Asistida por láser citoplasmática microinyección en el ganado cigotos

Summary

Este protocolo muestra cómo realizar la microinyección citoplasmática en cigotos de animales de granja. Esta técnica se puede utilizar para administrar cualquier solución en el embrión de una célula, como herramientas de edición del genoma para generar animales knockout.

Abstract

La microinyección citoplasmática en embriones unicelulares es una técnica muy potente. Por ejemplo, permite la entrega de herramientas de edición del genoma que pueden crear modificaciones genéticas que estarán presentes en cada célula de un organismo adulto. También se puede utilizar para administrar siRNA, mRNAs o anticuerpos bloqueantes para estudiar la función génica en embriones preimplantacionales. La técnica convencional de microinyección de embriones utilizada en roedores consiste en una micropipeta muy fina que penetra directamente en la membrana plasmática cuando se introduce en el embrión. Cuando esta técnica se aplica a los animales de ganado, generalmente resulta en una baja eficiencia. Esto se debe principalmente a que, a diferencia de los ratones y las ratas, los cigotos bovinos, ovinos y porcinos tienen un citoplasma muy oscuro y una membrana plasmática altamente elástica que dificulta la visualización durante la inyección y la penetración de la membrana plasmática. En este protocolo, describimos un método de microinyección adecuado para la administración de soluciones en el citoplasma de cigotos de ganado bovino que ha demostrado ser exitoso también para embriones de ovejas y cerdos. En primer lugar, se utiliza un láser para crear un agujero en la zona pelúcida. A continuación, se introduce una micropipeta de vidrio de extremo romo a través del orificio y se avanza hasta que la punta de la aguja alcanza aproximadamente 3/4 del embrión. Luego, la membrana plasmática se rompe por aspiración del contenido citoplasmático dentro de la aguja. Finalmente, el contenido citoplasmático aspirado seguido de la solución de interés se inyecta de nuevo en el citoplasma embrionario. Este protocolo se ha utilizado con éxito para la administración de diferentes soluciones en cigotos bovinos y ovinos con una eficiencia del 100%, una lisis mínima y tasas de desarrollo de blastocistos normales.

Introduction

microinyección citoplasmática de embriones de 1 célula es una técnica muy poderosa. Puede ser utilizado para la entrega de cualquier solución en el embrión, por ejemplo, producir genes knock-outs para estudiar la función de genes o de genes para generar animales editado. Cigotos de animales de granja agrícolas más relevantes tienen una composición de ácidos grasos muy alto que hace que su citoplasma opacos y oscuros ^1. También tienen una membrana plasmática bastante elásticas (PM). Estas características hacen que la microinyección pronuclear mediante inyección convencional / citoplasmática como se utiliza en especies de roedores difíciles y, a menudo inexa....

Protocol

1. Producción Micropipeta

1. micropipeta de inyección
   1. Colocar un capilar de vidrio de borosilicato (diámetro externo (OD): 1,0 mm, diámetro interior (ID): 0,75 mm) en un extractor de micropipeta (en el centro de los titulares de derechos y capilares izquierda) y bloquearla.
   2. Utilice un programa apropiado para tirar del capilar de vidrio por lo que se traduce en una punta fina con una larga Tapper. (Ejemplo: Calor: 825; Tire: 30; Velocidad: 120; Tiempo: 200; Presión: 500).
   3. Retirar con cuidado las pipetas tirados desde el dispositivo y colocarlo en un microforge en una posición horizontal.
   4. Llevar la pipeta accionada y el fi....

Results

Asistida por láser microinyección citoplásmica es un protocolo potente y fiable para ofrecer soluciones en el citoplasma de cigotos de ganado. La figura 3 muestra un esquema general de los cigotos antes y después de la inyección, así como el esquema general de la técnica. Dextrano-rojo se utiliza como solución de la inyección para permitir sitio de seguimiento de la eficiencia y la precisión de la inyección y la inyección. El éxito de la entrega de la solución se ilustra.......

Discussion

La microinyección de cigotos es un método bien establecido para la introducción de soluciones en embriones de mamíferos. Con algunas variaciones dependientes de la especie y el objetivo del experimento, esta técnica se puede utilizar ampliamente. Mostramos cómo realizar la microinyección intracitoplasmática de usar un láser para ayudar a la entrada de una micropipeta de extremos romos. Los cigotos de algunas especies de ganado (tales como ganado vacuno, ovejas y cerdos) tienen un citoplasma oscuro, dificultando la visua.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extractor de micropipetas	Sutter Instrument	P-97
Capilar de vidrio	Sutter instruments	B100-75-10	Estos capilares se utilizan para fabricar las pipetas de sujeción e inyección. Se puede utilizar cualquier tubo de borosilicato de pared gruesa/estándar sin filamento.
Microforge	Narishige	MF-9	Equipado con lente de aumento de 10X.
Micromanipulador	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Microscopio invertido	Nikon	TE2000-U	Equipado con lentes 4X, 20X y con un sistema láser.
Instrumentos	investigación	7-47-500	Saturno 5 Láser activo.
Microdispensador	Drummond	3-000-105	El microdosificador se utiliza para mover los embriones. También se puede utilizar una pipeta p10 pero cargando el mínimo volumen posible.
Plato de cultivo de 100 x 15 mm	Falcon	351029	Utilice la tapa del plato para hacer la placa de inyección, ya que tienen paredes más bajas y facilitarán el posicionamiento y movimiento del micromanipulador. También se puede utilizar la tapa de una placa de cultivo de 60 mm.
Placa de cultivo de 35 mm	Corning	430165	Estas placas se utilizan para cultivar los embriones en 50 μ l gotas cubiertas con aceite mineral. Alternativamente, también se puede usar un plato de 4 pocillos. Independientemente de la placa elegida para cultivar los embriones, siempre deben equilibrarse en la incubadora durante al menos 4 horas antes de transferirles los embriones.
Incubadora	Sanyo	MCO-19AIC	Cualquier incubadora que se pueda configurar a 38.5 ° C, se pueden utilizar condiciones de CO2 de CO.
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ800	Se utiliza para visualizar los embriones en las gotas de cultivo y durante los lavados. Se puede utilizar cualquier microscopio estereoscópico con un aumento de 10X.
Unidad de control HT	Minitube	12055/0400	Sistema de calefacción acoplado al microscopio estereoscópico.
Plato de microscopio calefactado	Minitube	12055/0003	Sistema de calefacción acoplado al microscopio estereoscópico.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Se utiliza una solución estéril de 10 mg/ml para inyectar.
Aceite mineral	sigma	M8410	Mantenga el aceite mineral a temperatura ambiente y protéjalo de la luz con papel de aluminio.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Suplementado con 4 mg/ml de BSA. Las placas KSOM para el cultivo de embriones deben equilibrarse en una incubadora durante al menos 4 horas antes de su uso.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Utilice un FBS calificado para células madre.
Cigotos	Los cigotos se inyectan de 17 a 20 hpf y pueden derivarse in vitro- o in-vivo.
NaCl	Sigma	S5886	Concentración final: 107,7 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
KCl	Sigma	P5405	Concentración final: 7.16 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
KH2PO4	Sigma	P5655	Concentración final: 1,19 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Concentración final: 0,49 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
DL-lactato de sodio	Sigma	L4263	Concentración final: 5,3 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Concentración final: 1.71 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
D-(&menos;)-Fructosa	Sigma	F3510	Concentración final: 0,5 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
HEPES	Sigma	H4034	Concentración final: 21 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Concentración final: 1x. Componente del medio SOF-HEPES.
BME-EAA	Sigma	B6766	Concentración final: 1x. Componente del medio SOF-HEPES.
NaHCO3	Sigma	S5761 Concentración	final: 4 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
Piruvato de sodio	Sigma	P4562	Concentración final: 0,33 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
Glutamax	Gibco	35050	Concentración final: 1 mM. Componente del medio SOF-HEPES.
BSA	Sigma	A-3311	Concentración final: 1 mg/ml. Componente del medio SOF-HEPES.
Gentamicina	Sigma	G-1397	Concentración final: 5 μ g/ml. Componente del medio SOF-HEPES.
Agua para transferencia embrionaria	Sigma	W1503	Componente del medio SOF-HEPES.
Medio SOF-HEPES	Hecho en el laboratorio		pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filtro esterilizado a través de un 22 μ El filtro M se puede almacenar en la nevera a 4 ° C. C durante 1 mes. Cálido en 37 ° C Baño de agua antes de usar.