Rápida de un solo paso Síntesis enzimática y All-Purificación acuosa de trehalosa Análogos

Resumen

Los análogos de la trehalosa están emergiendo como moléculas importantes para aplicaciones bio(tecnológicas) y biomédicas. Describimos un protocolo optimizado para sintetizar y purificar enzimáticamente análogos de trehalosa que es simple, eficiente, rápido y respetuoso con el medio ambiente. Se demuestra su aplicación a la producción y administración rápida de una sonda para la detección de micobacterias.

Resumen

versiones de trehalosa, o análogos de trehalosa químicamente modificado, tienen aplicaciones en la biología, la biotecnología y la ciencia farmacéutica, entre otros campos. Por ejemplo, los análogos de trehalosa que llevan etiquetas detectables se han utilizado para detectar Mycobacterium tuberculosis y pueden tener aplicaciones como agentes de formación de imágenes de diagnóstico de la tuberculosis. Las versiones estables frente a la hidrólisis de trehalosa también están siendo perseguidos debido a su potencial para su uso como edulcorantes no calóricos y agentes bioprotectivas. A pesar del atractivo de esta clase de compuestos para diversas aplicaciones, su potencial se ha cumplido debido a la falta de una ruta sólida para su producción. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la síntesis de una sola etapa biocatalıtica rápida y eficaz de los análogos de trehalosa que no pasa por los problemas asociados con la síntesis química. Mediante la utilización de la enzima termoestable trehalosa sintasa (TRET) de Thermoproteus tenax, análogos de trehalosa puede ser geed en un solo paso a partir de análogos de glucosa y glucosa uridina difosfato con un alto rendimiento (hasta conversión cuantitativa) en 15 a 60 min. Un protocolo de purificación no cromatográfico simple y rápida, que consiste en diálisis giro y de intercambio de iones, puede entregar muchos análogos de trehalosa de concentración conocida en solución acuosa en tan poco como 45 min. En los casos en que no ha reaccionado análogo de la glucosa sigue siendo, purificación cromatográfica del producto análogo de trehalosa se puede realizar. En general, este método proporciona una plataforma biocatalıtica "verde" para la síntesis acelerada y purificación de análogos de trehalosa que sea eficiente y accesible a los no químicos. Para ejemplificar la aplicabilidad de este método, se describe un protocolo para la síntesis, todos acuoso purificación, y la administración de una sonda química clic a base de trehalosa micobacterias, todo lo cual llevó a menos de 1 hora y permitió la detección de fluorescencia de las micobacterias. En el futuro, prevemos que, entre OTHer aplicaciones, este protocolo se puede aplicar a la rápida síntesis de sondas a base de trehalosa para el diagnóstico de la tuberculosis. Por ejemplo, los análogos de corta duración trehalosa radionucleido-modificados (por ejemplo, ¹⁸ trehalosa F-modificados) pueden utilizarse para aplicar las técnicas de imagen clínicos avanzados como la tomografía computarizada, tomografía por emisión de positrones (PET-TC).

Introducción

La trehalosa es un disacárido simétrico no reductor que consiste en dos fracciones de glucosa que están unidas por un 1,1-α, enlace α-glucosídico (Figura 1A). Mientras que la trehalosa está ausente de los seres humanos y otros mamíferos, que se encuentra comúnmente en las bacterias, los hongos, las plantas y los invertebrados ^1. La función principal de trehalosa en la mayoría de los organismos es proteger contra el estrés ambiental, como la desecación ^1. Además, algunos patógenos humanos requieren trehalosa para la virulencia, incluyendo la tuberculosis Mycobacterium tuberculosis que causa, que....

Protocolo

1. Expresión y purificación de tret del Top10 de E. coli

NOTA: Por favor, póngase en contacto con los autores para solicitar la cepa de E. coli que expresan tret (plásmido pBAD tret, que contiene el gen tret T. tenax bajo el control de la proteína AraC, transformado en E. coli Top10 ¹⁹⁾ y el acuerdo de transferencia de material complementario . El siguiente protocolo normalmente da un rendimiento de proteína de aproximadamente 4 mg / L.

1. Preparar un cultivo de una noche de 3 ml de Tret-expresión de E. coli.
   1. Streak Top10 de E. coli transformada con el vector de exp....

Resultados

T. tenax TRET se obtuvo de E. coli con un rendimiento de aproximadamente 4 mg / L usando la expresión y purificación de proteínas técnicas estándar. Una etapa de cromatografía de afinidad de níquel sola era suficiente para purificar TRET de lisado de E. coli (una traza FPLC representativo se muestra en la Figura 4). Según se establece en nuestra publicación inicial en el proceso de síntesis tret, T. tenax recombinante tret es capaz de .......

Discusión

Análogos de trehalosa tienen el potencial de impactar en diversos campos, desde la conservación de alimentos y productos farmacéuticos para el diagnóstico y el tratamiento de infecciones microbianas ^6. Existentes métodos de síntesis química de múltiples etapas son útiles para producir análogos de trehalosa complejas con múltiples sitios de modificación (por ejemplo, de origen natural glicolípidos micobacterianos complejos). Sin embargo, estos métodos son invariablemente largo e ineficien.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar LB	Productos de Investigación Internacional	L24021
Sal sódica de ampicilina	Sigma Aldrich	A9518
Caldo Luria	Productos de Investigación Internacional	L24045
Caldo Terrific Productos	Investigación Internacional	T15050
L-(+)-Arabinosa	Sigma Aldrich	A3256
Solución salina tamponada con fosfato	GE Healthcare	SH30256
Imidazol	Sigma Aldrich	I5513
Cloruro de sodio	BDH	BDH9286
Fosfato de sodio, monobásico	Fisher Scientific	S374
Filtro de jeringa, 0,45 y micro; m	Fisher Scientific	09719D
Minicomprimidos de inhibidor de la proteasa, sin EDTA	Thermo Scientific	88666
HisTrap HP columna de afinidad de níquel, 5 mL	GE Healthcare	17-5248-02
TRIS base ultrapure	Research Products International	T60040
Tubo de diálisis, MWCO 12– 14,000	Fisher Scientific	21-152-16
Análogos de glucosa	CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiomarked Chemicals		Ejemplos de proveedores que ofrecen numerosos análogos de glucosa
6-Azido-6-desoxi glucopiranosa (6-GlcAz)	CarboSynth	MA02620
UDP-Glucosa	abcam Bioquímicos	ab120384
Cloruro de magnesio hexahidratado	Unidad	Fisher Scientific M33
Amicon Ultra-15	EMD Millipore	UFC901008
Bio-Rex RG 501-X8 resina de intercambio iónico de lecho mixto	Bio-Rad	444-9999
Extra-Fine Bio-Gel P2 media	Bio-Rad	150-4118
Placas de cromatografía de capa fina de gel de sílice con respaldo de vidrio	EMD Millipore	1056280001
n-Butanol	Fisher Scientific	A399
Etanol	Fisher Scientific	S25310A
Ácido sulfúrico	Fisher Scientific	A300
Acetonitrilo	EMD Millipore	AX0145
Óxido de deuterio, 99,8%	Acros Organics	351430075
Columna de HPLC aminopropilo	Sigma Aldrich	58338
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	5470
Paraformaldehído	Ted Pella	18505
Alkyne-488	Sigma Aldrich	761621
Ascorbato de sodio	Sigma Aldrich	A7631
Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (TBTA)	Click Herramientas de química	1061
tert-Butanol	Sigma Aldrich	360538
Dimetilsulfóxido Sigma	Aldrich	W387520
Sulfato de cobre (II)	Sigma Aldrich	C1297
Medio de montaje Fluoromount-G	Southern Biotechnology	10001

de de filtro centrífugo