Artículo de método

In Situ marcaje de ADN mitocondrial de replicación en Drosophila ovarios adultos por Edu tinción

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DOI:

10.3791/54516

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15 de octubre de 2016

 , 
1Lab of Molecular Genetics, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

La ovogénesis de Drosophila sigue siendo excepcionalmente útil en el estudio de la proliferación y herencia mitocondrial. Este manuscrito describe un protocolo detallado utilizado para etiquetar el ADN mitocondrial replicante (ADNmt) en ovarios adultos de Drosophila con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), lo que facilita el descubrimiento de mecanismos asociados con la herencia mitocondrial que anteriormente eran discutibles.

Resumen

El genoma mitocondrial se hereda exclusivamente a través de la línea materna. La comprensión de cómo la mitocondria y su genoma proliferan y se transmiten de una generación a la siguiente a través del ovocito femenino es de fundamental importancia. Debido a la trazabilidad genética y a la simplicidad elegante y ordenada con la que se desarrolla el ovocito, la ovogénesis de Drosophila se ha convertido en un sistema invaluable para el estudio mitocondrial. Se utilizó un método de marcaje de EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) para detectar la replicación del ADN mitocondrial (ADNmt) en los ovarios de Drosophila. Este método es superior al método de marcaje BrdU (5-bromo-2'-desoxiuridina) en el sentido de que permite una buena preservación estructural y una penetración eficiente del tinte fluorescente en los tejidos de montaje completo.

Aquí describimos un protocolo detallado para el etiquetado de ADN mitocondrial replicante en ovarios adultos de Drosophila con EdU. Se ofrecen algunas soluciones técnicas para mejorar la viabilidad de los ovarios, mantener su salud durante la preparación y garantizar imágenes de alta calidad. La visualización del ADNmt recién sintetizado en los ovarios no solo revela el sorprendente patrón temporal y espacial de la replicación del ADNmt a través de la ovogénesis, sino que también permite una cuantificación sencilla de la replicación del ADNmt bajo diversas perturbaciones genéticas y farmacológicas.

Introducción

Además del genoma nuclear, cada célula eucariótica también contiene miles de copias de DNA circular pequeño en la matriz mitocondrial. Mientras que el ADN mitocondrial (ADNmt) codifica subunidades esenciales de la cadena de transporte de electrones, la mayoría de la proteoma mitocondrial, incluyendo todos los factores para la replicación y la transcripción del ADNmt están codificadas por el genoma nuclear. En contraste con el genoma nuclear que sigue las leyes mendelianas de la herencia, el genoma del animal mitocondrial se hereda exclusivamente a través del linaje materno. Por lo tanto, la comprensión de cómo el ADNmt se proliferó y se transmite de una generación a la siguiente a través del ovocito femenino es de fundamental importancia. Sin embargo, hay un continuo debate sobre la forma en la replicación del ADN mitocondrial se regula en la línea germinal femenina. Además, la teoría de cuello de botella ADNmt ampliamente aceptada para la transmisión de ADNmt sugiere que la población de ADNmt en las células germinales primordiales se submuestreada a un número relativamente pequeño during 1 2 desarrollo. También implica que la replicación del ADNmt es temporal y espacialmente regulado durante la ovogénesis. Por lo tanto, la detección in situ de la replicación del ADNmt durante el desarrollo de la línea germinal facilitará la comprensión del mecanismo de ADNmt herencia.

Drosophila ovogénesis proporciona un sistema manejable de forma genética para estudiar la replicación del ADN mitocondrial y la transmisión. En cada uno de los dos ovarios de Drosophila, hay 16-20 cadenas independientes de cámaras de huevos llamados ovarioles 3, que son las unidades funcionales de la producción de huevos (véase la Figura 1A). Cada ovariole contiene una organización lineal progresiva de la ovogénesis, donde la punta anterior se compone de una estructura llamada germarium. El germarium se divide en cuatro regiones que contienen células germinales en las etapas de desarrollo distintas. En la región 1, las células madre de línea germinal pasan por división asimétrica para producir células hijas conocidas como cystoblasts. Región 2a contiene los cystoblasts que han completado su división final. Cystoblasts someten a cuatro rondas de grupos de 16 células productoras de división. Las células 16 permanecen conectados entre sí por puentes citoplasmáticos llamados canales de anillo. Sólo una de las células se compromete a la diferenciación como el ovocito, mientras que el otro 15 se desarrollan como células de la enfermera poliploides. Una estructura citoplasmática esencial, conocido como fusome, se propone facilitar con la formación de canales en el anillo, determinar la polaridad del quiste y la enfermera las interacciones célula-ovocito 4,5. A medida que los quistes se mueven hacia la región 2b, las estructuras de quistes abarcan toda la anchura de la germarium, y se vuelven más asociados con las células del folículo. Las estructuras germarium terminan con la región 3 que contiene la primera cámara de huevos en ciernes. Posteriormente, las cámaras de huevos se montan en el extremo posterior de la germarium, que se avanza a través de la ovariola en 14 etapas morfológicamente distintos. El crecimiento de los ovocitos depende de las células de la enfermera, whproteínas de transporte ich, ARNm y estructuras endomembrane (por ejemplo, Golgi) a través de los canales de anillo en el ovocito. Durante la ovogénesis Drosophila, se encontró que una fracción de las mitocondrias dentro de cada quiste de 16 células se asociaron con la fusome, mueve a través de los canales de anillo y se dieron en el único oocito en una gran masa llamada cuerpo Balbiani 6. Se propuso Este fenómeno de contribuir al control de calidad de la herencia mitocondrial a través de ovarios femeninos.

La detección de la síntesis de ADN mitocondrial se basa en la incorporación de precursores de ADN marcados en el ADN celular. Tradicionalmente, se utiliza un análogo de nucleósido de timidina 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) para etiquetar la replicación del ADNmt en las células de cultivo de tejidos 7,8. Sin embargo, el etiquetado BrdU basada en anticuerpos presenta varias limitaciones, especialmente para la tinción de tejidos todo el montaje. Una desventaja importante de etiquetado BrdU es que requiere la desnaturalización del ADN para exponerel epítopo BrdU, de modo que pueda ser detectada por el anticuerpo anti-BrdU. Este ejemplar ha de ser tratado en condiciones de desnaturalización agresivos, tales como productos químicos (por ejemplo, ácido clorhídrico o mezclas de metanol y ácido acético), el calor, o la digestión con DNasa, lo que podría alterar la estructura de la muestra y complicar el procedimiento de tinción 9, 10.

Aquí, un análogo de la timidina alternativa 5-etinil-2 'desoxiuridina (EDU) se utiliza para etiquetar el ADN mitocondrial replicarse en ovarios adultos de Drosophila. Este método es más rápido y altamente sensible. EdU se incorpora fácilmente en el ADN celular durante la replicación del ADN. La siguiente detección se basa en una reacción de "clic", un Cu (I) catalizada reacción covalente entre el grupo alquino terminal y una azida fluorescente 10. Debido a que la reacción no requiere la desnaturalización de la muestra, que permite una buena conservación estructural. Además, el tamaño de tinte unazide es solamente 1/500 de la de una molécula de anticuerpo 10, que permite la penetración rápida y eficiente de los tejidos de todo el montaje. Hemos utilizado este método para detectar la replicación del ADN mitocondrial durante la ovogénesis Drosophila y se encontró un patrón espacial llamativa en la región germarium de Drosophila ovario 11, lo que nos lleva a proponer un mecanismo de herencia ADNmt selectiva dependiente de la replicación. Presentamos aquí un protocolo detallado sobre el etiquetado EdU de la replicación del ADN mitocondrial en Drosophila ovarios. Para demostrar la aplicación del protocolo, también a prueba la replicación del ADNmt en un ADNmt mutante Drosophila (MT: COI T300I) 11, así como con el tratamiento diverso de desacopladores mitocondriales, que disipan el potencial de membrana mitocondrial y potencialmente interrumpen la replicación del ADNmt.

Protocolo

1. Tejido Recogida y disección

  1. En cada vial contiene levadura seca, cultivo de 10 hembra adulta vuela con 10 hombres por 2-3 días.
    Nota: El mantenimiento de las moscas hembras bien alimentados mejorará la calidad global y el rendimiento de la producción de ovario y facilitar la disección.
  2. Anestesiar la hembra vuela en un dióxido de carbono (CO2) de la almohadilla de volar.
  3. Bajo el estereoscopio, coloque varias gotas de medio de RT (medio de Drosophila de Schneider suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS)) sobre una almohadilla de disección. Llevar a cabo todos los procedimientos de disección en el medio para mantener los tejidos vivos y sanos.
  4. Coge una hembra vuela engordados con unas pinzas finas afilados de nariz en su parte inferior del tórax. Utilice otro juego de pinzas para tirar suavemente en el extremo posterior de la marcha hasta que los tejidos en el abdomen están expuestos. Separar los dos ovarios de otros tejidos (por ejemplo, las tripas).
    Nota: Cada ovario muestra una estructura opaca que se compongad de 16-20 ovariolas adjuntos.
  5. Para mejorar la penetración de los reactivos, abrir los ovarios mediante tracción y pasando la punta de la pinza entre cada ovariola un par de veces. Mantener los ovarioles conectados dentro de un ovario para minimizar la pérdida de los tejidos durante los procedimientos siguientes.
  6. La transferencia de los ovarios inmediatamente a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 l de medio de Drosophila de Schneider con 10% de FBS.
  7. Repita la disección y recoger 10-15 ovarios en cada tubo de microcentrífuga.

2. El etiquetado EdU

  1. Aspirar el medio en cada tubo, y reemplazar con 500 l de medio de Drosophila de Schneider con 10% de FBS que contiene 7 afidicolina M.
    Nota: afidicolina se utiliza para bloquear la síntesis de ADN nuclear mediante la inhibición de la ADN polimerasa α sin afectar la replicación del ADNmt 7, 12. Es posible aumentar la concentración a afidicolina hastaa 70 mM para conseguir una mejor inhibición. La solución madre de afidicolina 3-30 mM en DMSO se puede almacenar en la oscuridad a -20 ° C durante un máximo de 6 semanas.
  2. Para mantener los ovarios sanos, asegúrese de que están inmersos en virtud de las soluciones mientras se cambia el medio. Utilice medio de Drosophila de Schneider con 10% de SFB al paso 2.6.
  3. Incubar los ovarios durante 3 horas a temperatura ambiente en un agitador de sobremesa con una rotación suave.
    1. Para el tratamiento de drogas, por ejemplo, mitocondrial carbonilo desacoplador cianuro fenilhidrazona 4-trifluorometoxi (FCCP), añadir la concentración apropiada de fármaco (por ejemplo, 10 M FCCP) en el medio después de 2 h de tratamiento afidicolina. Continuar la incubación durante otra 1 hr.
  4. Retire el medio que contiene afidicolina con o sin drogas. Brevemente enjuagar los ovarios con medio (afidicolina no es necesario) dos veces.
  5. Añadir 1 ml que contiene 10 mM Edu y 7 afidicolina M medio y continuar incubating a temperatura ambiente durante 2 hr. Almacenar el EdU mM solución de 10 stock (en DMSO) a -20 ° C.
  6. Retire el medio que contiene Edu y afidicolina. Lavar con medio (sin afidicolina) dos veces durante 3 minutos cada uno.

3. Tejido de fijación y permeabilización

  1. Preparar una solución de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4).
    Nota: Se utilizó paraformaldehído comercial disponible almacenada en ampollas pre-marcado. Abrir una nueva ampolla y se diluye hasta 4% antes de su uso.
    PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico; Se debe manipular en una campana extractora con la piel y los ojos.
  2. Fijar ovarios con 4% de paraformaldehído durante 20 min a TA con una rotación suave.
  3. Retire el fijador y lavar ovarios dos veces en 1 ml de 3% de BSA en PBS durante 5 min cada vez.
  4. Para permeabilizar los tejidos, eliminar la solución de lavado y se añade 1 ml de 0,5% Triton X-100 en PBS. Incubar a TA durante 20 min.
  5. Eliminar la solución de permeabilización y lavar dos veces en 1 mlde BSA 3% en PBS.

4. Detección EdU

Nota: EdU detección se basa en la química "clic", un Cu (I) catalizada [3 + 2] cicloadición 13, que añade azidas fluorescentes para el grupo alquino terminal de EdU, y la molécula fluorescente se somete a posterior detección. Desde Cu (I), que se oxida fácilmente a la especie no catalíticos Cu (II), que se requiere para catalizar la reacción, se recomienda reducir el sulfato de Cu (II) in situ para obtener Cu (I). Es decir, Cu sulfato (II) se utiliza en presencia de un reductor tal como ácido ascórbico (en adelante el "buffer aditivo") para generar de cobre (I).

  1. Antes del experimento, preparar la solución de trabajo de la azida Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 azida, Alexa Fluor 555 azida u otros, dependiendo del fluoróforo preferida, que se denomina como "tinte azida" en lo sucesivo), tampón de reacción EdU y tampón EdU aditivo de acuerdo con el fabricante delinstrucciones.
    1. Reconstituir la azida colorante en DMSO 70 l. Almacenar la solución de trabajo a -20 ° C hasta por 1 año.
    2. Preparar tampón reciente reacción EdU diluyendo el tampón de reacción 10x EdU con agua desionizada.
      Nota: Después de usar, almacenar cualquier solución 1x restante a 4 ° C. La solución 1x es estable durante un máximo de 6 meses.
    3. Hacer una solución 10x del aditivo tampón EdU disolviendo completamente el polvo en 2 ml de agua desionizada.
      Nota: Esta solución madre es estable durante hasta 1 año a -20 ° C. Si la solución desarrolla un color marrón, que se ha degradado y debe ser desechado.
  2. Preparar el cóctel de reacción EdU nuevo cada vez, y utilizar dentro de los 15 minutos de preparación. Para obtener resultados reproducibles, asegúrese de que los componentes de la reacción se mantienen en las mismas proporciones.
    1. Hacer fresca 1x tampón EdU solución aditiva diluyendo la solución de 10x (preparado en el paso 4.1.3) 1:10 en agua desionizada. Utilice este sOlution en el mismo día.
    2. Preparar 1 ml de cóctel EdU reacción mediante la combinación de los siguientes ingredientes en este orden: 860 l 1x EdU tampón de reacción, 40 l CuSO 4, 2,5 l de azida de tinte, 100 l 1x EdU aditivo tampón.
      Nota: Es importante que los ingredientes se añaden con el fin de garantizar un rendimiento óptimo.
  3. Retire el PBS con BSA al 3% y añadir 0,5 ml de cóctel de la reacción EdU a cada tubo. Incubar a TA durante 30 min con rotación suave. Mantener las muestras protegidas de la luz.
  4. Retire el cóctel de reacción EdU y lavar una vez con 1 ml de BSA al 3% en PBS.
  5. Lavar las muestras una vez con 1 ml de PBS.

5. El anticuerpo etiquetado

Nota: Realice el etiquetado de anticuerpos después de la tinción edu. Si no se desea la tinción adicional, se puede proceder a la de montaje y de formación de imágenes directamente. Es importante que las muestras se protegieron de la luz en todos los siguientes procedimientos.

  1. Eliminar la solución de lavado. Bloquear los ovarios en 1 ml de solución de bloqueo que contiene 0,2% de BSA y 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 30 min.
  2. Retire la solución de bloqueo y reemplazar con el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo (por ejemplo, ATP sintasa ratón subunidad α anticuerpo, dilución 1: 1.000). Incubar en la oscuridad a 4 ° CO / N.
  3. Lavar las muestras con 1 ml de solución de bloqueo 3 veces, 10 min cada vez. Para minimizar el fondo, se lava dos veces más durante 30 minutos cada uno. Retire la solución de bloqueo.
  4. Incubar con anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo (por ejemplo, cabra anti-ratón de Alexa Fluor 568 anticuerpo secundario, dilución 1: 200) durante 2 horas a RT.
    Nota: Utilice un color diferente que el que junto a edu.
  5. Repita los pasos de lavado realizados en el paso 5.3.
  6. Enjuague con 1 ml de PBS una vez para eliminar el detergente.

6. Montaje e Imagen

  1. Retirar con cuidado todo el PBS y immediately cubrir ovarios con 50 l de medio de montaje (con o sin DAPI).
    Nota: Utilice un medio de montaje que no se endurece mientras que los ovarioles están siendo separados unos de otros. Los ovarios se pueden almacenar en el medio de montaje a 4 ° C durante un máximo de una semana.
  2. Corte el extremo de una punta de pipeta y utilizarla para transferir los ovarios con cuidado sobre un portaobjetos de microscopio.
  3. Completamente separado cada ovariola con unas pinzas finas, nariz afilada bajo el microscopio estereoscópico. Extraer los tejidos de conexión en el extremo posterior y la etapa 14 o cámaras de huevos maduros. Las cámaras de huevos pequeños están en el extremo anterior y transparente.
  4. Alinear las cámaras de huevo con fórceps de manera que no se superpongan entre sí.
  5. Lentamente baje un cubreobjetos de vidrio # 1.5 en la parte superior de las muestras. Permitir que el medio de montaje para polimerizar durante varias horas a TA. Sellar con esmalte de uñas transparente.
  6. Foto se desliza al día siguiente, o se almacena a 4 ° C antes de la imagen.
  7. Visualizar bajo un mi confocalcroscope con un objetivo de inmersión en aceite 63X. Capturar imágenes tridimensionales Z-pilas.
    Nota: Hay una fuerte señal EdU en una etapa más avanzada cámaras de huevos y la fluorescencia de fondo en la vaina epitelial. Al examinar el etiquetado EdU en un germarium en particular, se debe evitar germariums que se solapan ni está cerca de otros tejidos o cámaras de huevos de etapa posterior.

Resultados

El protocolo anterior permite la visualización de las estructuras punteadas asociados con las mitocondrias (Figura 1B-C), que indican la replicación del ADN mitocondrial durante la ovogénesis Drosophila. Los puntos lagrimales EdU localizada con mitocondrias marcados por tinción para ATP sintetasa subunidad alfa (Figura 2). Las señales observadas estaban ausentes en los ovarios tratados con bromuro de etidio 11, un inhibidor de la replicación del ADNmt 14, la validación de que estos puntos lagrimales de hecho etiqueta replicar mtDNA.Aphidicolin se utilizó para inhibir la tinción de ADN nuclear sin afectar a la replicación de ADN mitocondrial (Figura 2). Sin tratamiento afidicolina, intensas señales EdU etiquetar los núcleos, y ADNmt puntos lagrimales apenas se detectaron (Figura 3). Sin embargo, en presencia de afidicolina, la incorporación nuclear se redujo drásticamente y se observaron muchos puntos lagrimales asociados con las mitocondrias.

Hay un alto nivel de replicación del ADNmt en cámaras de huevos post-germarium (Figura 1B). Sin embargo, sobre todo, la replicación del ADNmt muestra un patrón espacial en el germarium. Como se indica por el número de puntos lagrimales EdU, hay un nivel moderado de la replicación del ADNmt en la región 1 de la germarium, pero casi no incorporación EdU en la región 2A (Figura 1C). A medida que el quiste se mueve hacia abajo a la región 2B en el germarium, la replicación del ADNmt se reanuda y el número de puntos lagrimales EdU en el quiste posterior de la región de 2B era mucho más alta que en la región 2A (Figura 1C). En concreto, la incorporación intensiva EdU se concentró alrededor de los canales de llamada y las estructuras fusome, como manchado por el Li Tai Hu Shao (HTS) de proteínas. ADNmt mantiene replicar a un alto nivel en la región 3 de la germarium (Figura 1C)

Para demostrar la asociación de specifgenes o el tratamiento con la proliferación ADNmt ic, ovarios Drosophila podrían ser objeto de manipulación genética o tratamiento farmacológico. Se han tratado los ovarios con diferentes concentraciones de FCCP, un protonóforo mitocondrial clásico, que disipa el potencial de membrana mitocondrial. Como control, DMSO no tuvo ningún efecto sobre la replicación del ADNmt (Figura 4A). Las dosis altas de FCCP (10 M) están casi agotadas por completo la replicación del ADNmt en todo el germarium (Figura 4D). No obstante, la menor concentración de FCCP (2 ó 5 M) tuvo un impacto menor en la replicación del ADNmt en la región 1, pero inhibió la replicación en las regiones 2B y 3 (Figura 4B-C), lo que sugiere regiones 2b y 3 son más sensibles a la alteración mitocondrial, o mantienen relativos cinética de replicación más lentas. Los resultados anteriores indican que la replicación del ADNmt está asociada con la actividad mitocondrial. En particular, diferentes regiones de la germarium respondieron de manera diferente a imp mitocondrialairment.

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Figura 1. replicación del ADNmt durante la ovogénesis Drosophila. (A) Diagrama de un ovariole Drosophila y una vista ampliada de la germarium. El ovariola ilustra de izquierda a derecha, anterior a posterior, algunas etapas del desarrollo de cámaras de huevos. En el germarium, se muestra la fusome (rojo), las células madre de línea germinal (azul), las mitocondrias (verdes), los ovocitos futuro (línea punteada, reconocido por el posicionamiento, la estructura fusome y grupos mitocondriales), el desarrollo de quistes (melocotón) y cuatro regiones de desarrollo . (B) Representante de proyección z-pila de un ovariola de tipo natural marcado por Edu y el anticuerpo contra la HTS-RC, un marcador de canales de llamada y fusome. En presencia de afidicolina, la EdU se incorporó en el ADNmt (puntas de flecha) y los núcleos (flechas). Barra de escala, 10 micras.(C) Vista ampliada del germaria esbozados en la región en caja en B. Las cuatro regiones de desarrollo se indican. Barra de escala, 5 micras 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. replicación del ADNmt en el germarium Drosophila se visualizó mediante la incorporación EdU con el tratamiento afidicolina (A) -. (D) sección confocal Representante de un germarium tipo salvaje que muestra EdU incorporación (verde, b), las mitocondrias, marcada por la ATP sintasa alfa tinción subunidad (rojo, C), y los núcleos, marcado con tinción DAPI (azul, D) con pre-incubación con afidicolina DNA inhibidor de la polimerasa-α. (A &# 39; -D ') Una imagen ampliada del área de caja en (A) que muestra EdU incorporación (B'), las mitocondrias (C ') y núcleos (D'). En presencia de afidicolina, la incorporación nuclear (flechas) se reduce y muchos puntos lagrimales se localiza dentro de las mitocondrias (puntas de flecha). Las barras de escala, 10 m. La figura ha sido modificado a partir de 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. replicación del ADNmt apenas se detectó en el germarium Drosophila sin tratamiento afidicolina (A) -. (D) sección confocal Representante de un germarium tipo salvaje que muestra EdU incorporación (verde), las mitocondrias, marcada porLa ATP sintasa tinción subunidad alfa (rojo), y los núcleos, marcado con tinción DAPI (azul) en ausencia de la afidicolina DNA inhibidor de la polimerasa-α. "Una imagen ampliada del área de caja en (A) que muestra EdU incorporación (B (A'-D) '), las mitocondrias (C') y núcleos (D '). Sin afidicolina, intensas señales EdU etiqueta núcleos (flechas), y puntos lagrimales ADNmt apenas se detectan. Las barras de escala, 10 m. La figura ha sido modificado a partir de 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. mitocondrial desacoplador deteriora la replicación del ADNmt. Proyectos pila Z representativo que muestra de tipo salvaje germarium tratados con DMSO(A) o el desacoplador FCCP mitocondrial a concentraciones de 2 mM (B), 5 mM (C), 10 mM (d) durante EdU incorporación. Tenga en cuenta el deterioro de etiquetado EdU en la región 2B tratado con 2 M FCCP (B), y tanto en la región 2B y 3 tratados con 5 M FCCP (esbozado en cajas). Se muestran cuatro regiones de desarrollo. Flechas, el ADN nuclear; puntas de flecha, el ADNmt. Barra de escala, 10 micras. La figura ha sido modificado a partir de 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

etiquetado EdU es un novedoso y eficiente método para detectar la síntesis de ADN en células proliferantes, que se basa en la incorporación y la tinción de análogos de nucleósidos en el ADN recién sintetizado. Este método es superior al método de etiquetado BrdU en que es más rápido y altamente sensible. Más importante aún, permite una buena conservación estructural y la penetración EdU-dye eficiente de todo el montaje tejidos 9, 10. Históricamente, como una alternativa superior a BrdU etiquetado, etiquetado EdU se utilizó para estudiar la replicación del ADN nuclear durante la fase S de la ciclo celular. Afidicolina es un inhibidor de la ADN polimerasa α, que es la principal de la polimerasa para la replicación del ADN nuclear en la fase S 12 15. la replicación del ADNmt se lleva a cabo por γ ADN polimerasa, que es insensible a afidicolina tratamiento. Por lo tanto, el tratamiento con afidicolina antes de y durante la incubación EdU inhibió significativamente EdU incorporación en el ADN nuclear. Deberíase observó que afidicolina puede ser estable durante varias semanas si se almacena adecuadamente, y la eficacia de afidicolina en la inhibición de la replicación del ADN nuclear fue variable en nuestras manos. Los ovariolas o cámaras de huevos con un fuerte marcaje de ADN nuclear deben ser excluidos de los análisis de datos adicionales.

la replicación del ADNmt puede ser visualizado fácilmente como puntos lagrimales en el citoplasma, que también ofrece una forma sencilla de cuantificar el nivel de la replicación del ADNmt contando el número de puntos lagrimales EdU, normalizado con el volumen total de citoplasma. software de imágenes se puede aplicar para identificar automáticamente los puntos lagrimales EdU en imágenes microscópicas, lo cual es especialmente útil para el análisis computacional de grandes conjuntos de datos. Sin embargo, se deben tomar precauciones, debido a la inhibición incompleta de la replicación del ADN nuclear puede dar lugar a la incorporación EdU en distintos loci en el cromosoma y aparecer como puntos lagrimales en el interior del núcleo. También en otros casos, la intensidad de EdU incorporación en replicando ADNmt podría ser débil, mientras que el fondo y el ruido podrían ser altos. Por lo tanto, los parámetros individuales para análisis automático de imágenes deben ser cuidadosamente definidos. También se recomienda que las imágenes deben ser examinados con los ojos entrenados para asegurarse de que los puntos lagrimales adecuada EdU se identifican.

La visualización de ADNmt recién sintetizado durante la ovogénesis Drosophila ofrece la oportunidad de investigar la forma en la replicación del ADN mitocondrial se regula en condiciones fisiológicas o patológicas, al llevar a cabo el experimento en las moscas de sometidas a una variedad de perturbaciones farmacológicos o genéticos. En un estudio anterior, ensayo de incorporación de EdU se realizó en un ADNmt mutante Drosophila MT: COI T300I 11. Además, para interrumpir el potencial de membrana mitocondrial, los ovarios fueron tratados con varias concentraciones de desacoplador FCCP mitocondrial o 2,4-dinitrofenol (DNP) antes de la incorporación EdU. Dependiendo de los fines experimentalesy las características de la droga, diferentes métodos podrían ser adoptadas para la entrega efectiva. Para las moscas adultas, los medicamentos pueden presentarse en forma de vapor (por ejemplo, etanol y cocaína) 16,17 o medicamentos se pueden inyectar en el abdomen, donde se difunde rápidamente a través del cuerpo 18. La práctica más común es que los fármacos se añaden a la comida mosca o un papel de filtro de sacarosa / saturada con las drogas. Por ejemplo, el inhibidor de ensamblaje de los microtúbulos, la colchicina, se alimentó a las moscas durante 2-3 días antes de la disección de ovario 19. Por lo tanto, es importante para evaluar el método de administración de fármacos y elegir concentraciones apropiadas.

Para garantizar el éxito de imagen de la replicación del ADN mitocondrial en Drosophila ovarios, varios pasos críticos deben ser cuidadosamente ejecutados. Ante todo, preservar la viabilidad y la salud de los ovarios durante la disección y la incorporación a Edu esenciales (pasos 1 y 2). Medio Drosophila de Schneider con FBS necesita ser calentado a RTantes de usar. Se debe minimizar el contacto directo entre las cámaras de huevos y herramientas de disección o puntas de pipeta. Los ovarios se deben sumergir en virtud de soluciones todo momento para evitar la deshidratación. El mal manejo de los tejidos puede conducir fácilmente a desmayarse o no hay señales fluorescentes. Durante la etapa de montaje de tejido, ovarioles deben estar separados el uno del otro y se extienden sobre el portaobjetos de microscopio. Asegúrese de que las cámaras de huevos no están apiladas una encima de la otra. Nos dimos cuenta de que las cámaras de huevos más allá de la etapa 14 muestran poca incorporación edu. Además, debido al tamaño grande, las cámaras de huevo etapa tardía a menudo hacen que las cámaras de huevos más pequeños vecinos sean fuera de foco. Por lo tanto se recomienda que se descartarán las cámaras etapa de huevo finales.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el etiquetado de replicación del ADNmt en los ovarios adultos de Drosophila. Este método permite la cuantificación sencilla de la replicación del ADNmt en diversas perturbaciones genéticas y farmacológicas,y será útil para diseccionar los mecanismos que subyacen a la biogénesis mitocondrial de desarrollo y la herencia del ADNmt.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a K. Delaney por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo del Programa Intramuros del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Schneider' s Drosophila mediumInvitrogen21720-024
FBSInvitrogen10100-147
Par de pinzas Dumont #5Fine Science Tools11252-20
AphidicolinSigmaA0781Aliquot después de disolverse en DMSO. Evite la descongelación y congelación repetitivas. Protégete de la luz. Se puede usar dentro de las 6 semanas posteriores a la disolución.
FCCPSigmaC2920
DMSOSigmaD2650
Paraformaldehído, 16% EM gradoEM Ciencias de la Microscopía Electrónica15710El formaldehído es tóxico; debe manipularse en una campana extractora con protección para la piel y los ojos.
PBSKD MedicalRGF-3190
BSASigmaA7030
Triton X-100SigmaT9284
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitInvitrogenC10337EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azida, tampón de reacción EdU y aditivo tampón Edu
están incluidos Subunidad de ATP sintasa de ratón y anticuerpo alfa; (15H4C4)MitoSciencesAb14748dilución 1:1.000
Anticuerpo Hts de ratón (clon RC)Estudios del desarrollo Banco de hibridomas (DSHB)Dilución de hts RC1:1.000
Anticuerpo secundario anti-ratón Alexa Fluor 568InvitrogenA-11004Dilución 1:200
Medio de montaje Vectashield con DAPIVector LaboratoriesH-1500
Cubreobjetos de vidrio, #1.5 22 mm x 22 mmFisher Scientific12-541-B
Portaobjetos de microscopioFisher Scientific22-038-103
Esmalte de uñasElfMuchos de los pigmentos utilizados en los esmaltes de uñas son fluorescentes y se filtran en las muestras. Solo se debe usar esmalte de uñas transparente.

Referencias

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