Asistida por láser citoplasmática microinyección en el ganado cigotos

Resumen

Este protocolo muestra cómo realizar la microinyección citoplasmática en cigotos de animales de granja. Esta técnica se puede utilizar para administrar cualquier solución en el embrión de una célula, como herramientas de edición del genoma para generar animales knockout.

Resumen

La microinyección citoplasmática en embriones unicelulares es una técnica muy potente. Por ejemplo, permite la entrega de herramientas de edición del genoma que pueden crear modificaciones genéticas que estarán presentes en cada célula de un organismo adulto. También se puede utilizar para administrar siRNA, mRNAs o anticuerpos bloqueantes para estudiar la función génica en embriones preimplantacionales. La técnica convencional de microinyección de embriones utilizada en roedores consiste en una micropipeta muy fina que penetra directamente en la membrana plasmática cuando se introduce en el embrión. Cuando esta técnica se aplica a los animales de ganado, generalmente resulta en una baja eficiencia. Esto se debe principalmente a que, a diferencia de los ratones y las ratas, los cigotos bovinos, ovinos y porcinos tienen un citoplasma muy oscuro y una membrana plasmática altamente elástica que dificulta la visualización durante la inyección y la penetración de la membrana plasmática. En este protocolo, describimos un método de microinyección adecuado para la administración de soluciones en el citoplasma de cigotos de ganado bovino que ha demostrado ser exitoso también para embriones de ovejas y cerdos. En primer lugar, se utiliza un láser para crear un agujero en la zona pelúcida. A continuación, se introduce una micropipeta de vidrio de extremo romo a través del orificio y se avanza hasta que la punta de la aguja alcanza aproximadamente 3/4 del embrión. Luego, la membrana plasmática se rompe por aspiración del contenido citoplasmático dentro de la aguja. Finalmente, el contenido citoplasmático aspirado seguido de la solución de interés se inyecta de nuevo en el citoplasma embrionario. Este protocolo se ha utilizado con éxito para la administración de diferentes soluciones en cigotos bovinos y ovinos con una eficiencia del 100%, una lisis mínima y tasas de desarrollo de blastocistos normales.

Introducción

microinyección citoplasmática de embriones de 1 célula es una técnica muy poderosa. Puede ser utilizado para la entrega de cualquier solución en el embrión, por ejemplo, producir genes knock-outs para estudiar la función de genes o de genes para generar animales editado. Cigotos de animales de granja agrícolas más relevantes tienen una composición de ácidos grasos muy alto que hace que su citoplasma opacos y oscuros ^1. También tienen una membrana plasmática bastante elásticas (PM). Estas características hacen que la microinyección pronuclear mediante inyección convencional / citoplasmática como se utiliza en especies de roedores difíciles y, a menudo inexactos.

Microinyección citoplasmática tiene ventajas sobre la microinyección pronuclear, ya que es más fácil de realizar y también causa menos daño a los embriones inyectados, resultando en una mayor viabilidad ^2. El objetivo general de este protocolo es demostrar un método exitoso para la entrega de soluciones en el citoplasma de cigotos de animales de granja. Para ser capaz de realizarmicroinyección citoplásmica con una alta eficiencia en embriones de ganado, se utiliza un láser para generar un agujero en la zona pelúcida (ZP) y luego una aguja de vidrio de extremo romo se utiliza para la microinyección. Esta estrategia tiene como objetivo reducir el daño mecánico impreso en el embrión durante la inyección. Entonces, la aspiración del contenido citoplasmático dentro de la aguja de inyección permite la rotura eficiente y seguro de la PM asegurar que la solución se suministra en el citoplasma del embrión.

Esta técnica ya se ha utilizado con éxito en los embriones de bovino para entregar siRNA en el citoplasma cigóticos ^3,4 y para generar mutaciones utilizando las repeticiones agrupadas espaciadas regularmente cortos palindrómicas (CRISPR) / sistema CRISPR asociado 9 sistema ⁵ (Cas9). También es adecuado (con modificaciones menores) para inyectar la especie bovina ovocitos cumulus-cerrado ^6. A continuación, describimos nuestro protocolo de inyección entrega de un medio de contraste, que puede ser aplicable a inyectar cualquier dessolución IRED en el zigoto, y muestran que el uso de esta técnica provoca la lisis mínima y no afecta el desarrollo embrionario temprano.

Protocolo

1. Producción Micropipeta

1. micropipeta de inyección
   1. Colocar un capilar de vidrio de borosilicato (diámetro externo (OD): 1,0 mm, diámetro interior (ID): 0,75 mm) en un extractor de micropipeta (en el centro de los titulares de derechos y capilares izquierda) y bloquearla.
   2. Utilice un programa apropiado para tirar del capilar de vidrio por lo que se traduce en una punta fina con una larga Tapper. (Ejemplo: Calor: 825; Tire: 30; Velocidad: 120; Tiempo: 200; Presión: 500).
   3. Retirar con cuidado las pipetas tirados desde el dispositivo y colocarlo en un microforge en una posición horizontal.
   4. Llevar la pipeta accionada y el filamento calefactor microforge con su cuenta de vidrio en el foco. Utilice la retícula ocular para medir el espesor deseado y mover la pipeta horizontalmente hasta que el filamento calentador alcanza el diámetro interior de destino (5 micras).
   5. Ajustar el calor a aproximadamente 45% y llevar suavemente la pipeta hacia abajo de manera que toque el filamento. Activar el calentador brevemente. esta wenfermo ligeramente fundir la pipeta por lo que se adhiere al filamento y tras el enfriamiento, la pipeta se romperá en el punto de contacto la generación de un corte recto.
      Nota: Ajuste de la temperatura adecuada es clave en este paso ya que las temperaturas demasiado altas harán que la curva de la pipeta y por lo tanto un corte recto no serán posibles y las temperaturas demasiado bajas no serán suficientes para fundir la pipeta (Figura 1A).
   6. Hacer un aproximado ángulo de 30 °, cerca de la punta de la pipeta al colocarla cerca de 10 m de distancia del filamento calefactor. Ajuste la temperatura a 60% y activar el calentador.
      Nota: Esto doblar la pipeta sobre el filamento. Se desea Este ángulo de modo que la punta de la aguja es paralela a la superficie de la placa de inyección cuando está montado en el inyector (Figura 1B).
   7. Manejar pipetas de microinyección con precaución, ya que son muy afiladas y frágil.
2. sosteniendo micropipeta
   1. Coloque una borosiliccomió capilar de vidrio (diámetro exterior: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) en un extractor de micropipeta (en el centro de los titulares de derechos y capilares izquierda) y bloquearlo.
   2. Utilice un programa apropiado para tirar del capilar de vidrio por lo que se traduce en una punta fina con una larga incluso estrecharse y paredes paralelas (Ejemplo: Calor: 815; Tire: 20; Velocidad: 140; Tiempo: 175; Presión: 200).
   3. Retirar con cuidado la pipeta retirado del dispositivo extractor y colocarlo en el soporte microforge en una posición horizontal. Ajuste el enfoque en el filamento calefactor y pipeta.
   4. Utilice la retícula ocular para medir el diámetro de la pipeta y mover la pipeta hasta que su diámetro por encima del filamento llega a 180 micras.
   5. En el tamaño indicado, marcar el capilar de vidrio con una pluma de punta de diamante, y luego presione suavemente en la punta tirado para romper el vidrio. Esto debe resultar en un corte recto (Figura 1C).
   6. Mover la pipeta a una posición vertical con su punta cerca del filamento. Ajuste la temperatura de la microforge a 60%.
   7. Fuego esmalte de la punta de la pipeta usando técnicas estándar ⁷ hasta que alcanza una ID de 40 micras. Utilice la retícula ocular para comprobar el ID (Figura 1D).
   8. Hacer un ángulo de la pipeta.
      1. Llevar la pipeta de vuelta a una posición horizontal sobre 10 m de distancia del filamento y 5 mm de distancia de la punta. Ajustar la temperatura a aproximadamente 60% y activar el calentador para doblar la pipeta sobre el filamento. Continuar calentando hasta que se alcanza un ángulo deseado (de alrededor de 30 ^o). Compruebe el ángulo visual (Figura 1E).
         Nota: La pipeta se monta generalmente a la microinyector en un ángulo aproximado de 60 ^o con respecto a la parte inferior de la placa de inyección. La punta de la pipeta se dobla de modo que es paralelo al fondo de la placa, que es necesaria para la inyección correcta del embrión en su plano medio.

Le "> 2. Configuración Micromanipulador

1. Compruebe que los microinyectores están completamente cargados con aceite y que no haya burbujas de aire en el sistema (burbujas en el microinyector impiden un control preciso de la inyección).
2. Compruebe que los micromanipulador están en la posición central. Esto permitirá una amplia gama de movimiento de las pipetas.
3. Inserte la pipeta en el soporte que sostiene micromanipulador izquierda y la pipeta de inyección en el soporte de micromanipulación derecha.
4. Deje que el aceite entre en las pipetas por capilaridad y comprobar que el sistema está funcionando correctamente moviendo el petróleo hacia arriba y abajo dentro de la pipeta usando los controles microinyector.
   Nota: Si no hay circulación de aceite en el interior de las agujas, puede haber una obstrucción. En este caso, utilice una aguja nueva.
5. Utilice los controles micromanipulador para traer las pipetas en el centro del campo de visión del microscopio. El uso de magnificación 4X, comprobar que las puntas de micropipeta están en el ángulo correcto (pan paralelo a la parte inferior del plato).
   Nota: Una configuración correcta de las agujas es clave para una inyección de éxito y los resultados consistencia.
6. Calibrar el sistema láser siguiente manual de calibración del fabricante.

3. Preparación de plato de la inyección (Figura 2)

1. Coloque una gota 50 l de calentado (37 ° C) SOF-HEPES (composición se detalla en la sección de materiales) suplementado con suero de 20% de bovino fetal (FBS) en el centro de la tapa de un 100 mm placa de Petri. Colocar un 1 - drop l 2 de la solución a inyectar cerca de la caída de la inyección. Asegúrese de que los embriones no se enfría por debajo de la temperatura ambiente.
   Nota: En este protocolo vamos a añadir el colorante rojo-dextrano a la solución de inyección para poder visualizar el sitio de la inyección y hacer un seguimiento posterior.
2. Cubrir las gotas en la placa de inyección utilizando aproximadamente 10 ml de aceite mineral.
3. Coloque el plato de inyección en la platina del microscopio invertido y llevar el PIPETTES en la gota de inyección. Compruebe que las agujas están en foco dentro de la gota. Ajustar su altura, según sea necesario utilizando los controles micromanipulador.
4. El uso de un microdispensador, cargar sobre 20-30 cigotos (17 a 20 horas después de la fecundación (HPF)) en el lado superior de la caída de la inyección. Realizar inyección a temperatura ambiente por lo que el número de embriones en la caída de la inyección se determina por la velocidad a la que la persona puede inyectar ellos. No cargue más embriones que los que se pueden inyectar en 30 min.
   1. Para cargar los embriones en el microdispensador, presione el émbolo completamente y sumerja la punta en la solución que contiene los embriones. Tocar los embriones para ser recogidos con la punta del capilar de vidrio (uno a la vez) y liberan lentamente el émbolo para cada embrión entra en el capilar. Repita esto hasta que todos los embriones son recogidos o la capacidad microdispensador está llena.
   2. Para liberar los embriones cargados, presione el émbolo suavemente hasta que todo el volumen de containing los embriones se libera del capilar.

4. La microinyección

1. Usando el objetivo 4X, cargar la solución que se inyecta en la pipeta de inyección mediante la aplicación de presión negativa (aspiración). Cargar solución suficiente para inyectar 2 - 3 cigotos. A continuación, pasar a la caída de la inyección.
2. Dentro de la caída de la inyección, mover la pipeta que sostiene que la punta se acerca a un cigoto. Aplicar presión negativa (aspirado) con el microinyector de retención por lo que el cigoto se fija a la pipeta de sujeción y el cambio a un objetivo de 20X.
3. Una vez que el cigoto se une a la pipeta de sujeción, comprobar su calidad usando la pipeta de inyección para mover suavemente el embrión alrededor sin separarlo. Un cigoto buena calidad debe tener los dos cuerpos polares (aunque a veces solamente se ve) y un citoplasma homogéneo. No se inyecte cigotos anormales (Figura 3A).
4. Si es necesario, vuelva a colocar el embrión para una inyección adecuadaubicación. Un buen posicionamiento sería aquel en el que hay algo de espacio entre la ZP y la PM, por lo que la PM no se dañe por el láser.
5. Compruebe que la pipeta de inyección se coloca en plano medio del embrión tocando con suavidad el cigoto en el sitio de la inyección. Si no está en su plano medio, la aguja tenderá a hacer girar el embrión en lugar de la punción. Ajuste la altura de la pipeta de inyección según sea necesario.
6. Hacer un agujero en la ZP utilizando un láser (Figura 3B).
   1. El uso de software lugar del láser el retículo láser en el ZP donde se hará el agujero (en el lado opuesto a donde el embrión está unido a la pipeta de sujeción). Uso de la ventana de control del láser, haga clic en el botón de disparo. Asegúrese de que el tamaño del agujero es lo suficientemente grande para crear una abertura en la ZP para la aguja de pasar a través sin dañar el PM (Ejemplo: 0,662 mseg de ancho de impulso / 6,9 m Tamaño del agujero).
7. Pasar la aguja de inyeccióna través del agujero en la ZP y hacer contacto con la PM. Continúe empujando la pipeta hacia adelante hasta que la aguja es ¾ de la forma en el embrión (Figura 3C).
8. Observe la posición del menisco en la interfase solución de aceite, ya que esto puede utilizar para controlar constantemente el volumen de inyección.
9. Aplicar presión negativa (aspirado) en la pipeta de inyección, lo que resultará en PM y el citoplasma se aspiran en la aguja de inyección. Continuar hasta que el movimiento de citoplasma en la aguja acelera o cuando el contenido de citoplasma mezclar con una solución de inyección puede ser visto. Estos indicarán la rotura de la PM (Figura 3D).
10. Inyectar de nuevo el contenido citoplasmático, seguido de la solución en el citoplasma del cigoto mediante la aplicación de presión positiva (inyección), hasta que el menisco en la interfase solución de aceite ha avanzado diámetro equivalente de un cigoto pasado el punto de partida.
    Nota: Bajo nuestras condiciones, esto representa aproximadamente 7 pl de solución inyectada (Figura 3E).
11. Cambio a un objetivo 4X y mover el inyectado embrión / s para el lado inferior de la caída de la inyección. Liberar el embrión mediante la aplicación de presión positiva en el microinyector explotación. Mantener los embriones no inyectados en el lado superior y los inyectados que están en el lado inferior de la gota para ayudar a mantener un registro de los embriones inyectados / no-inyectada y trabajar de manera eficiente.

5. Recuperación de embriones y la inyección Resultados

1. Haga 3 gotas de aproximadamente 200 l en un nuevo plato con pre-calentado SOF-HEPES. Recoger los embriones inyectados usando un microdispensador (como se describe más arriba). Lavar los embriones inyectados moviéndolos a través de la SOF 3-HEPES gotas.
2. Contar los embriones lisadas durante la microinyección y desecharlos.
   Nota: Un cigoto se lisaron puede distinguirse fácilmente de uno intacto desde el primero aparece translúcida, llene toda la ZP, y por lo general tiene citoplasmáticacontenido de fugas hacia el exterior del embrión.
3. Opcionalmente, comprobar la eficacia de microinyección usando un microscopio de fluorescencia. Tenga en cuenta que la exposición a la luz UV puede provocar daños de embriones que pueden afectar el desarrollo posterior.
4. Grupos de cultivo de 25 embriones inyectados en 50 gotas l de medio de optimización simplex de potasio (KSOM) suplementado con 4 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) bajo aceite mineral en 38,5 ° C, 5% de _CO2 en aire, y humedad de saturación.
5. Complementar los medios de cultivo con 5% de SFB dos días después de la inyección.
6. Compruebe blastocisto (BL) las tasas de 7 días después de la inyección. Calcular las tasas de BL como el número total de embriones de blastocisto / número total de embriones cultivados en esa gota.

Resultados

Asistida por láser microinyección citoplásmica es un protocolo potente y fiable para ofrecer soluciones en el citoplasma de cigotos de ganado. La figura 3 muestra un esquema general de los cigotos antes y después de la inyección, así como el esquema general de la técnica. Dextrano-rojo se utiliza como solución de la inyección para permitir sitio de seguimiento de la eficiencia y la precisión de la inyección y la inyección. El éxito de la entrega de la solución se ilustra...

Discusión

La microinyección de cigotos es un método bien establecido para la introducción de soluciones en embriones de mamíferos. Con algunas variaciones dependientes de la especie y el objetivo del experimento, esta técnica se puede utilizar ampliamente. Mostramos cómo realizar la microinyección intracitoplasmática de usar un láser para ayudar a la entrada de una micropipeta de extremos romos. Los cigotos de algunas especies de ganado (tales como ganado vacuno, ovejas y cerdos) tienen un citoplasma oscuro, dificultando la visua...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Extractor de micropipetas	Sutter Instrument	P-97
Capilar de vidrio	Sutter instruments	B100-75-10	Estos capilares se utilizan para fabricar las pipetas de sujeción e inyección. Se puede utilizar cualquier tubo de borosilicato de pared gruesa/estándar sin filamento.
Microforge	Narishige	MF-9	Equipado con lente de aumento de 10X.
Micromanipulador	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Microscopio invertido	Nikon	TE2000-U	Equipado con lentes 4X, 20X y con un sistema láser.
Instrumentos	investigación	7-47-500	Saturno 5 Láser activo.
Microdispensador	Drummond	3-000-105	El microdosificador se utiliza para mover los embriones. También se puede utilizar una pipeta p10 pero cargando el mínimo volumen posible.
Plato de cultivo de 100 x 15 mm	Falcon	351029	Utilice la tapa del plato para hacer la placa de inyección, ya que tienen paredes más bajas y facilitarán el posicionamiento y movimiento del micromanipulador. También se puede utilizar la tapa de una placa de cultivo de 60 mm.
Placa de cultivo de 35 mm	Corning	430165	Estas placas se utilizan para cultivar los embriones en 50 μ l gotas cubiertas con aceite mineral. Alternativamente, también se puede usar un plato de 4 pocillos. Independientemente de la placa elegida para cultivar los embriones, siempre deben equilibrarse en la incubadora durante al menos 4 horas antes de transferirles los embriones.
Incubadora	Sanyo	MCO-19AIC	Cualquier incubadora que se pueda configurar a 38.5 ° C, se pueden utilizar condiciones de CO2 de CO.
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ800	Se utiliza para visualizar los embriones en las gotas de cultivo y durante los lavados. Se puede utilizar cualquier microscopio estereoscópico con un aumento de 10X.
Unidad de control HT	Minitube	12055/0400	Sistema de calefacción acoplado al microscopio estereoscópico.
Plato de microscopio calefactado	Minitube	12055/0003	Sistema de calefacción acoplado al microscopio estereoscópico.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Se utiliza una solución estéril de 10 mg/ml para inyectar.
Aceite mineral	sigma	M8410	Mantenga el aceite mineral a temperatura ambiente y protéjalo de la luz con papel de aluminio.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Suplementado con 4 mg/ml de BSA. Las placas KSOM para el cultivo de embriones deben equilibrarse en una incubadora durante al menos 4 horas antes de su uso.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Utilice un FBS calificado para células madre.
Cigotos	Los cigotos se inyectan de 17 a 20 hpf y pueden derivarse in vitro- o in-vivo.
NaCl	Sigma	S5886	Concentración final: 107,7 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
KCl	Sigma	P5405	Concentración final: 7.16 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
KH2PO4	Sigma	P5655	Concentración final: 1,19 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Concentración final: 0,49 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
DL-lactato de sodio	Sigma	L4263	Concentración final: 5,3 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Concentración final: 1.71 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
D-(&menos;)-Fructosa	Sigma	F3510	Concentración final: 0,5 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
HEPES	Sigma	H4034	Concentración final: 21 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Concentración final: 1x. Componente del medio SOF-HEPES.
BME-EAA	Sigma	B6766	Concentración final: 1x. Componente del medio SOF-HEPES.
NaHCO3	Sigma	S5761 Concentración	final: 4 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
Piruvato de sodio	Sigma	P4562	Concentración final: 0,33 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
Glutamax	Gibco	35050	Concentración final: 1 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
BSA	Sigma	A-3311	Concentración final: 1 mg/ml. Componente del medio SOF-HEPES.
Gentamicina	Sigma	G-1397	Concentración final: 5 μ g/ml. Componente del medio SOF-HEPES.
Agua para transferencia embrionaria	Sigma	W1503	Componente del medio SOF-HEPES.
Medio SOF-HEPES	Hecho en el laboratorio		pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filtro esterilizado a través de un 22 μ El filtro M se puede almacenar en la nevera a 4 ° C. C durante 1 mes. Cálido en 37 ° C Baño de agua antes de usar.

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