"Fagosoma Cierre de ensayo" para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

La fagocitosis es un función de la célula importante que comienza con el reconocimiento y la unión de material a receptores de superficie, que entonces conduce a la internalización y la degradación del material ingerido. Mientras que los eucariotas unicelulares, como el moho Dictyostelium discoideum amebas y utilizan para la alimentación de la fagocitosis de las bacterias, organismos superiores han evolucionado con células profesionales. Los macrófagos o células dendríticas son la primera línea de defensa contra los patógenos en diversos tejidos y órganos, y son cruciales para activar el sistema inmune adaptativo a través de la presentación de antígenos y la producción de citoquinas ^1-4. Bajo ciertas circunstancias fagocitosis se puede realizar por las células fagocíticas no profesionales, por ejemplo, células endoteliales y epiteliales. Este proceso es importante para mantener la homeostasis durante el desarrollo y en la edad adulta para recambio de tejido normal y de remodelación. fagocitos Por último, especializadas tales como células de Sertoli en los testículos o de la retinacélulas epiteliales pigmentarias son extremadamente potentes fagocitos ^5.

La formación de un fagosoma donde la degradación de microorganismos o restos celulares se produce comienza con la agrupación de receptores fagocíticas en la superficie de la célula fagocítica. los eventos de señalización siguientes agrupación de receptores opsónicos tales como receptores de Fc (FcR) o receptores del complemento (CRS) han sido bien caracterizados. Sin embargo, también hay numerosos receptores no opsónicos incluyendo los receptores tipo Toll (TLRs), lectinas, receptores de manosa y receptores scavenger. Estos receptores reconocen determinantes en la superficie de las partículas tales como manosa o fucosa residuos, la fosfatidilserina, y lipopolisacáridos ^1,6-9.

reconocimiento de patógenos o restos de células implica la unión a y la agrupación de varios tipos de receptor fagocítico, que luego conducen a la intensa y transitoria remodelación de actina. En paralelo exocitosis, focal de compartmen intracelularts contribuye a la liberación de tensión de la membrana y es importante para la fagocitosis eficaz de partículas grandes. Los eventos de señalización que conducen a la actina polimerización y la deformación de la membrana fueron disecados en modelos experimentales que han activado un único receptor de fagocitosis. Durante la fagocitosis mediada por FcR, hay una intensa polimerización de actina que se rige por las pequeñas GTPasas (Rac, Cdc42). Entre sus efectores, la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) conduce a la activación de la proteína actina-Related 2/3 compleja (Arp2 / 3) que nuclea los filamentos de actina ^1,2,4,10. La producción local de, 5-bisfosfato (PI (4,5) _P2) fosfatidilinositol-4 es crucial para la polimerización de actina inicial que impulsa la formación de pseudópodos. Se requiere su conversión a PI (3,4,5) P ₃ para la extensión de pseudópodos y el cierre fagosoma ^11. Varias vías contribuyen a la desaparición de PI (4,5) P _2. En primer lugar el desprendimiento de Kina fosfato fosfatidilinositolses (PIPKIs) del PI detenciones fagosoma (4,5) _P2 síntesis. En segundo lugar, puede ser fosforilada y consumida por la clase I PI3K quinasas (PI3K) y convertido en PI (3,4,5) P ₃ ^12. El papel de las fosfatasas y fosfolipasas también se ha implicado en el PI (4,5) _P2 hidrólisis y eliminación de F-actina durante la fagocitosis en células de mamíferos y en Dictyostelium ^13,14. La fosfolipasa C (PLC) δ hidroliza PI (4,5) P ₂ en diacilglicerol y fosfato de tris inositol-1,4,5-. El OCRL fosfatasa PI (4,5) P ₂ y PI (3,4,5) P ₃ (síndrome oculocerebrorenal de Lowe) también ha sido implicado en la formación de fagosoma. formación local precisa de F-actina y su despolimerización está estrechamente regulada en el espacio y el tiempo y hemos demostrado que el reclutamiento de los compartimentos intracelulares es importante entregar localmente la fosfatasa OCRL, contribuyendo así a la despolimerización de la actina local en la base de la copa de fagocitosis

El mecanismo y moleculares jugadores necesarios para el cierre fagosoma y escisión de la membrana aún bien definidos debido a las dificultades en la visualización y el control de la sede de cierre fagosoma. Hasta hace poco, se observó fagocitosis en células fijadas o que viven que internalizan las partículas en su cara dorsal o en sus lados, por lo que la visualización oportuna del sitio de cierre fagosoma difícil. Además, los métodos de fijación pueden provocar la retracción de las membranas y el sesgo de los resultados sobre la extensión de pseudópodos y cierre. Por el contrario, el ensayo que hemos establecido y describir aquí nos permite visualizar la extensión de pseudópodos y la etapa de cierre de la fagocitosis en células vivas ^13, basado en microscopía de reflexión interna total (TIRFM) ^16. Esta técnica óptico utiliza una onda evanescente para excitar fluoróforos en un área delgada en la interfaz entre un modo transparentetapa (cubreobjetos) y un (medio de cultivo celular) de líquido. El grosor de la profundidad de excitación es de alrededor de 100 nm desde la superficie sólida, que permite la visualización de los eventos moleculares cerca de la membrana plasmática. TIRFM permite una alta relación de señal a fondo, y limita la fluorescencia fuera de foco recogido y la citotoxicidad debido a la iluminación de las células.

Aprovechando TIRFM, desarrollamos el "ensayo de cierre fagosoma" en el que los cubreobjetos se activan con poli-lisina y luego recubiertas con células rojas de la sangre opsonizadas-IgG (IgG-SRBC). Los macrófagos que expresan proteínas transitoriamente marcado con fluorescencia de interés se dejan engullir las IgG-SRBC. Mientras que las células se separan las partículas objetivo que están no covalentemente unido a la superficie del vidrio, las puntas de los seudópodos pueden ser observados y registrados en el modo de TIRF. adquisiciones TIRF se combinan con adquisiciones en el modo de epifluorescencia, después de cambiar la etapa 3 m por encima, lo que permite la visualization de la base de la copa de fagocitosis. La adición de fármacos farmacológicos tales como los que la inhibición de la actina o dynamin durante el proceso también es posible diseccionar más el proceso a nivel molecular.

El protocolo se describe en detalle aquí es de una línea celular de macrófagos murinos RAW264.7 y partículas opsonizadas, pero prácticamente, puede ser adaptado a cualquier otra célula fagocítica y con otros objetivos tales como perlas. Este método permitirá una mejor caracterización de la regulación en el tiempo y en el espacio de los jugadores moleculares implicados en la extensión de pseudópodos y el cierre fagosoma durante varios procesos de fagocíticas.

Nota: El plásmido utilizado Lifeact-mCherry es una especie de regalo del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, París, generada tras ^17.

1. Células y transfección

Nota: los macrófagos RAW264.7 se cultivan a sub confluencia en medio completo (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 50 mM β-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina y 10% de FCS ( fetal Calf Serum)) en una placa de 100 mm. Ellos son transfectadas con plásmidos que codifican las proteínas etiquetadas con fluorescencia mediante electroporación. Rutinariamente aproximadamente 5-6 x 10 ⁶ células se transfectaron con 20 g o 10 g de plásmido para cada transfección o co-transfección respectivamente. Tenga en cuenta que otros medios de transfección basados ​​en la electroporación o lipofección se pueden utilizar como enfoques alternativos.

1. Raspar las células con un levantador de células y volver a suspender en 10 ml de medio de cultivo pipeteando arriba y abajo varias veces.
2. Centrifugar lasuspensión celular 300 xg, 5 min a temperatura ambiente en el rotor de ángulo de balanceo.
3. Precalentar 10 ml de medio completo suplementado con 10 g / ml de gentamicina a 37 ° C.
4. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 3 ml de "tampón de lavado A" del kit de la electroporación.
5. Centrifugar la suspensión de células 300 xg, 5 min a temperatura ambiente en rotor de ángulo de balanceo.
6. Mientras tanto preparar la mezcla de ADN a temperatura ambiente: 120 l 2x tampón B, 20 g de ADN plasmídico que codifica la proteína de interés, csp 240 l _{de H2O}
7. Después de la centrifugación, desechar todo el sobrenadante.
8. Resuspender el sedimento celular en la mezcla de ADN y la transferencia en cubetas de electroporación de 4 mm.
9. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min.
10. Electroporate a 250 V, 900 mF.
11. Inmediatamente resuspender las células en el pre-calentado (37 ° C) medio completo suplementado con gentamicina y la placa de lasm en una placa de 100 mm.
12. Se incuban las células transfectadas durante la noche a 37 ° C, 5% de CO _2.
13. A la mañana siguiente, sustituir el medio completo con 10 ml de medio de microscopía libre de suero (RPMI 1640 sin rojo fenol, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 50 mM β-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina).

2. Opsonización de glóbulos rojos

Nota: Como modelo de destino de partículas para los macrófagos, se utilizan células rojas de la sangre de oveja (SRBC). Por lo general, se utiliza alrededor de 7 x 10 ⁶ SRBCs por 35 mm placa de fondo de cristal.

1. Lavar los SRBC con 100 l de 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato) /0.1% de BSA (albúmina de suero bovino) y se centrifuga (600 xg, 4 min).
2. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender los SRBC en 100 l de 1x PBS / 0,1% de BSA y centrifugar (600 xg, 4 min).
3. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender los SRBC en 1 x PBS / 0,1% BSA con IgG de conejo anti-SRBCa una concentración sub-aglutinantes. Utilizar 500 l de solución que contenía anticuerpo / 5 l de eritrocitos de cordero.
   Nota: La concentración sub-aglutinantes de anticuerpos corresponde a la concentración más baja que no induce aglutinación detectado como la formación de una red. En general, la concentración sub-aglutinantes es de 8,2 g / ml.
   1. Determinar la concentración de IgG anti-SRBC necesarios para opsonizar los SRBC mediante un ensayo de hemaglutinación. En serie diluir la IgG anti-SRBC (acciones a 13,1 mg / ml) entre 1/50 - 1 / 25.600 en una microplaca. Añadir 2 x 10 ⁶ eritrocitos de cordero en cada pocillo. Se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante varias horas.
4. Incubar a RT durante 30 minutos con rotación lenta.
5. Después de dos lavados en 1X PBS / 0,1% BSA como se describe anteriormente, resuspender las SRBC opsonizadas-IgG (IgG-SRBC) en medio de microscopía libre de suero pre-calentado (2 ml / placa).

3. Revestimiento de poli-lisina de Cubreobjetos

1. Mientras tanto, El tratamiento de los platos inferiores mm de vidrio 35 con 2 ml de 0,01% de poli-L-lisina para 30 min a temperatura ambiente.
2. Lavar los platos dos veces con 2 ml de 1x PBS.

4. Fijación no covalente de los eritrocitos de cordero sobre el vidrio platos de fondo

1. Verter 2 ml de suspensión de SRBC por mm de vidrio 35 plato de fondo.
2. Se centrifuga con un rotor que hace pivotar a 500 xg durante 2 min en placas de fondo de vidrio 35 mm.
3. Eliminar el sobrenadante y lavar una vez con 2 ml de 1x PBS / 10% de BSA.
4. Incubar las partículas durante 30 minutos con 2 ml de 1x PBS / 10% de BSA por placa.
5. Lavar los platos tres veces con 2 ml de 1x PBS.
6. Reemplazar 1x PBS con 2 ml de pre-calentado (37 ° C) medio de microscopía libre de suero.

5. La fagocitosis visualizaron por TIRFM

1. Microscopio
   Nota: TIRFM se realizó con un microscopio equipado con un objetivo de inmersión en aceite (N 100X, NA1.49), una cámara de calentamiento con CO _2, y dos cantarLe cámaras de detección de fotones EMCCD (multiplicador de electrones Charge Coupled Device) junto con una lente de 1.5X.
   1. El día antes de la sesión de microscopio TIRF, encender la cámara de calentamiento a 37 ° C para permitir un calentamiento homogéneo de la platina del microscopio.
2. Determinación del ángulo crítico
   Nota: El software ImageJ Color Profiler se utiliza para procesar flujos de imágenes TIRF.
   1. Coloque un plato de cristal inferior 35 mm que contiene SRBC opsonizado con medio libre de suero microscopía bajo el microscopio.
   2. Raspar las células y resuspender en el medio antes de la adición de ellos (100 - 500 l) en el plato.
   3. Utilice el software "Adquisición Live" para controlar el microscopio y realizar la excitación con una nm 491 y / o un láser de 561 nm para identificar las células que expresan las proteínas etiquetadas con fluorescencia.
   4. Identificar una célula que expresa las proteínas etiquetadas con fluorescencia.
   5. Colocarlo en el centro del campo y adquirir 500 imedades en una longitud de onda de excitación, con diferentes ángulos a partir de 0º hasta 5º, con un incremento de 0.01º (Figura 2A). Los ángulos se cambian automáticamente por el sistema de microscopio.
   6. Determinar el ángulo crítico permitiendo que la luz incidente se refleja totalmente en la interfase vidrio / medio y generar la onda evanescente. El uso de software ImageJ Color Profiler, abra la secuencia de imágenes haciendo clic en "Archivo", "Abrir" y seleccione el archivo.
   7. Seleccionar una región de interés (ROI), con la herramienta rectangular, en la célula con una fluorescencia uniforme (Figura 2B amarillo 1).
   8. Trazar el "perfil del eje Z" intensidad media de fluorescencia medida en el retorno de la inversión con la función de los ángulos sobre el eje X haciendo clic en la pestaña "Imagen", "pilas" en el menú desplegable y "Lote Z-eje Perfil" abajo (Figura 2B rojo 2).
      Nota: El ángulo crítico es el ángulo que conduce a la maximo de fluorescencia antes de una fuerte disminución de la fluorescencia.
   9. Utilice cualquier valor del ángulo en el eje x superior a el ángulo crítico durante la sesión de microscopía para obtener una señal TIRF como ejemplo 2.00 (Figura 2C).
3. adquisiciones
   1. El uso de software en vivo Adquisición, configurar los parámetros de adquisición con el módulo "Protocolo Editor" (Figura 3A).
      1. Crear un protocolo con un "bucle" que comprende "Canales" Multi adquisición para adquirir la señal fluorescente de proteínas de interés en la región TIRF. Introducir el ángulo TIRF (por ejemplo 2,00), el tiempo de exposición (por ejemplo 50 ms) y la intensidad del láser (por ejemplo 50%) (Figura 3B 1).
      2. Introducir un "movimiento Z" del objetivo del 3 m por encima de la región TIRF para obtener la adquisición de señales de epifluorescencia con la función "Multi Canales". Introduzca un ángulo por debajo tél ángulo crítico (como ejemplo 1.00), el tiempo de exposición (50 ms) y la intensidad del láser (50%) (Figura 3B, 2 y 3).
      3. A continuación añadimos una "z movimiento" del micras objetivo 3 a continuación, para volver en la región TIRF (Figura 3B 4). Añadir una "instantánea" de la célula en la luz brillante del LED (Light-Emitting Diode) (Figura 3B 5).
   2. Encuentra una célula de interés con un nivel moderado de expresión de la proteína marcada con fluorescencia que inicia la fagocitosis de SRBC mediante la extensión de la membrana plasmática alrededor de la partícula.
   3. Colocarlo en el centro del campo.
   4. Empezar a emitir adquisición de 500 - 1.000 marcos. En la pestaña "cuenta de bucles", introduzca "750 marcos" (Figura 3B 1).
      Nota: El software ImageJ Color Profiler se utiliza para procesar flujos de imágenes TIRF.
   5. Abrir las imágenes de la secuencia en el software Image J haciendo clic"Archivo", "Abrir" y elegir el archivo.
   6. Separar los canales haciendo clic en la pestaña "Imagen", "Hyperstacks" del menú desplegable y en "Pila de HyperStack" función. Complete la ventana que ha aparecido: Orden: xyctz; Canal (c): número de canales (por ejemplo: "2" si tiene dos fluorocromos); Rebanadas (z): número de cortes en el eje Z (por ejemplo: "1" si no hay movimiento en el eje z); Marcos (t): número de imágenes divididas por el número de canales; Modo de visualización: Escala de grises.
      Nota: Dos secuencias de imagen separados se generan, correspondientes a los dos canales diferentes.

El sistema experimental descrito en este manuscrito se representa esquemáticamente en la Figura 1. Macrófagos RAW264.7 transfectadas que expresan las proteínas de interés fusionado a una etiqueta fluorescente se colocan en contacto con ovejas opsonizado-IgG glóbulos rojos (SRBC) que se fijaron de forma no covalente en el cubreobjetos. Los macrófagos pueden separar el SRBC del cubreobjetos para envolverlo. El microscopio TIRF utilizado permite la adquisición simultánea de señales de la zona TIRF correspondientes a las puntas de los seudópodos y las señales en el modo de epifluorescencia después de un cambio Z 3 micras anteriormente.

Es esencial para determinar el ángulo crítico para la reflexión interna total de fluorescencia como se describe en la Figura 2. Esto asegura una señal TIRF limpia de una región de 100 nm por debajo de la membrana de plasma. La Figura 3 representa el desarrollo de acquisitien los parámetros a través de un módulo llamado "Protocolo Editor" incluido en el software de adquisición en vivo. Este módulo permite a los usuarios crear y gestionar los flujos de trabajo antes de ser enviados al microscopio, el cual ejecutará el proceso. Al final de la adquisición, el usuario recoge una corriente TIFF.

La figura 4 muestra, una película TIRFM en vivo de células representante de un "ensayo de cierre fagosoma" en los macrófagos RAW264.7 transfectadas con el plásmido (por ejemplo, Lifeact-mCherry, una especie de regalo del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, genera después de 17) para seguir la polimerización de actina. Los macrófagos transitoriamente se les permitió plásmido que expresa con hundir IgG SRBCs con destino a la cubreobjetos. A medida que las puntas de los seudópodos fueron adosados ​​a la cubreobjetos de vidrio alrededor de un SRBC, se detectó un anillo de actina F en el área TIRF (panel superior) que se redujo progresivamente hasta que se cerró. Paralelamente, la borrosa F-actinaseñal detectada por epifluorescencia después de cambiar la etapa de 3 m por encima de (panel inferior) correspondió a la despolimerización en la base de la copa fagocítica. Después de 3 minutos de la adquisición, el SRBC fue totalmente interiorizado, como se confirma con luz transmitida (panel de la derecha).

Por lo tanto, este método puede ser utilizado para distinguir correctamente los eventos moleculares que tienen lugar en los confines de los seudópodos y los eventos moleculares que ocurren en la base de la copa fagocítica.

Figura 1. Representación esquemática del "Ensayo de cierre Fagosoma" Analizada por TIRFM. El ensayo de cierre fagosoma se realiza usando los macrófagos que expresan transitoriamente uno o dos-proteína marcada con fluorescencia. Los macrófagos se depositan en SRBC opsonizadas-IgG fijos de forma no covalente en coa poli-lisinaTed cubreobjetos. Las imágenes se graban en el modo TIRF para detectar el sitio de cierre fagosoma y en el modo de epifluorescencia para detectar la base de la copa de fagocitosis. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Determinación del ángulo crítico para la TIRFM. (A) El uso de "adquisición Live", una célula que expresa las proteínas etiquetadas fluorescentemente se coloca en el centro del campo (región 1 en rojo). Con la opción de TIRF Pila, las imágenes fueron adquiridas a una longitud de onda de excitación, con diferentes ángulos empezando desde 0 ° hasta 5 °, con un incremento de 0,01 ° (región 2 en rojo). (B) la secuencia de imágenes se abre usando ImageJ software color Profiler y la intensidad de fluorescencia media de aregión de interés (ROI) se representa con la función de los ángulos del eje x usando "Pilas" y "Plotz eje perfil" (región 1 en rojo). (C) La posición x del pico de la fluorescencia en la parcela corresponde a el ángulo crítico: 1,98 ° (negro línea de puntos). Cualquier valor después de este ángulo se puede utilizar. A modo de ejemplo, 2,00 ° pueden ser elegidos (línea roja). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Proceso de flujo de trabajo mediante Live Módulo de Adquisición: "Protocolo Editor". (A) En la ventana "Editor Protocolo", se crea un lienzo del flujo de trabajo. (B) Este protocolo comprende un "bucle" de las acciones que el microscopio se repetirá el número de veces que decidiópor el usuario. A modo de ejemplo: 750 (1). Un bucle incluye: adquisición de "múltiples canales" con excitación láser de las proteínas fluorescentes de interés en el modo TIRF. Como ejemplo: Láser 491 nm intensidad del 50% Ángulo de -TIRF 2,00 (2); "Movimiento Z" del objetivo del 3 micras (3); adquisición "múltiples canales" en el modo de epifluorescencia (4); "Movimiento Z" del objetivo de nuevo a la región TIRF (5) y una "instantánea" de la luz transmitida (6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. F-actina se acumula como un punto en el lugar de ensayo de cierre Fagosoma cierre. Fagosoma se ha realizado mediante macrófagos RAW264.7 que expresan transitoriamente el plásmido Lifeact-mCherry (una especie de regalo del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, París, generado después del 17). La señal de plásmido fue adquirido en el área TIRF (arriba) y en el modo de epifluorescencia (parte inferior). La flecha roja indica la acumulación de actina en la región TIRF. Transmitida imagen de luz en el minuto 3 se presenta, lo que indica un SRBC interiorizado. Barra de escala, 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1: F-actina se acumula en las puntas de los seudópodos y en el sitio de Fagosoma de cierre, mientras que se eliminan de la base del ensayo de cierre de fagocitosis Copa Fagosoma se ha realizado mediante macrófagos RAW264.7 que expresan transitoriamente el plásmido.. formación de imágenes en el área de plásmido TIRF (arriba) y en el modo de epifluorescencia (parte inferior) usando el TIRFM se realizó alternativaLy cada 50 ms durante 3 minutos a 37 ° C. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.

Los autores no tienen nada que revelar.