC para los análisis posteriores con eficacia y eficiencia. Esto puede potenteially exponer nuevas moléculas para las cuales terapias novedosas sistémicos pueden ser dirigidas, así como proporcionar un biomarcador que puede controlarse fácilmente y ayuda en la gestión de los pacientes de cáncer.
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Protocolo
Declaración de Ética: Para proteger los derechos de los sujetos humanos, las muestras de sangre se obtuvieron después de un consentimiento informado en virtud de los protocolos aprobados por la Universidad de Miami juntas de revisión institucional bajo el IRB 20150020.
NOTA: La sangre que se filtra para la captura de CTC se debe recoger en un tubo con EDTA para prevenir la coagulación.
1. Recubrimiento de la microfiltro con poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm)
- Pesar PIPAAm para preparar una solución 10% w / v en butanol. Mezclar utilizando un vortex hasta que la solución es clara.
- microscopio plástico corte se desliza dentro de más o menos 12 mm x 12 mm cuadrados o bien con un par de tijeras o cuchilla afilada. Alternativamente, puede utilizar una guillotina.
NOTA: Estos cuadrados servirán como soporte para los filtros durante el proceso de recubrimiento por rotación. - Con un par de tijeras afiladas borde recto, corte la ranura de poro del microfiltro oblea en 8 mm x 8 mm cuadrados.
- Utilizando una cinta de película de poliamida asegurar los filtros de corte en el plástico squares cortada previamente en el paso 1.3. Aplicar la película sólo para el borde y la esquina del filtro de modo que al menos 7 mm x 7 mm de área de filtro es un-cubierto por la cinta.
Figura 2:. Ilustración representativa del microfiltro Set-up para PIPAAm revestimiento de 8 mm x 8 mm microfiltro se coloca en el 12 mm x mm de plástico 12 de corte cuadrado de un portaobjetos de microscopio de plástico. Cinta de poliimida se utiliza para asegurar el microfiltro en su lugar para hacer girar el escudo PIPAAm.Reproduced con permiso de referencia 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Coloque el microfiltro que se asegura en la plaza de plástico, sobre el mandril vacío del spin-revestidor.
- Programar el spin-revestidor con la siguiente receta: Inicio, 500 rpm durante 10 seg, 6.000 rh durante 60 segundos, 500 rpm durante 10 segundos, en Detener.
- Dispensar suficiente 10% w / v solución PIPAAm (preparado en 1.1) para cubrir completamente la superficie microfiltro con una pipeta de transferencia de plástico estándar y comenzar la recubridora de rotación.
- Retire el microfiltro PIPAAm recubierto de la escisión recubridor después de completar el proceso de recubrimiento. Deje el filtro unido al cuadrado de plástico durante el almacenamiento.
NOTA: El filtro revestido se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 3 meses.
2. Conjunto de filtración de casete con microfiltro PIPAAm Coated
- Rehidratar microfiltro recubierto PIPAAm a temperatura ambiente colocando el microfiltro todavía protegido en el cuadrado de plástico en una placa de Petri. Añadir 1x PBS hasta que el microfiltro está totalmente sumergido y dejar reposar durante 5 minutos.
- Después de la etapa de hidratación, suelte el filtro de la plaza de plástico mediante la reducción de la cinta de la película de poliimida con un par de tijeras.
NOTA: Tome nota de qué lado del filtro tieneel recubrimiento de PIPAAm. - Montar el microfiltro en el casete de filtración, intercalando el microfiltro entre la pieza de acrílico parte superior e inferior junto con las piezas 2 polidimetilsiloxano (PDMS) que actúa como una junta / sello. Sujetar el casete acrílico con clips para asegurar el filtro y proporcionar un sello hermético.
NOTA: El recubrimiento PIPAAm debe estar mirando hacia arriba, de manera que la muestra se filtró a través de, las células serán capturadas en la superficie recubierta PIPAAm del filtro (Figura 1).
3. La filtración de la muestra de sangre con la captura y liberación de CTC del microfiltro
- Como cada marca bomba de jeringa tiene su propia interfaz de usuario, consulte el manual de usuario de la bomba y programar la bomba de jeringa a fluir a una velocidad de 75 ml / h, y ajustar el volumen a 20 ml.
- Caliente 3 ml de medio (comercialmente disponible) de cultivo de células de McCoy (preparado mediante la adición de 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina y estreptomicina) a 37 ° C.
NOTA:. La elección de medios se basará en el tipo de cáncer del paciente o de lo contrario, si se trata de un experimento sistema modelo en el que las células cultivadas son que enriquecerse en sangre de donantes sanos, utilizar los medios de comunicación las células normalmente son cultivadas en caso de duda, consulte la guía de cultivo / método proporcionado por la empresa las células se compraron a. - Añadir 7,5 ml de solución salina equilibrada de Hank disponible comercialmente (HBSS) a la muestra 7,5 ml de sangre y aspirar esta sangre diluida en una jeringa de 25 ml.
NOTA: Ajuste el volumen de HBSS para que la muestra de sangre se diluye con un volumen igual de 1: 1 con HBSS Por ejemplo, si se utilizan 10 ml de sangre, a continuación, mezclar con igual volumen de 10 ml de HBSS para alcanzar el 1:. Dilución 1. - Enganche el casete de filtración con la jeringa y colocarlo en la bomba de jeringa. Colocar un tubo de 50 ml en la parte inferior para recoger el flujo a través de la bomba y comenzar.
NOTA: La filtración debe tener más o menos 10- 12 min. Todas las etapas de filtración se deben llevar aa temperatura ambiente normal (20-25 ° C), que incluye el paso 3.8 - Después de la filtración es completa, desenganchar el cartucho de filtración toma nota de qué lado está la parte superior que tiene las células atrapadas en la superficie recubierta de PIPAAm. Aspirar 1 ml de medio de cultivo caliente en una nueva jeringa.
- Volver a participar el casete de filtración con la jeringa que contiene los medios de comunicación, pero en este momento enganchar el extremo inferior de la casete de manera que el recubrimiento de superficie PIPAAm del filtro está de espaldas a la jeringa.
NOTA: Esta será la de liberar las células que pueden estar dentro de los poros de la ranura mediante la aplicación de flujo inverso suave. - Coloque la jeringa de nuevo en la bomba de jeringa y mantener una pequeña placa de Petri o placa de 6 pocillos justo debajo de la casete de filtración. Ajuste la velocidad de flujo de 100 ml / hora y arrancar la bomba.
- Pasar todos los medios de comunicación a través del filtro y se recoge el flujo a través de la placa de Petri. Espere a que todos los medios de comunicación para pasar a través y luego detener la bomba y retire la jeringa unand casete de filtración de la bomba.
- Desconectar el casete de filtración de la jeringa y abrirlo para recuperar el filtro de la cassette. Colocar el filtro con la superficie de PIPAAm hacia abajo en la misma placa de Petri utilizada para recoger el flujo inverso al liberar las células de los poros. Añadir el resto de los medios de comunicación cálidos y colocar la placa de Petri en un incubador de cultivo a 37 ° C.
- Después de 30 minutos todas las células se liberan del filtro. Sin embargo, dejar de filtro en la placa de Petri para un máximo de 24 horas para asegurarse de que todas las células se separan.
NOTA: Como alternativa, las células liberadas se pueden recoger en un tubo de microcentrífuga para llevar a cabo un análisis más detallado de aguas abajo, tales como PCR, ELISA, Western Blot para nombrar algunos ejemplos. - Después de 24 horas en cultivo, retirar con cuidado el microfiltro el uso de fórceps.
NOTA: El filtro se puede descartar en este momento ya que las células se han liberado de ella. - pipeta suavemente el medio de cultivo arriba y hacia abajo usando un & # 1000181; l pipeta, para volver a suspender los eritrocitos y células mononucleares de sangre periférica (CMSP) que son capturados en el filtro y se libera en la placa con la CTC. Realizar esta acción con cuidado y suavemente para evitar separando las células cancerosas unidos débilmente. Retirar con cuidado el medio completo que contiene los eritrocitos resuspendidas y PBMC, dejando detrás de las células del cáncer adjunta y sustituto con medio fresco precalentado a 37 ° C.
NOTA: Este paso puede repetirse una vez si los eritrocitos excesivas están presentes después de un lavado.
4. Evaluación de Viabilidad CTC
- Evaluar la viabilidad cultivaron CTC usando un / Ensayo Dead Live 8.
NOTA: Numerosos ensayos Live / Dead están disponibles comercialmente. Siguiendo el protocolo del fabricante, es muy recomendable. Por favor refiérase a la lista de materiales y / o reactivos para el kit de ensayo comercial utilizado para este experimento.
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Resultados
El uso de la sangre de donantes sanos '(obtenida bajo un protocolo aprobado por la Universidad de Miami IRB 20150020 después de un consentimiento informado) enriquecida con células cancerosas cultivadas, la técnica de respuesta térmica para la liberación de células viables circulantes tumorales (CTC), la captura lograda, la liberación y la eficiencia de recuperación de 94% ± 9%, 82% ± 5% y 77% ± 5%, respectivamente (Tabla 1) 15. En comparación, la eficienc...
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Discusión
El proceso de captura de CTC viable de la sangre entera y de liberarlos del microfiltro es relativamente sencilla; Sin embargo algunos puntos críticos son dignos de mención. Es imperativo, como con todo el cultivo de células que una condición estéril se mantiene a través de todo el proceso. El paso inicial de recubrir el filtro con PIPAAm es crítica, como la base para la técnica de la liberación de las células del filtro se basa en la explotación de propiedades interfaciales sensibles a la temperatura de PIPAAm. Para as...
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Divulgaciones
Parte de este trabajo ha sido protegido por la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/219,808. Siddarth Rawal es accionista de Circulogix Inc. que produce comercialmente los filtros y casetes/cartuchos de filtro utilizados en este artículo.
Agradecimientos
Agradecemos a todos los pacientes que han donado muestras de sangre para apoyar este trabajo. Agradecemos a los Dres. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli y Marc E. Lippman por su asistencia en la adquisición de muestras clínicas, y a los Dres. Carmen Gómez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana López por sus perspicaces discusiones. Zheng Ao agradece el apoyo parcial y la asistencia del Programa de Posgrado en Biología del Cáncer Sheila y David Fuente, Sylvester Comprehensive Cancer Center.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Filtro de ranura | Circulogix Inc. | MSF-01 Filtros de | diferentes tamaños disponibles para la filtración de CTC de sangre u orina (www.circulogixinc.com) |
| poli(N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | No peligroso. Almacene a temperatura ambiente. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Uso en un área bien ventilada |
| Portaobjetos de microscopio de plástico | Cole-Parmer | 48510-30 | Se pueden usar cualquier portaobjetos de plástico o, alternativamente, cualquier tipo de cuadrado (metal, acrílico, etc.) si se va a usar para sostener el filtro cuadrado de 8 mm x 8 mm |
| Spin Coater | Sistemas de recubrimiento especiales | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Cinta de poliimida | Uline | S-7595 | La poliimida es el nombre genérico de la cinta Kapton que se puede comprar a varios proveedores (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Solución salina equilibrada de Hank | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Placas de Petri 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Casete de microfiltro | Circulogix Inc. | FC-01 | Las crestas de gato personalizadas están disponibles en función de la filtración para CTC de la sangre o la orina |
| Jeringa 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Bomba de jeringa | KD scientific | 78-0100V | Se puede utilizar cualquier bomba de jeringa capaz de contener una jeringa de 25 ml |
| Cellstar 50 ml Tubo de centrífuga | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One Placa de 6 pocillos | VWR | 89131-688 | Se puede utilizar cualquier marca, siempre que la superficie sea compatible con la adesión celular y no repelente |
| Células SKBR3 | ATCC HTB-30 | ||
| Ensayo de muertos vivos | Life Technologies | L3224 | Cualquier ensayo que pueda proporcionar un análisis razonable para evaluar células vivas funcionará |
| Incubadora de cultivo celular | VWR | 98000-368 | Cualquier incubadora que se pueda utilizar para el cultivo celular será suficiente |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
