Este protocolo describe una técnica de osteosíntesis que utiliza un clavo de bloqueo intramedular para la fijación estandarizada de osteotomías de fémur, que se puede utilizar para analizar la cicatrización ósea normal y defectuosa en ratones.
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Artículo de método
Un clavo intramedular de bloqueo para estandarizada fijación del fémur osteotomías para analizar normal y defectuoso Bone Healing en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
modelos de cicatrización ósea son esenciales para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de fracturas clínica. Por otra parte, los modelos de ratón son cada vez más utilizadas en la investigación de trauma. Ofrecen un gran número de cepas mutantes y anticuerpos para el análisis de los mecanismos moleculares detrás del proceso altamente diferenciada de la curación del hueso. Para controlar el entorno biomecánico, técnicas de osteosíntesis estandarizados y bien caracterizados son obligatorios en ratones. Aquí, se presenta en el diseño y uso de un clavo intramedular para estabilizar osteotomías femorales abiertas en ratones. El clavo, hecho de acero inoxidable de grado médico, proporciona una alta rigidez axial y rotacional. El implante permite, además, la creación de definido, espacio de osteotomía constante el tamaño de 0,00 mm a 2,00 mm. Intramedular de bloqueo de la estabilización de la uña de osteotomías de fémur con tamaños de hueco de 0,00 mm y 0,25 mm resulta en la curación del hueso endocondral y adecuada a través de ossificat intramembranousion. La estabilización de las osteotomías de fémur con un tamaño de intervalo de 2,00 mm corresponde a la no unión atrófica. Por lo tanto, el clavo intramedular de bloqueo puede ser utilizado en los modelos de curación y no curativos. Una ventaja adicional del uso de la uña en comparación con otros modelos de cicatrización ósea abierta es la posibilidad de fijar adecuadamente sustitutos óseos y andamios con el fin de estudiar el proceso de integración ósea. Una desventaja de la utilización del clavo intramedular es el procedimiento quirúrgico más invasivo, inherente a todos los procedimientos abiertos en comparación con modelos cerrados. Una desventaja adicional puede ser la inducción de algunos daños en la cavidad intramedular, inherente a todas las técnicas de estabilización intramedulares en comparación con los procedimientos de estabilización extramedular.
Introducción
La biología de la curación del hueso puede ser estudiada in vitro utilizando cultivos de células y esferoides, pero también requiere in vivo utilizando enfoques estudios con animales. Mientras que los experimentos a gran animales siguen desempeñando un papel importante en los ensayos preclínicos, los ensayos fase temprana de los productos o hipótesis ha cambiado durante los últimos 10 años y hoy en día es a menudo realizado en modelos animales pequeños 1. Este interruptor se realizó por varias razones. Producción y mantenimiento de los ratones y las ratas son más baratos en comparación con los cerdos y ovejas. Además, los pequeños animales tienen menores tiempos de reproducción y los períodos normales de curación más cortos, los cuales facilitan la realización de grandes series de experimentos crónicos. Finalmente, la disponibilidad de animales con genes dirigidos y anticuerpos específicos permite el análisis de los mecanismos moleculares en la curación del hueso. Sin embargo, mientras que el anteriormente utilizado técnicas de osteosíntesis en los modelos animales más grandes podría traducirse también ree mínimo ión de procedimientos similares a los utilizados en la atención clínica del paciente humano o veterinario, el desarrollo y la aplicación de técnicas de osteosíntesis en las ratas y los ratones de tamaño pequeño resultó ser un reto.
Es bien sabido que el entorno biomecánico influye significativamente en el hueso proceso 2 de curación. Como se sabe por la curación de fracturas en los seres humanos, las diferencias en consecuencia estabilización de la fractura en modos distintos de curación, incluyendo la osificación intramembranous después de la fijación rígida y osificación endocondral después de la fijación menos rígida con micromovimientos. Axial completa o inestabilidad rotacional pueden retrasar el proceso de curación o pueden resultar en falta de unión 3. En consecuencia, creemos que es necesario el desarrollo de sistemas de implante y sofisticadas técnicas de osteosíntesis en ratones y ratas. De esta manera, las condiciones biomecánicas pueden estandarizarse adecuadamente, garantizando resultados válidos cuando se analiza el proceso de curación.
e_content "> Aunque se han introducido un número considerable de técnicas de estabilización de murino altamente sofisticados en los últimos años, la técnica más comúnmente utilizado es todavía el pasador intramedular simple. La principal desventaja de esta técnica, sin embargo, es la falta de rotación y axial estabilidad 4. para mejorar la estabilidad de rotación y axial, se introdujo un tornillo intramedular para estabilizar fracturas de fémur en ratones 5. sin embargo, la fijación de tornillo no puede ser utilizado para analizar la cicatrización ósea defectuosa debido a la necesidad de contacto y compresión entre los fragmentos de hueso en para mantener la estabilidad de rotación.El clavo intramedular de bloqueo ofrece una mayor estabilidad de rotación axial y en comparación con el pasador simple y el tornillo intramedular 4. A osteotomía fémur altamente reproducible, posible gracias a la guía para la sierra de Gigli y la capacidad de crear tamaños de hueco definido, permite el análisis tanto de Bon normalese la curación y la cicatrización de 6-hueso defectuoso. Debido a la inserción de pasadores de enclavamiento, el clavo intramedular de bloqueo garantiza un tamaño de intervalo constante durante todo el proceso de curación, incluso mientras la carga de peso completa. Aquí, se presenta en el diseño y aplicación del clavo intramedular de bloqueo, así como sus ventajas y desventajas en estudios experimentales sobre la cicatrización ósea normal y tardía.
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Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados por el IACUC y siguieron las directrices institucionales (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, Alemania). La analgesia y la prevención de la infección deben estar de acuerdo con las directrices respectivas del país e institución donde los experimentos se van a realizar.
1. Preparación de implantes e instrumentos quirúrgicos
- Seleccione una hoja de bisturí (tamaño 15), unas tijeras pequeñas de preparación, unas pinzas finas, fórceps de acabado, pequeñas tenazas, de calibre 24 (G) y 27 agujas G, A no reabsorbible 5-0 de sutura, y un soporte de aguja de la caja de instrumentos de microcirugía .
- Desempaquetar el clavo intramedular, los pasadores de enclavamiento, el dispositivo de puntería especial, la sierra de Gigli, la plantilla de la sierra de Gigli, la broca de centrado (1 mm de diámetro), la broca (0,3 mm de diámetro), y el taladro de mano (figura 2; véase la Lista de Materiales).
NOTA: El intramclavo edullary (0,8 mm de diámetro, 15,7 mm de longitud) es un clavo intramedular de bloqueo de acero inoxidable de calidad médica para la implantación retrógrada en el fémur. El clavo tiene una rosca proximal (4 mm de longitud) y dos agujeros para la inserción de los pasadores de enclavamiento (0,3 mm de diámetro) para lograr la estabilidad axial y rotacional (Figura 1). - Exponer los implantes y todos los instrumentos quirúrgicos a una solución desinfectante (por ejemplo, 96% de alcohol) durante 5 min o esterilizarlos (esterilización por vapor, 130 ° C, 25 min). Después de la desinfección o esterilización, colocar los instrumentos en un paño estéril funcionamiento. Coloque el paño estéril funcionamiento directamente junto a la pequeña mesa de operaciones animales.
2. Los animales, Anestesia, Analgesia y
- Elija la cepa, la edad y el sexo de los ratones como sea necesario para el estudio y la pregunta que deben abordarse.
NOTA: Para este estudio de 12 a 14 semanas de edad ratones CD-1 machos fueron utilizados. Para IMPLA uñasntation, el peso corporal ideal de los animales es 25 - 35 g. - Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de 15 mg / kg de xilazina y 75 mg / kg de ketamina. Confirmar la anestesia por pellizco del dedo del pie. Aplicar lubricante ocular para proteger los ojos de los animales que se sequen durante la anestesia. Después de la inducción de la anestesia, coloque el ratón bajo una lámpara de calor para mantener constante la temperatura corporal.
- Aplicar tramadol-hidrocloruro en el agua potable (2,5 mg / 100 ml) para la analgesia de día 1 antes de la cirugía hasta el día 3 después de la cirugía.
3. Procedimiento quirúrgico e Implantación de uñas
- Antes de la cirugía, afeitarse toda la pata trasera derecha y aplicar una crema depilatoria. Después de 5 min, retirar la crema y limpiar la pierna con agua. Exponer los implantes y todos los instrumentos quirúrgicos a una solución desinfectante (por ejemplo, 96% de alcohol) o esterilizarlos (esterilización por vapor, 130 ° C, 25 min).
- En condiciones asépticas, colocar los mouse en la posición supina sobre la pequeña mesa de operaciones animales. Doble la rodilla derecha para permitir un acceso anterior a los cóndilos de la rodilla. Realizar una incisión de 5 mm medial pararrotuliano en la rodilla derecha con la hoja de bisturí.
- Levantar el ligamento rotuliano con las pinzas finas y movilizar el ligamento cuidadosamente con la hoja de bisturí. A continuación, desplazar la rótula lateralmente con la hoja de bisturí para exponer la muesca intercondilar del fémur.
- Abra la escotadura intercondílea mediante la perforación hasta que se alcanza la cavidad intramedular.
- Comenzar a perforar con un desplazamiento de 45º con respecto al eje del fémur utilizando los 1 mm de centrado broca. cambiar lentamente la dirección de la broca durante la perforación hasta que es paralelo al eje del hueso del fémur. Detener la perforación si se alcanza la cavidad intramedular.
- Después de abrir el hueso en la escotadura intercondílea, insertar la aguja 24 G en la cavidad intramedular en toda la longitud del fémur. Escariar el INTRAMEdullary cavidad del fémur manualmente a través de movimientos de rotación de la aguja 24 G. Retire la aguja 24 G y 27 insertar la aguja más delgada G en la cavidad intramedular. Empuje la aguja hacia delante para perforar el hueso cortical del fémur proximal en el trocánter mayor.
- Retire la aguja de 27 G del fémur. Usando el taladro de mano, implantar el clavo intramedular a través de la muesca intercondilar en rotación continua y la presión axial hasta que el extremo distal de la uña alcanza el nivel de los cóndilos.
NOTA: El extremo distal de la uña puede ser identificado con una pequeña marca. - Coloque el ratón en la posición de lateral izquierdo. Realizar una incisión en la piel longitudinal utilizando la hoja de bisturí a lo largo de la parte diafisaria del fémur lateral de la articulación de la rodilla a la articulación de la cadera con el fin de exponer quirúrgicamente la diáfisis del fémur.
- Usando tijeras pequeñas de preparación, dividir la fascia y la propagación de los músculos en la dirección del eje del fémur desde el lado lateral.Difundir los músculos hasta que se expone la parte de la diáfisis del fémur. Preservar el nervio ciático.
- Preparar toda la circunferencia del fémur al socavar el hueso con las pinzas de apósito. A continuación, retraer los músculos mediante la difusión de las pinzas de apósitos y exponer el fémur.
- Montar el aparato de puntería en el extremo distal de la uña. Hacer avanzar el dispositivo hasta que se une a la brida de adaptación de la uña y girar el dispositivo de puntería en la posición antero-lateral al fémur.
- Enclavar la uña con un extremo proximal y un pasador de enclavamiento distal.
- Comience con el pasador de enclavamiento proximal.
- Introduzca la broca de centrado (1 mm de diámetro) en el taladro de mano. Avellanar el hueso en la posición del agujero de enclavamiento proximal.
NOTA: Por avellanado, una pequeña cavidad que se crea en el hueso cortical en frente sin perforar a través del hueso. Esta cavidad permite un mejor centrado y de guiado de la broca más delgada (diámetro 0,3 mm),utilizado más tarde. - Introduzca la broca (0,3 mm de diámetro) en el taladro de mano. Utilizando el dispositivo de puntería, perforar el agujero a través tanto del revestimiento y el hueso cortical evitada (bicortical). Inserte el primer pasador de enclavamiento a través del dispositivo de puntería. Las tijeras de enclavamiento del eje de accionamiento pasador tan pronto como se alcanza el par de enclavamiento.
- Repita este procedimiento para el pasador de enclavamiento distal.
- Realizar la osteotomía diafisaria.
- Coloque la guía de sierra al dispositivo objetivo en el lado lateral entre los dos pasadores de enclavamiento. Entonces, vio el hueso con la sierra de Gigli bajo irrigación continua con solución salina. Después de que se completó la osteotomía, corte la sierra en un extremo, cerca del hueso. Retirar la sierra con cuidado para evitar causar daños en los tejidos blandos.
- Retire el dispositivo de puntería y, con las pequeñas pinzas, una pinza fuera del eje restante del clavo intramedular en la línea marcada.
- Cierre las capas musculares en el latEl sitio ral del fémur y llevar a cabo el cierre de la piel con suturas individuales. En el sitio anterior de la rodilla, cambiar la posición de la rótula y fijar el tendón de la rótula a los músculos con una sola sutura. Utilice puntos sueltos para cerrar esta herida también.
- Mantener a los animales bajo la lámpara de calor hasta que se recuperen de la anestesia. No dejar a los animales sin vigilancia hasta que hayan recuperado el conocimiento suficiente para mantener la posición de decúbito ventral. Devolver los animales a jaulas individuales en el animalario.
- Vigilar cuidadosamente a los animales todos los días. Mantener la analgesia postoperatoria durante los tres primeros días. Continuar la analgesia si, en el día 4 después de la cirugía, los animales siguen mostrando evidencia de dolor, según lo indicado por la vocalización, inquietud, falta de movilidad, ausencia de limpieza, postura anormal, y la falta de interés normal en un entorno. Terminar la analgesia cuando los animales están libres de dolor.
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Resultados
El tiempo total para el procedimiento quirúrgico fue de aproximadamente 30 minutos de la incisión de la piel cierre de la herida. El uso de los implantes quirúrgicos proporcionados, la cirugía se puede realizar sin un estereomicroscopio. Después de la operación, los animales se controlaron diariamente. La analgesia postoperatoria se terminó después de 3 días, porque ninguno de los animales mostró evidencia de dolor (vocalización, inquietud, falta de movilidad, ausencia de limpieza, postu...
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Discusión
Los pasos más críticos de la técnica quirúrgica son el posicionamiento correcto de la uña, el dispositivo de puntería, y los pasadores. El clavo tiene que ser insertado por completo a la guión marcado en el extremo distal de la uña, ya que un saliente del clavo en la articulación de la rodilla en el nivel de los cóndilos puede restringir el movimiento de la rodilla (Figura 3 A). Por lo tanto, el tamaño del fémur y, en consecuencia, el peso corporal de los animales, debe ser considerado. El cirujano tamb...
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Divulgaciones
Romano Matthys es un empleado de RISystem AG, Davos, Suiza, que produce los implantes y los instrumentos específicos para implantes. Los otros autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por RISystem AG, Davos, Suiza.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MouseNail | RISystem AG | 221,122 | |
| Dispositivo de puntería MouseNail | RISystem AG | 221,201 | |
| MouseNail pasador de enclavamiento | RISystem AG | 221,121 | |
| Broca | de centrado RISystem AG | 592,205 | |
| Broca | RISystem AG | 590,200 | |
| Sierra de hilo Gigli | RISystem AG | 590.100 | |
| Sutura (5-0 Prolene) | Pinzas Ethicon | 8614H | |
| Braun | Aesculap AG & CoKG | BD520R | |
| Pinza de vendaje | Braun Aesculap AG & CoKG | BJ009R | |
| Tijeras | Braun Aesculap AG & CoKG | BC100R | |
| Portaagujas | Braun Aesculap AG & CoKG | BM024R | |
| Aguja 24 G | BD Mircolance 3 | 304100 | |
| Aguja 27 G | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| Hoja de bisturí tamaño 15 | Braun Aesculap AG & CoKG | ||
| Pinzas de | Knipex 7932125 | ||
| Radiador de calor | Sanitas | 605.25 | |
| Crema depilatoria | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| Lubricante ocular | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| Xilacina | Bayer Vital GmbH | 1320422 | |
| Ketamina | Serumwerke Bernburg | ||
| Tramadol | Grü nenthal GmbH | 2256241 | |
| Solución de desinfección (SoftaseptN) | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| ratones CD-1 | Charles River | 22 |
Referencias
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Claes, L., Augat, P., Suger, G., Wilke, H. J. Influence of size and stability of the osteotomy gap on the success of fracture healing. J Orthop Res. 15 (4), 577-584 (1997).
- Histing, T., et al. Characterization of the healing process in non-stabilized and stabilized femur fractures in mice. Arch Orthop Trauma Surg. 136 (2), 203-211 (2016).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. J Orthop Res. 27 (9), 1152-1156 (2009).
- Holstein, J. H., et al. Development of a stable closed femoral fracture model in mice. J Surg Res. 153 (1), 71-75 (2009).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail-a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J Surg Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Cheung, K. M., Kaluarachi, K., Andrew, G., Lu, W., Chan, D., Cheah, K. S. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. J Biomech. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. J Orthop Res. 28 (3), 397-402 (2010).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11 (2), 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18 (10), 687-695 (2004).
- Lovati, A. B., et al. Diabetic mouse model of orthopaedic implant-related Staphylococcus aureus infection. PLoS One. 8 (6), e67628(2013).
- Slade Shantz, J. A., Yu, Y. Y., Andres, W., Miclau, T. 3rd, Marcucio, R. Modulation of macrophage activity during fracture repair has differential effects in young adult and elderly mice. J Orthop Trauma. 28, 10-14 (2014).
- Claes, L. E., et al. Effects of mechanical factors on the fracture healing process. Clin Orthop Relat Res. 355 (Suppl), 132-147 (1998).
- Gröngröft, I., et al. Fixation compliance in a mouse osteotomy model induces two different processes of bone healing but does not lead to delayed union. J Biomech. 18 (13), 2089-2096 (2009).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. J Vis Exp. (9), e51558(2014).
- Manassero, M., et al. A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes. Tissue Eng Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).
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