De alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology de tejidos mineralizados

Nathaniel A. Dyment; Xi Jiang; Li Chen; Seung-Hyun Hong; Douglas J. Adams; Cheryl Ackert-Bicknell; Dong-Guk Shin; David W. Rowe

doi:10.3791/54468

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

De alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology de tejidos mineralizados

16K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/54468

⸱

14 de septiembre de 2016

Nathaniel A. Dyment¹ , Xi Jiang¹ , Li Chen¹ , Seung-Hyun Hong² , Douglas J. Adams³ , Cheryl Ackert-Bicknell⁴ , Dong-Guk Shin² , David W. Rowe¹

¹Department of Reconstructive Sciences, University of Connecticut Health Center, ²Department of Computer Science and Engineering, University of Connecticut, ³Department of Orthopaedic Surgery, University of Connecticut Health Center, ⁴Department of Orthopaedics, University of Rochester

En este artículo

Resumen

En este manuscrito, presentamos una plataforma de criohistología semiautomatizada de alto rendimiento para producir imágenes compuestas alineadas de múltiples medidas de respuesta a partir de varias rondas de imágenes fluorescentes en secciones congeladas de tejidos mineralizados.

Resumen

Existe una necesidad creciente de fenotipado e histopatología eficientes de una variedad de tejidos. Esta necesidad de fenotipado es evidente con los ambiciosos proyectos para alterar todos los genes del genoma del ratón. La comunidad investigadora necesita medios rápidos y baratos para fenotipar los tejidos a través de la histología. Los análisis histológicos de los tejidos esqueléticos suelen llevar mucho tiempo y, en el mejor de los casos, son semicuantitativos, y suelen requerir la interpretación subjetiva de los portaobjetos por parte de personas entrenadas. Aquí, presentamos un paradigma criohistológico para el fenotipado eficiente y económico de tejidos mineralizados. En primer lugar, presentamos un método novedoso de criosección estabilizado con cinta que preserva la morfología de los tejidos mineralizados. A continuación, estas secciones se adhieren rígidamente a portaobjetos de vidrio y se obtienen imágenes repetidamente durante varias rondas de tinción. A continuación, las imágenes resultantes se alinean manualmente o mediante un software informático para producir pilas compuestas de varias imágenes en capas. El protocolo permite la colocalización de numerosas señales moleculares a células específicas dentro de una sección determinada. Además, estas señales fluorescentes se pueden cuantificar de forma objetiva a través de programas informáticos. Este protocolo supera muchas de las deficiencias asociadas con la histología de los tejidos mineralizados y puede servir como plataforma para el fenotipado de alto rendimiento y alto contenido de los tejidos musculoesqueléticos en el futuro.

Introducción

La investigación biológica requiere a menudo fenotipificación eficiente, lo que con frecuencia se asocia con algún tipo de análisis histológico ^1-3. Esta necesidad es aún más evidente con los ambiciosos proyectos para interrumpir cada gen en el genoma del ratón ^4. Estos análisis histológicos pueden variar desde la evaluación de la morfología celular y / o características anatómicas a la expresión de mapeo de genes específicos o proteínas a las células individuales. De hecho, una de las contribuciones fundamentales de la histología en el campo de la genómica es la posibilidad de asociar una señal molecular específica a una región o célula tipo es....