El siguiente informe describe cómo replicar el modelo de roedores de la neuropatía óptica isquémica anterior no arterítica (rNAION), utilizando los parámetros apropiados de tinte, lente de contacto y láser. También revelamos los pasos apropiados para evaluar la lesión rNAION in vivo.
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Artículo de método
El modelo de roedor de la anterior no arterítica neuropatía óptica isquémica (rNAION)
En este artículo
Resumen
Resumen
La neuropatía óptica isquémica anterior no arterítica (NAION) es una lesión isquémica focal del nervio óptico que afecta a 1/700 individuos a lo largo de su vida. NAION produce edema del nervio óptico, pérdida selectiva de las neuronas de las células ganglionares de la retina (RGC) y atrofia del nervio óptico. Se ha desarrollado un modelo de roedor de NAION que expresa la mayoría de las características y secuelas de NAION, que es aplicable tanto a ratas como a ratones. Este modelo utiliza una aplicación láser focal de 532 nm de longitud de onda para iluminar un tinte fotoactivo, la rosa de Bengala (RB), para causar daño capilar y fugas en el nervio óptico anterior objetivo (la región laminar). Después de la inducción de rNAION, hay una isquemia temprana del nervio óptico, edema del nervio óptico e inflamación intraneural, seguida de RGC selectivo y pérdida axonal. Dado que el nervio óptico es un tracto de sustancia blanca del SNC, el modelo rNAION es aplicable a los estudios mecanicistas de la isquemia selectiva de la sustancia blanca, así como a los análisis neuroprotectores y a corto y largo plazo de la respuesta glial y neuronal a la isquemia.
Introducción
Anterior no arterítica neuropatía óptica isquémica (NOINA) es una lesión isquémica focal de la porción anterior del nervio óptico (NO) 1. NOIA-NA es la causa más común de pérdida repentina de la visión relacionada nervio óptico en individuos de más de 50 años 2. El mecanismo se cree que es un síndrome compartimental que da lugar a un edema intraneural, y provoca la compresión de los capilares que irrigan los axones en el nervio óptico 3.
Dado que el EN es en realidad un tracto del sistema nervioso central (CNS), el NOINA roedor modelo (rNAION) se puede utilizar para estudiar los mecanismos y las respuestas a aislados del SNC trazos materia blanca. Por consiguiente, el modelo rNAION puede ser útil en la disección de muchos de los problemas asociados con el daño relacionado con accidente cerebrovascular a la sustancia blanca. Se puede usar para evaluar distintas estrategias y agentes neuroprotectores en el accidente cerebrovascular materia blanca.
Una de las características más atractivas del modelo es que esun procedimiento indoloro, no invasivo. La potencia del láser se puede ajustar para producir diversos grados de daño isquémico. Otra característica es que se basa en inducida por láser radicales superóxido dañar el endotelio capilar, produciendo una disfunción capilar progresiva. Es esta disfunción progresiva y edema que se cree que es muy similar al mecanismo que causa NOINA. La investigación ha demostrado que no causa la coagulación capilar directa, pero funciona a través de al menos dos mecanismos: la muerte inducida superóxido y de extracción de algunas de las células endoteliales capilares 4, y NFkB (factor nuclear de cadena kappa-light-potenciador de células B activadas ) asociado regulación inflamatoria en el endotelio restante, con el aumento de transporte de fluido a través de las membranas celulares en el intersticio 5. El cierre de los capilares del nervio óptico y de compresión causadas por resultado la acumulación de líquido intersticial en óptica isquemia cabeza del nervio. Una imagen esquemática se muestra en laLa Figura 2. El modelo rNAION se puede utilizar en ambas especies 6,7 rata y ratón, y se puede variar en el nivel de su gravedad, de una lesión leve a una destrucción completa, pero sin dolor del nervio óptico y la retina, tales como la oclusión de la arteria central de la retina (OACR).
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Protocolo
Este protocolo fue aprobado por la Universidad de Maryland Institucional Cuidado de Animales y el Utilización (IACUC; Baltimore, MD, EE.UU.)
1. Estructura del ensayo
- Hacer una lente de contacto personalizado diseñado a partir de un claro grado óptico circulares 7 mm de diámetro, de plexiglás de 3 mm de espesor. Cortar las lentes circulares con un taladro de columna. Utilice una broca estándar para hacer la curva interna, y finalmente pulir las curvas exteriores e interiores utilizando un pulidor de lentes de contacto de grano ultrafino (1000/3000).
- Preparar 2,5 mM Rosa de Bengala (RB) de pH 7,4 buffer fosfato salino (PBS) con antelación, esterilizar por filtración con un filtro de jeringa de 0,45 micras y almacenar en alícuotas de 1 ml -20 ° C en un recipiente hermético a la luz durante un máximo de 6 meses.
NOTA: El uso de animales machos outbred albinos, tales como Sprague Dawley minimiza las diferencias de respuesta dependientes de la tensión, permite una mayor facilidad de inducción y reduce la variabilidad que puede ocurrir con cycli estrohembra ng. - Configurar la frecuencia del doble de neodimio-itrio-aluminio-granate (FD-YAG) médica oftalmológica, que genera una luz láser de 532 nm. Montar el láser en una lámpara de hendidura Haag-Streit oftálmica utilizando un adaptador de láser oftálmico estándar. Este dispositivo disponible comercialmente permite la visualización simultánea de la aplicación de puntos de ojo y el láser del animal. El láser médico también tiene un haz de encuadre de enfoque apropiado y centrado usando el mismo tamaño de punto como la inducción láser. los parámetros de potencia del láser son los siguientes:
- Para la inducción rNAION rata: utilizar 500 micras punto de tamaño / 50 mW de potencia de láser / 1.000 mseg de duración / 1.000 intervalo de milisegundos.
- Para la inducción rNAION ratón: cambiar el tamaño de punto de 300 micras de disco óptico más pequeño y dejar otros parámetros el mismo que el ajuste de la rata.
- utilizan habitualmente un medidor de potencia de láser para asegurar la potencia de salida del láser.
2. Procedimiento experimental
- Encienda la potencia del lásery establecer el parámetro de láser apropiado. Calentar el láser durante al menos cinco minutos antes de su uso.
- Pesar el animal para determinar la dosis apropiada para la ketamina / xilazina y colorante RB. Anestesiar al animal mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de 1 ml / kg de 80 mg / ml de ketamina y 4 mg / ml de xilazina.
- Dejar al animal en una jaula calienta hasta que esté completamente anestesiado. Compruebe si no hay respuesta a los estímulos aversivos (o cola de arrastre del dedo del pie). Compruebe animales para la profundidad de la anestesia cada 10 min.
- Dilatar los alumnos del animal con tropicamida al 1% y anestesiar la superficie del ojo con un 0,5% proparacaına. Si el uso de animales pigmentados, tales como Long Evans, un 2,5% gotas oculares neosinefrina aumentarán dilatación de la pupila.
- Use las tijeras para cortar los bigotes cerca de la boca del cañón en el lado para ser inducidas para evitar el bloqueo de la vista.
- Ponga una gota de metilcelulosa al 1% u otra gota oftálmica de acoplamiento en el interior de la lente de contacto a medida, y luego aplicar la lente en tque los ojos de rata.
- Colocar el animal sobre una plataforma ajustado a la altura de la lámpara de hendidura. Ajuste la cabeza del animal en un ángulo de 45 °, de modo que el ojo es perpendicular a la lámpara de hendidura y el rayo láser.
- Visualizar el ojo a través de la lámpara de hendidura oftálmica. Asegúrese de que la orientación de los faros es el tamaño adecuado, así como centrado y centrado directamente en el nervio óptico visualizado. Fotografiar el fondo de la retina utilizando una cámara digital con una alta ASA (1,200 - 2,000) Velocidad montado en una de las piezas de ojo de la lámpara de hendidura con un adaptador hecho a medida.
NOTA: La capacidad de ver los vasos coroideos revela la transparencia de la retina. Esta es una señal importante con el fin de ser capaz de detectar la isquemia de retina, que puede confundir la interpretación si se produce. rNAION es la isquemia del nervio óptico, lo que resulta en la pérdida de RGC aislado, mientras que los resultados de isquemia de la retina en daño en la retina que afecta a todas las células de las capas de la retina interna. - Opcionalmente, aún más la imagen de la retina ynervio óptico utilizando un dominio de coherencia óptica espectral tomógrafo (SD-OCT 8) para evaluar el ojo no-inducida. Escanear en face (Figura 3B), así como 7 exploraciones de sección transversal a través de la retina (Figura 3C). La OCT-SD de imagen utiliza la misma lente de contacto utilizado para la inducción láser.
- Se inyecta 1 ml / kg por vía intravenosa a través de RB vena de la cola, y esperar durante 30 segundos, a continuación, activar la potencia del láser. Este retardo de tiempo permite que el RB para distribuir uniformemente a través de la circulación. Utilizamos un pulso láser de 50 mW a uno seg / pulso. Energías mayores (≥ 60 mW) pueden dañar la retina o causar isquemia vascular de la retina.
Precaución: Asegúrese de que todo el mundo tiene un par de gafas de filtrado de seguridad del láser de la longitud de onda apropiada para evitar el bloqueo de la luz láser que entren por los ojos del investigador.
NOTA: La administración láser se debe dar rápidamente después de la inyección IV RB ya que el colorante se elimina rápidamente de la circulación. Cuanto más larga sea la inducción láser, el más grave es la isquemia del nervio óptico. En general, los animales se les da 7 - 12 pulsos por segundo en una sucesión rápida. El contacto de la luz láser con el colorante circula da los vasos del nervio óptico un hermoso brillo dorado que se puede ver a través de la lámpara de hendidura (Figura 4B). Esto demuestra que el colorante se inyectó por vía sistémica y se distribuye en la corriente sanguínea. Si la luz es débil, o ninguna en absoluto (Figura 4A), el colorante no se inyectó por vía intravenosa. En este caso, no se dé una segunda inyección inmediatamente, ya que el animal tendrá que recuperar durante al menos dos días antes de la reinyección. - Inmediatamente después de la inducción, retirar la lente de contacto. Cubra ambos ojos con antibiótico oftálmico triple (Neosporin / polimixina / bacitracina) ungüento con dexametasona, y colocar al animal en un cojín de calentamiento de 37 ° C en una sola jaula alojado en observación hasta la recuperación completa.
- Limpiar la lente de contacto con agua destilada water y secar con un paño de limpieza no abrasivo para su uso futuro.
- Dos días después de la inducción evaluar el edema del nervio óptico por tanto la fotografía del fondo de color y SD-OCT análisis 8.
NOTA: comparar el grado de edema del nervio óptico da una estimación de la gravedad de la isquemia del nervio óptico. A los dos días, el margen de disco del nervio óptico es borrosa, y las venas de la retina están ligeramente dilatado, en comparación con el ojo contralateral (no inducida). Realizar el electrorretinograma (ERG) y flash potenciales evocados visuales (VEP 11) a los dos y cuatro semanas después de la inducción para el análisis electrofisiológico.
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Resultados
La visualización de lentes de contacto permitido central de la retina (Figura 1). El punto focal con láser ilumina el disco óptico en la parte posterior de la retina (Figura 2). La retina normal un-inducido se muestra fotografiada por lámpara de hendidura bio-microscopio (Figura 3A) y por SD-OCT (Figura 3B y 3C). Durante la inducción láser, cuando no hay colorante está presente en la circulación, la luz láser no da...
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Discusión
Mientras que hay un número de modelos de lesión del nervio óptico (óptica aplastamiento del nervio 12, óptica transección del nervio 13, y PION 14), el modelo rNAION es humano, adaptable a ratas y ratones. Se asemeja más a la condición clínica humana de NOINA. Esta condición incluye anterior progresiva edema del nervio óptico, un síndrome compartimental del nervio óptico anterior, isquemia focal axonal, aislado daño axonal de la retina de células ganglionares y la pérdida durante un tran...
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Divulgaciones
Los autores tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los muchos estudiantes y compañeros que han trabajado en este modelo para mejorar su eficacia, y para comprender sus mecanismos. Un agradecimiento especial al Dr de. Mary Johnson (Universidad de Maryland-Baltimore), Nitza Goldenberg-Cohen (Hospital Schneiderman niños, Petah-Tikva, Israel), Charles Zhang (Einstein Medical College, Bronx, Nueva York), y Valerie Touitou (Hopital Salpetrie, París, Francia). Este estudio fue financiado en parte por SR1 EY015304 al SLB.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Láser de 50 mW 532 nm | Láser oftálmico estándar | Iridex | |
| - 100 mW Láser de 532 nm | luminiscencia láser | Sustituto de iridex | |
| Adaptador de lámpara de hendidura láser | Iridex | SMA Adaptador acoplado para salida láser | |
| Medidor láser Fieldmate coherente con sensor de termopila | Otros | coherentes también apropiados | |
| Examen oftálmico Biomicroscopio de lámpara de hendidura | Varios | Haag-Streit es el mejor; versiones más baratas disponibles en eBay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Agente fotoinductor |
| Fondo de ojo Lente de contacto o cubreobjetos de vidrio | personalizado/Cantor y Nissel (Reino Unido) | Lente de plástico planoconvexa diseñada a medida para examen ocular e inducción | |
| Tropicamida 1% | |||
| Compuesto pulidor Tamiya | Tamiya, INC | 87068 | lente de contacto pulidora |
| 2.5% Hipromelosa (Goniovisc)/1% Metilcelulosa | Agente de acoplamiento de lentes de contacto | farmacéuticos | |
| 2.5% Neosinefrina Gotas oftálmicas Agente | dilatador | de pupila de Alcon labs | |
| Tropicamida 1% | Agente dilatador | de pupila de Alcon labs | |
| 0.5% Proparacaína | Anestésico tópico | ||
| Jeringa de insulina de aguja fusionada de 30 G | Varios | Varios | para inyección intravenosa de rosa bengala |
| Pomada antibiótica oftámica con dexametasona añadida (Ungüento antibiótico triple) | Varios | Varios | Aplicar después de la inducción para minimizar la cicatrización de la córnea |
| Heidelberg Corporation Dominio espectral-Tomógrafo de coherencia óptica | Heidelberg Corporación | para las mediciones de coherencia óptica de referencia y post-inducción; no esencial para la inducción |
Referencias
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