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Artículo de método

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

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DOI:

10.3791/54457

⸱

9 de septiembre de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este manuscrito presenta un método de moldeo por inyección para diseñar microvasos que recapitular las propiedades fisiológicas de endotelio. El proceso basado en microfluidos crea redes vasculares 3D patente con condiciones tailorable, tales como gradientes bioquímicos de flujo, composición celular, la geometría, y. Se describe el proceso de fabricación y los ejemplos de posibles aplicaciones.

Resumen

En plataformas in vitro para estudiar las células endoteliales y la biología vascular se limitan en gran medida a la cultura de células endoteliales 2D, el flujo cámaras con polímero o sustratos a base de vidrio, y ensayos de formación de tubo a base de hidrogel. Estos ensayos, mientras informativa, no se recapitulan la geometría del lumen, la matriz extracelular adecuada, y la proximidad multicelular, que juegan un papel clave en la modulación de la función vascular. Este manuscrito describe un método de moldeo por inyección para generar vasos diseñado con diámetros del orden de 100 micras. Los microvasos se fabrican mediante la siembra de células endoteliales en un canal microfluídico incrustado dentro de un tipo nativo I colágeno hidrogel. Mediante la incorporación de las células del parénquima dentro de la matriz de colágeno antes de la formación de canal, microambientes específicos de tejido pueden ser modeladas y estudiadas. modulaciones adicionales de propiedades y medios hidrodinámico composición permiten el control de la función vascular compleja dentro del microambiente deseada.Esta plataforma permite el estudio de la contratación perivascular de células, las interacciones sangre-endotelio, respuesta de flujo, y las interacciones de tejido microvascular. microvasos ingeniería ofrecen la posibilidad de aislar la influencia de los componentes individuales de un nicho vascular y precisamente controlan sus químicos, biológicos, mecánicos y propiedades para estudiar la biología vascular tanto en la salud y la enfermedad.

Introducción

La microvasculatura en cada órgano ayuda a definir el microambiente del tejido, mantener la homeostasis del tejido y regulan la inflamación, la permeabilidad, la trombosis, y la fibrinólisis 1,2. Endotelio microvascular, en particular, es la interfaz entre el flujo sanguíneo y el tejido circundante y por lo tanto juega un papel crítico en la modulación de la función del órgano vascular y en respuesta a estímulos tales como las fuerzas hidrodinámicas y citoquinas circulantes y hormonas 3 - 5. La comprensión de las interacciones detalladas entre el endotelio, la sangre y el microambiente tejido circundante es importante para el estudio de la biología vascular y progresión de la enfermedad. Sin embargo, los avances en el estudio de estas interacciones se ha visto obstaculizado por limitada en herramientas in vitro que no recapitulan en la estructura microvascular vivo y la función 6,7. Como resultado, el campo y el avance terapéutico se ha basado en gran medida en costoso y tiempo-el consumo de modelos animales que a menudo no traducir del éxito en seres humanos 8 - 10. Mientras que los modelos in vivo son de gran valor en el estudio de mecanismos de la enfermedad y funciones vasculares, que son complejas y a menudo carecen de un control preciso del individuo celular, bioquímica, y las señales biofísicas.

Vasculatura en todo el cuerpo posee una estructura jerárquica madura en conjunción con lechos capilares expansivas, proporcionando la perfusión optimizado y el transporte de nutrientes al mismo tiempo 11. Inicialmente, las formas vasculatura como un plexo primitiva que reorganiza a una red jerárquica ramificada durante el desarrollo temprano 12,13. Aunque muchas de las señales implicadas en estos procesos se conocen bien 14 - 16, sigue siendo difícil de alcanzar, tales cómo el patrón vascular se determina 15. A su vez, la recapitulación de este proceso in vitro para diseñar redes vasculares organizados tiene abejan. Muchas plataformas difíciles existentes in vitro para modelar la vasculatura, por ejemplo, dos cultivos de células endoteliales dimensionales, carecen de características importantes tales como la proximidad multi-celular, tres geometría luminal dimensional, flujo, y de la matriz extracelular. Los ensayos de formación de tubos en 3D (hidrogeles de colágeno o fibrina) 17 - 19 o invasión ensayos de 20,21 se han utilizado para estudiar la función endotelial en 3D y sus interacciones con otras vasculares 17,22 celulares o tejidos tipos 23. Sin embargo, ensamblados lúmenes en estos ensayos carecen de interconectividad, el flujo hemodinámico, y la perfusión adecuada. Además, la propensión a la regresión vascular en estos ensayos de formación de tubo 24 impide que la cultura a largo plazo y la maduración que limita el grado de estudios funcionales que se pueden realizar. Por lo tanto, hay una necesidad creciente para diseñar plataformas in vitro de redes microvasculares que pueden modelar adecuadamente ESendotelial características y son capaces de cultivo a largo plazo.

Una variedad de técnicas de ingeniería vasculares han surgido en los últimos años para aplicaciones médicas para reemplazar o vasos de derivación afectada en pacientes con enfermedad vascular. Vasos de gran diámetro fabricados con materiales sintéticos tales como tereftalato de polietileno (PET), y politetrafluoroetileno (PTFE) han tenido un considerable éxito terapéutico con la permeabilidad a largo plazo (promedio 95% la permeabilidad de más de 5 años) 25. Aunque de pequeño diámetro injertos sintéticos (<6 mm) por lo general se enfrentan a complicaciones tales como hiperplasia de la íntima y trombopoyesis 26 - 28, ingeniería tisular injertos de pequeño diámetro hechos con material biológico han hecho progresos significativos 29,30. A pesar de los avances de este tipo, los vasos de ingeniería en la microescala han seguido siendo un reto. Para modelar adecuadamente la microvasculatura, es necesario para generar patrones de red complejas con sufciente resistencia mecánica para mantener la permeabilidad y con una composición de matriz que permite tanto la permeación de nutrientes para las células del parénquima y remodelación celular.

Este protocolo presenta una novedosa red de vasos artificiales perfusable que imita un nativo in vivo con un ajuste ajustable y controlable microambiente el 31 de - de 34. El método descrito genera microvasos Diseñado con diámetros del orden de 100 micras. microvasos ingeniería se fabrican mediante la perfusión de las células endoteliales a través de un canal de microfluidos que está incrustado dentro del tipo I colágeno suave hidrogel. Este sistema tiene la capacidad de generar redes modelados con estructura luminal abierta, replicar las interacciones multicelulares, modular la composición de la matriz extracelular, y aplicar fuerzas hemodinámicas fisiológicamente relevantes.

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Protocolo

1. La microfabricación de modelado polidimetilsiloxano (PDMS) con el diseño de redes

  1. Fabricación de obleas para crear una plantilla negativo de la Red de Diseño
    1. Crear un modelo de red utilizando cualquier software de diseño (CAD) asistido por ordenador. Asegúrese de que la dimensión diagonal entre la entrada y la salida coincide con la distancia entre los depósitos de entrada y salida en los dispositivos de la vivienda en los pasos futuros (véase 2.1.1).
      Nota: El diseño del modelo en sí es en función a medida en los objetivos de investigación específicos del usuario (ver Figura 1, por ejemplo, patrones).
    2. Generar una máscara del patrón de red mediante la impresión de alta resolución o pedir una foto máscara de cromo de un proveedor comercial. Un protocolo más detallado del proceso de fotolitografía está disponible en otra parte 35.
    3. Limpiar una oblea de 8 "de silicio durante 5 min a 100 W con el tratamiento con plasma de oxígeno.
    4. Vierta suficiente fotoprotector negativo (SU-82.100 funciona bien) sobre la oblea de tal manera que la capa protectora forma una porción con diámetro de 2,5 cm. El uso de un revestidor de giro, girar la oblea a 500 rpm con 100 rpm / sec rampa y mantener durante 10 seg. Después volver a 1.600 rpm con 300 rpm / seg y mantener durante 30 segundos. Nota: La velocidad y la rampa deben optimizarse para cada condición de laboratorio para producir un espesor de 150 micras resistir.
    5. Soft-hornear la oblea a 65 ° C durante 7 minutos, la rampa de hasta 95 ° C a 360 ° C / h, y mantener durante 45 minutos. Enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente en el plato caliente. Imprimir el patrón de los vasos sobre la oblea recubierta por la exposición a la luz UV de 365 nm con una fotomáscara de cromo, con la exposición triple que la de la recomendación del fabricante (350 mJ / cm2 para un espesor de SU-8 de alrededor de 150 micras).
      Nota: Desde SU-8 es resistirse a una negativa, las regiones expuestas (todo excepto el patrón de diseño) se vuelven insolubles para el desarrollador en el paso 1.1.7.
    6. Hard-hornear la oblea expuesta a los 65 años° C durante 5 min y rampa de hasta 95 ° C a 360 ° C / hr y mantener durante 25 minutos, luego deje que se enfríe lentamente hasta la temperatura ambiente en el plato caliente.
    7. Sumergir la oblea en el SU-8 desarrollador durante 10 - 15 min para lavar no expuesta resistir, a continuación, limpie con alcohol isopropílico y se seca bajo un flujo de nitrógeno comprimido. Inspeccionar el patrón bajo un microscopio de luz para asegurar el SU-8 se resisten bien adheridos a la oblea (busque pelado y las burbujas no deseado).
    8. Medir el espesor de las características de patrón mediante un perfilómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante 36. Durante la adquisición de medición, evitar regiones de la estructura que son esenciales para la función de red (es decir, de entrada y conductos de salida) como un perfilómetro de contacto basado podría poner en peligro la integridad estructural de las características estampadas en la oblea. Alternativamente, utilizar un método sin contacto (es decir, perfilómetro óptico) para evitar este problema por completo.
  2. Generación de modelado y plana Moldes para Moldeo por colágeno
    Nota: Manejar silanos dentro de una campana de humos química.
    1. Colocar la oblea en un desecador con 100 l de tricloro (3,3,3-trifluoropropilo) silano durante 2 horas a silanizar la superficie.
    2. Transferir oblea silanizada en un 120 x 120 mm cuadrados placa de Petri. Verter agente de mezclado y de-gaseado elastómero PDMS y curado (10: 1 w / w ratio) sobre la oblea para lograr 4-6 mm de espesor. Verter PDMS adicionales en un cuadrado plato separado 120 x 120 mm de Petri para generar moldes planos y sin patrones. Curado a 65 ° C durante 2 horas.
    3. Retirar del horno y permitir que el PDMS se enfríen a temperatura ambiente. Con un bisturí cortar cuidadosamente un cuadrado alrededor del SU-8 y tire lentamente el molde de PDMS de la oblea. Recortar los bordes de 30 mm x 30 mm. Para moldes planos, corte curado PDMS sin un patrón impreso en piezas cuadradas de 40 mm x 40 mm.

2. Dispositivos de vivienda

  1. fabricatión de piezas superior e inferior de Vivienda
    1. Fabrique vivienda recipiente usando poli (metacrilato de metilo) (PMMA). Para fabricar, ordenar las partes de una tienda de máquina estándar con capacidades de fresado de control numérico (CNC). Véase la Figura 1 para un esquema de las piezas superior e inferior.
    2. Diseño de la pieza de carcasa superior (Figura 1D) para incluir un 20 mm x 20 mm bien en la parte inferior del dispositivo con una profundidad de 1 mm, dos orificios de inyección de colágeno (diámetros 4 mm) en la parte superior del dispositivo situado en las esquinas de la plaza, así, dos depósitos de entrada y salida con 6 mm de diámetro, y cuatro orificios de los tornillos (3 mm de diámetro) en las cuatro esquinas del dispositivo.
      Nota: Los agujeros adicionales pueden ser perforados en la periferia de la pieza para propósitos de manipulación.
    3. Diseñar la pieza inferior de la carcasa (Figura 1E) para incluir un agujero cuadrado en el centro (dimensiones de 15 mm x 15 mm) con un entorno de 25 mm x 25 mmestante con una profundidad de 0,25 mm. Taladro 4 agujeros de los tornillos con rosca 4-40. Asegúrese de que los orificios de los tornillos en la parte inferior y superior piezas se alinean juntos durante futuros pasos de montaje.

3. microvasos la fabricación del dispositivo

  1. Preparación de Materiales
    1. Lavar y esterilizar en autoclave dos juegos de pinzas, una espátula de acero inoxidable, un destornillador plano pequeño, tornillos de acero inoxidable, y varios pasadores de acero inoxidable. Para la fabricación de los vasos, también autoclave moldes de PDMS micropatterned, PDMS cuadrados planos, cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm), y piezas de algodón.
    2. Esterilizar las piezas de cubierta de PMMA en lejía durante al menos 1 hora, luego enjuague con agua esterilizada en autoclave en la campana de cultivo de tejidos en dos ocasiones, y dejar secar al aire en placas de cultivo de tejido estéril (150 mm x 25 mm).
  2. Estéril polietilenimina-glutaraldehído (PEI - GA) Recubrimiento
    1. Tratar pocillos interiores de piezas de PMMA secos esterilizadoscon plasma durante aproximadamente 1 min. Añadir 1% polietilenimina (PEI) en los pozos interiores (los 20 mm de lado así en la parte superior y la plataforma cuadrada de 25 mm en la parte inferior) de las piezas de PMMA durante 10 minutos. Enjuague con estéril H 2 O y dejar secar en la campana de cultivo de tejidos.
      Nota: El tiempo necesario para el tratamiento con plasma es variable dependiendo del dispositivo que se utiliza - la PEI debe propagarse fácilmente que indica una superficie hidrófila. Si no, puede ser necesario el tratamiento con plasma adicional.
    2. Aplicar 0,1% de glutaraldehído (GA) en PEI tratada superficies de las piezas de PMMA para 30 min. Enjuague dos veces con agua estéril y dejar secar.
      Nota: En los pasos futuros, el colágeno se adherirá a la superficie recubierta a través de la reticulación de colágeno-glutaraldehído. Esto ayuda a asegurar el gel en su lugar dentro del dispositivo durante futuros pasos de montaje y durante todo el periodo de cultivo dispositivo.
  3. Preparación del gel del colágeno
    1. Fabricar barcos que utilicen el 0,6% - 1% de colágenosoluciones. Para producir colágeno 0,75% para la fabricación de recipientes, tipo de la mezcla I colágeno solución madre (1,5% - aislado de rata colas 37) con hidróxido de sodio (NaOH), 10x Medios Suplemento (M199), y medios de cultivo celular. Mantenga todas las soluciones en hielo.
    2. Determinar el volumen de colágeno mediante la siguiente ecuación, donde V ƒinal es el volumen final de gel requerido (por lo general, 1 ml de colágeno por dispositivo es suficiente), V colágeno de valores es el volumen de colágeno de stock necesario, colágeno de C es la concentración del colágeno de valores, colágeno y C ƒinal es la concentración deseada del colágeno en el recipiente.
      figure-protocol-1
    3. Usar una jeringa de 1 ml para transferir el volumen apropiado de colágeno de stock a un nuevo tubo cónico de 30 ml. Determinar los volúmenes de la NaOH neutralizante (V NaOH), M199 10x suplemento medios(V 10 X), y medios de cultivo celular (V 1 X) como sigue y mezclar por separado en un tubo cónico de 15 ml:
      figure-protocol-2
    4. Añadir la mezcla de reactivos neutralizantes (V 10 X, NaOH V, V 1 X) al colágeno alícuota, y el uso de una pequeña espátula para mezclar suavemente la solución hasta que se obtiene un gel homogéneo. Evitar la introducción de burbujas de agitación lenta y suavemente.
    5. Para incorporar las células en la matriz a la concentración deseada (por ejemplo, 0,5 - 20 millones de células / ml), añadir a las células a la solución de colágeno después de que se mezcla con los reactivos de neutralización, y se continúa agitando hasta que las células se distribuyen homogéneamente.
    6. Cuando se añaden las células, ajustar el volumen de medios de cultivo celular para acomodar el volumen adicional, tal como se determina por la siguiente ecuación, donde las células V </ sub> es el volumen requerido de la suspensión de células, C densidad celular ƒinal es la densidad deseada de las células en el recipiente, la densidad de células en suspensión C es la densidad de las células en la solución madre.
      figure-protocol-3
  4. La inyección de colágeno - Parte superior del
    1. Coloque el molde de PDMS micropatterned en un 100 mm x 20 mm plato. Plasma limpiar el molde de PDMS durante 1 min.
    2. Alinear la pieza de PMMA parte superior en la parte superior del molde de PDMS de manera que los depósitos de cuadrados en el molde están directamente debajo de los depósitos de entrada y de salida (véase la Figura 1D - líneas de trazos). Coloque los pasadores de acero inoxidable en la entrada y salida agujeros de depósito en la pieza de PMMA parte superior para mantener el acceso claro a partir de los depósitos en el patrón.
    3. Utilice una jeringa de 1 ml para extraer ~ 0.5 - 0,6 ml de colágeno. Asegúrese de que no queden burbujas permanecen en la jeringa.
    4. Presione hacia abajo lightly con pinzas en la parte superior de la carcasa para asegurar el contacto al ras entre la pieza superior y el molde de PDMS. Inyectar colágeno lentamente a través de un puerto de inyección sobre la pieza de PMMA superior. Compruebe que el colágeno se llena en el dominio de 20 mm x 20 mm por encima del patrón y no se escape.
    5. Cierre el plato sin empujones los pasadores y dejar cuajar en una incubadora a 37ºC durante 30 min.
  5. La inyección de colágeno - pieza inferior
    1. Colocar un cubreobjetos de vidrio 22 x 22 mm en el centro de la pieza inferior. Utilice una jeringa de 1 ml para dispensar ~ 0,25 ml de colágeno de manera uniforme sobre el portaobjetos de vidrio. Con cuidado baje el PDMS cuadrado plano sobre el colágeno, lo que garantiza el PDMS es plana contra el PMMA y no hay burbujas atrapadas. Permitir a gel a 37 ° C durante 30 min.
  6. conjunto de dispositivo
    1. Después de la gelificación, añadir una cantidad suficiente PBS alrededor de la pieza PDMS plana sobre la pieza inferior para rodear el PDMS (alrededor de 1 ml). Utilizar pinzas para quitar cualquier correoxcess colágeno alrededor de los bordes, y poco a poco se despegan la pieza PDMS. Añadir más de PBS en la parte superior del colágeno para mantener la hidratación.
    2. Para preparar la pieza superior, utilizar pinzas para recoger la pieza de PMMA superior y darle la vuelta para que el molde de PDMS es en la parte superior. Añadir unas gotas de PBS a la interfaz, a continuación, de forma rápida y firmemente quitar el molde de PDMS de la pieza de PMMA superior.
    3. Retire con cuidado pasadores de acero inoxidable desde el otro lado de la carcasa PMMA utilizando otro par de pinzas. Añadir unas gotas más de PBS sobre el colágeno micropatterned. Voltear la pieza superior de PMMA de manera que el colágeno está orientada hacia abajo y coloque 4 tornillos en los orificios de esquina.
    4. Coloque con cuidado la pieza superior en la parte superior de la pieza inferior, alineando los tornillos con los agujeros de las esquinas de la pieza inferior. No permitir que las dos piezas se deslicen uno contra el otro. Utilice un destornillador para apretar los tornillos con un toque suave. No apriete en exceso.
    5. Aspirar el PBS que rodea las superficies de PMMA y colocar una pequeña piECE de algodón debajo de un borde del dispositivo. Con una pipeta, eliminar cualquier PBS a partir de los embalses y reemplazar con medio de cultivo celular. Deje que el dispositivo gel juntos en una incubadora a 37 ° durante al menos 1 hr.
  7. La siembra de células
    1. Cultivar las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en medio de crecimiento endotelial a 37 ° C (CO2, O2) a una confluencia del 38. Siempre que sea posible, utilice los pasajes entre 4 y 7.
    2. Tripsinizar las células endoteliales mediante el lavado del frasco de cultivo con 6 ml de PBS y añadiendo después 2 ml de tripsina al 0,05% a 37 ° C para disociar las células. Dejar las pilas tripsina hasta que la mayoría de las adhesiones focales han desprendido y las células se redondean hacia arriba (esto suele durar alrededor de 2 - 3 minutos). Detener la reacción de tripsina mediante la adición de 4 ml de medio de crecimiento endotelial que contenía suero bovino fetal (FBS). Lavar el matraz con los medios de comunicación varias veces para asegurar que las células se separaron del matraz y recogeren un tubo cónico.
    3. Contar las células usando un hemocitómetro y resuspender ellos a una densidad de 10 millones de células por ml. Retire todos los medios de cultivo celular a partir de los depósitos de entrada y salida. Utilizando una punta de carga de gel 200 l, añadir 10 l de suspensión de células en el centro de la depósito de entrada. Las células deben comenzar a fluir en la red inmediatamente y la capa de la red.
    4. Añadir 200 l medios de comunicación por igual a ambos depósitos y dejar que las células se unen y se extienden dentro de la red durante al menos 1 hora.
  8. Cultura dispositivo
    1. Cultura del dispositivo con el flujo por gravedad a través de la red mediante la adición de 200 l de medio de cultivo celular al depósito de entrada y de 50 l para el depósito de salida. Con este método de cultivo, sustitución de los medios cada 12 horas para mantener la viabilidad endotelial.
      Nota: Si las condiciones de cultivo de flujo continuo son deseables (para mantener la tensión de corte constante, recoger los medios de comunicación en la salida, etc.) a SYRbomba Inge puede utilizarse en lugar de la cultura por gravedad.
    2. Permitir que las células endoteliales sembradas al menos 24 hr para sujetar y estabilizar antes de la aplicación de flujo continuo. Antes del establecimiento de flujo continuo, mantener los dispositivos con condiciones de flujo por gravedad.
      NOTA: Las condiciones de medios de flujo aplicada difieren de la cultura por gravedad. La adición de un expansor de plasma, tal como dextrano, a los medios estabiliza los microvasos de ingeniería y previene el colapso vascular durante la perfusión sostenida 39.
    3. Para hacer que los medios de comunicación para la configuración de flujo continuo, se disuelven 3,5% de dextrano (70 kDa) en medio de crecimiento endotelial para el cultivo óptimo buque. Utilizando una técnica estéril, llenar jeringas de 10 ml con medio de crecimiento endotelial con 3,5% de dextrano.
    4. Preparar una placa de cultivo estéril para el flujo por fusión de agujeros en la pared lateral de una placa de Petri utilizando un soldador.
    5. Adjuntar 12 "tubo de silicona (1/32" DI) a un acoplamiento de bloqueo Luer (Mujer, 1/16 "ID), y un 1 /16 "conector recto de tubo a tubo con un 1" segmento de tubo en el otro extremo. Introduzca un "aguja roma 20G (individual desde el cubo de la aguja) para el extremo libre de la 1" 1/4 segmento. También hay que preparar un segmento de 3 "de tubo unido a una 90 ° conjunto conector de codo de tubo a tubo (para montarse en la entrada de la caja). En los pasos subsiguientes, el tubo ya se rosca a través del plato preparado y unido a la 3 "segmento a través de la aguja 20 G. tubo de salida debería reflejar tubo de entrada, con un extremo libre en lugar de un acoplamiento de bloqueo Luer. Autoclave todos los segmentos antes de su uso.
    6. Rosca de entrada en autoclave y el tubo de salida a través de agujeros en el plato preparado. Adjuntar 3 segmentos "a internos 20 agujas G. Una el acoplamiento de bloqueo Luer de la jeringa medios llenas y la perfusión de los medios de comunicación a través de la tubería usando la bomba de jeringa fijada en un alto caudal. Asegúrese de que no haya burbujas en el tubo o conectores, ya que éstos impedir el flujo al recipiente.
    7. Insertar el connector conjunta en la entrada de la vivienda. Establecer la bomba de jeringa a la velocidad de flujo deseada y comenzar la perfusión.
      NOTA: Este puede ser ajustado en función de la geometría del vaso y las condiciones experimentales de tensiones tangenciales aplicadas. Para un canal de 100 m de diámetro, con un caudal de 3 l / min funciona bien.
    8. Si se desea, recoger perfundido con tubo de salida dispuesto insertado en un estéril 5 ml de poliestireno tubo de fondo redondo que contiene 500 l de medios de comunicación.
      Nota: Se añade una pequeña cantidad de medios de comunicación para el tubo de recogida para evitar la formación de burbujas que puede bloquear el flujo.
    9. Dependiendo de velocidad de flujo, puede necesitar ser rellenados después de 24 a 36 h de la jeringa. Esto se hace mediante la eliminación del conector de la entrada de la caja, en sustitución de la jeringa, y permitiendo que los medios para perfundir a un alto caudal durante varios minutos. Esta secuencia asegura que las burbujas no se introducen en el tubo. Restablecer la bomba a la velocidad de flujo deseada para la cultura, insertar el conector en la entrada de la caja, yvolver a la incubadora.

Análisis 4. Dispositivo

  1. Análisis de la permeabilidad
    1. Utilice 40 kDa FITC-dextrano para visualizar la permeabilidad del vaso in situ. Coloque la carcasa buque en un microscopio confocal y se centran en el plano del vaso. Añadir 5 M 40 kDa FITC-dextrano para la entrada y la imagen a la magnificación de 4x, 25 mseg tiempo de exposición, y en 1 cuadro por seg para 10 min.
    2. Analizar la serie de imágenes con el código de análisis para estimar la permeabilidad de dextrano a través de la pared del vaso en colágeno (m / seg), basado en un modelo publicado por Zheng et. al. 31.
  2. Análisis y inmunotinción Imagen confocal
    1. Para solucionar los vasos, perfundir con un 3,7% de formaldehído través de la entrada durante 20 minutos y lavar por perfusión de PBS tres veces (20 min por lavado). Bloquear la unión con la albúmina 2% de suero bovino (BSA) y 0,5% de Triton X-100 pe anticuerpo no específicarfused través de la red para 1 hr. Perfundir soluciones de anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C y lavar tres veces con PBS. Perfundir soluciones anticuerpo secundario durante 1 - 2 horas, y lavar de nuevo con PBS de la misma manera.
    2. Tomar imágenes de inmunofluorescencia de microvasos in situ utilizando un microscopio confocal con una z paso de 1 m. La imagen de los microvasos a un aumento de 4X, 10X, 20X o.
      Nota: Ampliación de 4X proporcionará información global de la estructura de la red, mientras 10X y 20X imágenes ampliadas proporcionarán detalles celulares, tales como la elongación, la formación de salida, etc.
    3. Analizar las pilas de imágenes utilizando ImageJ con proyecciones Z (Imagen / / Z-proyecto Pilas), secciones transversales (Imagen / view Pilas / ortogonal), y reconstrucciones en 3D (imagen / Pilas / Proyecto 3D).
  3. Microscopía Electrónica de Barrido Imaging
    1. Para el análisis de microscopía electrónica, corregir in situ mediante la perfusión de fuerza media de Karnovsky solution (2% de glutaraldehído paraformaldehído / 2,5% en tampón cacodilato 0,2 M) durante la noche. Desmontar el recipiente y se separe con cuidado las dos piezas. Recortar los bordes y sumergirse plenamente en la solución fijadora durante varios días.
    2. Sumergir la parte superior de espesor de la embarcación en el 25% de glutaraldehído durante 20 minutos y enjuagar tres veces con PBS (2 min cada uno). Deshidratar en lavados de etanol en serie de 50%, 70%, 85% (2 min cada uno) y de dos lavados en etanol al 100% (5 min cada uno).
    3. Preparar la muestra para el análisis con una mayor deshidratación mediante secado por punto crítico tras el protocolo del fabricante 40. Por pulverización catódica recubrir el recipiente con oro-paladio (7 nm) y analizar bajo el microscopio electrónico de barrido con una tensión de aceleración de 5 kV, tamaño del punto 3.

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Resultados

La plataforma recipiente ingeniería crea microvasculatura funcional incrustado dentro de un tipo natural de colágeno I de la matriz y permite el control ajustado del medio ambiente celular, biofísicas y bioquímicas in vitro. Para fabricar los microvasos de ingeniería, las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) se sometieron a perfusión a través de la red de microfluidos colágeno embebido en donde se unen para formar un lumen de patentes y el endotelio confluen...

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Discusión

Microvasos de ingeniería son un modelo in vitro, donde están presentes y sintonizable características fisiológicas, tales como la geometría luminal, las fuerzas hidrodinámicas, y las interacciones multicelulares. Este tipo de plataforma es de gran alcance, ya que ofrece la posibilidad de modelar y estudiar el comportamiento del endotelio en una variedad de contextos en los que las condiciones de cultivo in vitro en puede ser igualada a la del microambiente en cuestión. Por ejemplo, los mecanismos que i...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer la Lynn y Mike Garvey Laboratorio de Imagen en el Instituto de Células Madre y Medicina Regenerativa, así como el Fondo de Washington nanofabricación de la Universidad de Washington. También reconocen el apoyo financiero del Instituto Nacional de Salud otorga DP2DK102258 (a YZ), y la formación otorga T32EB001650 (a SSK y MAR) y T32HL007312 (MAR).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fabricación de obleasSistema de
plasma AutoGlowAutoGlow
Headway Spin CoaterHeadway Headway Research, Inc PWM32 Recubrimiento giratorio  
Alineador de contacto ABMAB-M
Alpha Step ProfilómetroTencorAlpha Step 200
SU-8 DesarrolladorMicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
Oblea de silicio de 8"Wafer World Inc.
Generador de micropatrones de sobremesaHeidelberg Instrumentsμ PG 101Para la generación de fotomascarillas
Placa calefactoraVWR97042-646
Alcohol ispropílicoAvantor Performance Materiales9088
Placas de Petri (120 x 120 mm, cuadradas)Sigma-AldrichZ617679
Tricloro(3,3-trifluoropropil)silanoSigma-AldrichMKBG3805V
Base de elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curadoDow CorningSylgard 184Mixto a 10:1 (p/p)
Desecador al vacíoSigma-AldrichZ119024-1EA
HornoVWR9120976
Fabricación y cultivo de dispositivos(metacrilato >de metilo) (PMMA)Tratador de plexiglás
CoronaProductos Electrotécnicos, Inc.BD-20Dispositivo portátil para el tratamiento con plasma de dispositivos PMMA y moldes PDMS
Soldador Weller de acero inoxidable WTCPS
McMaster-Carr 91785A096
Pasadores de acero inoxidableMcMaster-Carr 93600A060
Pinzas Miltex24-572Se pueden utilizar pinzas similares
Espátula (Micro Cuchara)Servicios de Microscopía Electrónica62410-01
DestornilladorSe puede utilizar cualquier destornillador de cabeza plana, esterilizado en autoclave
Cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
BleachClorox4460030966
Placas de Petri (150 x 25 mm)Placas dede 430599
(100 x 20 mm)Corning2909
Algodón, cortado en trozos
Polietilemina (PEI)Sigma-AldrichP3143Diluido al 1% en agua de grado de cultivo celular
GlutaraldehídoSigma-AldrichG6257Diluido al 0,1% en agua
de grado de cultivo celularColágeno estéril H2ODI H2O
tipo I, disuelto en ácidoAislado de colas de rata como se describe en Rajan et. al. 2006 (ref #37)
Jeringa de 1 mlBD309659
Jeringa de 10 mlBD309604
tubos cónicos de 15 mlCorning352097
Tubos cónicos de 30 mlCorning352098
M199 10x Media Life Technologies11825-015
1 N NaOH (estéril)Sigma-Aldrich415413Diluido a 1 N en agua de grado de cultivo celular
HUVECsLonza
Medios de crecimiento endotelialLonzaCC-3124
TripsinaCorning25-052-CI
Suero fetal bovino (FBS)Thermofisher Scientific10082147
Dextrano de Leuconostoc spp. (70  kDa)Sigma-Aldrich31390
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Corning21-031-CV
HemocitómetroHausser Scientific Co.3200
Puntas de carga de gelVWR37001-152
Aguja de relleno roma de 18 gBD 305180
20 g Aguja dosificadora de acero inoxidableMcMaster-Carr75165A123
Tygon 1/32" ID, Tubo de silicona de 3/32" de diámetro exteriorCole-ParmerEW-95702-00
Acoplamiento de tubo a tubo de 1/16"McMaster-Carr5116K165
90° Conectores de codo, tubo a tuboMcMaster-Carr5121K901
Acoplamiento Luer Lock (hembra, 1/16" ID)McMaster-Carr51525K211
Pinzas de plástico, con mordazas Servicios demicroscopía electrónica72971
Bomba de jeringa dobleHarvard Apparatus70-4505
5 ml Poliestireno Tubo de fondo redondoFisher Scientific14-959-2A
Device Analysis
FormaldehídoSigma-AldrichF8775
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA8806-5G
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
Conejo anti-hCD31Abcamab324571:25 dilución de trabajo
FITC anticuerpo conjugado anti-von Willebrand FactorAbcamab8822dilución de trabajo 1:100
anticuerpo secundario anti-conejo de cabra 568Thermofisher ScientificA-11011dilución de trabajo 1:100
HoeschtThermofisher ScientificH1399Resuspendido en DMSO
Cacodilato de sodio Sigma-AldrichC0250Para fabricar un tampón de cacodilato de 0,2 M
EtanolVWR InternationalBDH1164-4LP
40 kDa Dextrano conjugado por FITCSigma-AldrichFD40S 
adicionales 
CHIR-99021Selleck ChemS2924Inhibidor de GSK-3 de molécula pequeña
VEGF recombinante humanoPeprotech100-20
bFGF recombinante humanoPeprotechAF-100-18B
Tornillo de máquina ranurado con cabeza de celosía Petri Corning de 1 cm x 3 cm esterilizado en autoclave acético al 0,1%

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