Se describe una sólida estrategia de sustitución de genes para manipular genéticamente el hongo Ustilago maydis carbón. Este protocolo explica cómo generar mutantes de deleción para investigar fenotipos de infección. Se puede extender para modificar genes de cualquier manera deseada, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia que codifica un marcador de proteína fluorescente.
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Artículo de método
La manipulación genética del patógeno de la planta
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En este artículo
Resumen
Resumen
supresión de genes juega un papel importante en el análisis de la función génica. Uno de los métodos más eficaces para interrumpir genes de una manera dirigida es la sustitución de la totalidad del gen con un marcador seleccionable a través de recombinación homóloga. Durante la recombinación homóloga, el intercambio de ADN se lleva a cabo entre las secuencias con alta similitud. Por lo tanto, las secuencias genómicas lineales que flanquean un gen diana se pueden utilizar para dirigir específicamente un marcador seleccionable para el sitio de integración deseado. Los extremos romos de la construcción de deleción activan sistemas de reparación del ADN de la célula y de ese modo promover la integración de la construcción, ya sea a través de recombinación homóloga o por no homóloga de extremo de unión. En los organismos con recombinación homóloga eficiente, la tasa de éxito de la deleción del gen puede alcanzar más de 50% haciendo de esta estrategia de un sistema de interrupción de genes valiosos. El hongo Ustilago maydis es carbón de un microorganismo eucariota modelo que muestra tales recombinantes, homóloga eficienteion. Fuera de sus cerca de 6.900 genes, muchos se han caracterizado funcionalmente con la ayuda de mutantes de deleción, y el fracaso de sustitución de genes puntos repetidos intentos en función esencial del gen. caracterización posterior de la función del gen mediante el etiquetado con marcadores fluorescentes o mutaciones de dominios predichos también se basa en el intercambio de ADN a través de recombinación homóloga. A continuación, presentamos la U. maydis estrategia de generación de la tensión en detalle utilizando el ejemplo más simple, la deleción del gen.
Introducción
Ustilago maydis es un modelo de hongo fitopatógeno que se ha estudiado ampliamente durante décadas 1,2. Existe en dos morfologías, una etapa similar a la levadura, no patógena y un filamentosos, forma infecciosa 3. Descubrimientos importantes universales, como los mecanismos de recombinación y reparación del ADN homólogas se hicieron en la etapa de crecimiento similar a la levadura de este hongo 4. Por otra parte, el interruptor morfológica de los filamentos y factores de virulencia infecciosas importantes para la infección son bien caracterizado 5,6. El conocimiento acerca de la biología molecular creciente y la v....
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Protocolo
1. Generación de constructos de deleción
- Generar un plásmido que contiene la construcción de deleción (Figura 1) que comprende un respectivo 1 kb aguas arriba del flanco (UF) y el flanco corriente abajo (DF) cada uno y el casete de resistencia apropiada, flanqueada por sitios de restricción de corte romos.
NOTA: Cualquier estrategia de clonación se puede utilizar (para la clonación véase la referencia 22) recomendamos Golden Gate clonación de tales plásmidos 9. - Extirpar la eliminación construcción del plásmido usando un cortador romo para obtener 1 g de ADN de la supresión construir 9. Se p....
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Resultados
Las construcciones de deleción para los cuatro genes quitinolíticas codificados en la U. maydis genoma fueron generados por clonación Golden Gate de utilizar la cinta para la eliminación de HygR CTS1, el NATR para la eliminación de CTS2, el casete G418r para la eliminación de cts3 y la CBXR para la eliminación de cts4 20. Una visión general de la estrategia de sustitución de genes se ejemplifica m.......
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Discusión
Este protocolo se describe cómo generar mutantes de deleción para estudios de genética inversa en U. maydis. El punto de partida es una construcción de deleción que contiene secuencias flanqueantes del gen de interés que contiene secuencias de aproximadamente 1 kb aguas arriba del inicio y aguas abajo del codón de parada, así como un casete de resistencia apropiada, ya que estaba previamente optimizado 7,9 . Las construcciones que se han generado de forma individual para cada gen y verificado cuidado.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Un agradecimiento especial al Dr. Benedikt Steuten para la lectura crítica del manuscrito. El trabajo original sobre las quitinasas se llevó a cabo por el Dr. Thorsten Langner. El laboratorio de VG es apoyado por el Cluster de Excelencia en Ciencias de las Plantas (CEPLAS, DFG EXC 1028) y BioSC, el laboratorio de KS es apoyado por BioSC. KB es apoyado por BioSC. Las actividades científicas del Centro de Ciencias de Bioeconomía (BioSC) fueron apoyados económicamente por el Departamento de Innovación, Ciencia e Investigación, en el marco de la NRW Strategieprojekt BioSC (Nº 313 / 323-400-00213). LF es apoyado por una beca de doctorado de la DFG Grupo Internacional de F....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido aminobenzoeico (ácido libre) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | utilice alternativamente el proveedor local |
| Bacto peptona | BD 211677 | utilice alternativamente | |
| el extracto de levadura Bacto del proveedor local | BD | 212750 | utilice alternativamente el proveedor local |
| CaCl2*2H2O | Grü ssing GmbH | 10234 | utilice alternativamente el proveedor local |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Ácidos de Casamino | BD | 223050 | |
| Colircloruro | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Ácido cítrico | ChemSolute | 24,321,000 | alternativamente use el proveedor local |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternativamente use el proveedor local |
| D(+)Sacarosa | Roth | 4621.1 | alternativamente utilice el proveedor local |
| ADN degr. ácido libre | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grü ssing GmbH | 10288 | utilice alternativamente el proveedor local |
| Geneticin (G418) sal de disulfato | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma enzimas lisantes Sigma | Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucosa | Caelo | 2580 | o utilice alternativamente el proveedor local |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | utilizar alternativamente el proveedor local |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Consulte las instrucciones de seguridad del fabricante. |
| Sal sódica de heparina | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Higromicina B-solución | Roth | 1287.2 | Sustancia peligrosa. |
| KCl | VWR | 26764298 | utilizar alternativamente el proveedor local |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | o utilizar alternativamente el proveedor local |
| MgSO4 sin agua | Merck | 7487-88-9 | ausencia de agua es fundamental. Alternativamente, utilice el proveedor local |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternativamente utilice el proveedor local |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | o utilice alternativamente el proveedor local |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | utiliza alternativamente el proveedor local |
| Na2SO4 | Grü ssing GmbH | 12174 | alternativamente el proveedor local |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | utilizar alternativamente el proveedor local |
| NaOH | ChemSolute | 13.751.000 | utilizar alternativamente el proveedor local |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | utilizar alternativamente el proveedor local |
| Ácido nicotínico (ácido libre) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Sulfato de dihidrógeno de nuresteotricina | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Caldo de nutrientes | Proveedores locales | de Difco | |
| Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Sustancia peligrosa. Consulte las instrucciones de seguridad del fabricante. |
| polietilenglicol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Acetato de potasio | AppliChem | 121479 | utilizar alternativamente el proveedor local |
| Pyridoxin (monoclorhidrato) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavina | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | use |
| la jeringa pequeña | del | 300300 | alternativamente use |
| filtro estéril del proveedor local, 22 y micro; m | VWR | 28145-477 | utilice alternativamente el proveedor local |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternativamente el proveedor local |
| clorhidrato de tiamina | Serva | 36020.02 | utilice alternativamente el proveedor local |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | utilice alternativamente el proveedor local |
| Tris- (hidroximetil) aminometano | VWR | 103156X | utilice alternativamente el proveedor local |
| de clorhidrato Tris | Roth | 9090.4 | utilice alternativamente el proveedor local |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternativamente el proveedor local |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | utilizar alternativamente el proveedor local |
| Composición de las soluciones/preparación del material | Composición de las soluciones | ||
| Stock de carboxina | : 5 mg/ml en metanol, concentración final: 2 µ g/ml | ||
| Placas CM | 0,25 % (p/v) Ácidos Casamino, 0,1 % (p/v) Extracto de levadura, 1,0 % (v/v) Solución vitamínica Holliday, 6,25 % (v/v); Solución salina de Holliday, 0,05 % (p/v) de ADN degr. ácido libre, 0,15 % (p/v) de NH4NO3, 2,0 % (p/v) de agar Bacto; ajuste a pH 7.0 usando NaOH 5 M; Después de esterilizar en autoclave, agregue 1 % de glucosa | ||
| Genética (G418) | Stock: 50 mg/ml en H2O, concentración final: 500 y micro; g/ml | ||
| de HCl Perlas de vidrio lavadas (0,35-0,45 mm) | Cubra las perlas de vidrio con HCl concentrado (25 %, 7,8 M) e incube durante 60 min. Balancee varias veces. Decantar HCl (mantener el líquido decantado) y lavar las perlas de vidrio con 3 M HCl (mantener el líquido decantado). Lave las perlas de vidrio varias veces con H2O de doble destilación hasta que el pH sea 7 (el líquido ya no debe ser amarillo-verdoso). Alícuota las cuentas de vidrio y sécalas a 180 °C. El HCl decantado debe neutralizarse antes de su eliminación. | ||
| Stock de heparina | : 15 mg/ml | ||
| solución | 16.0 ‰ (s/v) KH2PO4, 4.0 y permil; (s/v) Na2SO4, 8.0 y permil; (s/v) KCl, 1.32 y permil; (s/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) oligoelementos, 2.0 y permil; (s/v) MgSO4; filtrado estéril | ||
| solución vitamínica Holliday | 0.1 y permil; (s/v) Tiamina, 0,05 y por mil; (s/v) Riboflavina, 0,05 y permil; (s/v) Piridoxina, 0,2 y permil; (s/v) Ca-Pantothenat, (0,05‰ (s/v) Ácido aminobenzoeico, 0,2 y permil; (s/v) Ácido nicotínico, 0,2 y permil; (s/v) Cloruro de colincloruro, 1.0 y permil; (w/v) mio-Inositol; se puede almacenar a -20 & grados; C | ||
| Stock de higromicina | : 50 mg/ml en PBS, concentración final: 200 y micro; g/ml | ||
| Stock de Nourseotricina | : 200 mg/ml en H2O, concentración final: 150 y micro; g/ml | ||
| NSY-glicerol-medio | 0,8 % (p/v) Caldo de nutrientes, 0,1 % (p/v) Extracto de levadura, 0,5 % (p/v) de sacarosa, 80,0 % (v/v) 87% Glicerina (f.c. 69,6%) | ||
| RegLight | 1,0 % (p/v) Extracto de levadura 0,4 % (p/v) Bacto Peptona, 0,4 % (p/v) de sacarosa, 18,22 % (p/v) de sorbitol, 1,5 % (p/v) Agar | ||
| SCS, pH 5,8 | Solución 1: 20 mM de tri-Na-citrato, 1 M de sorbitol; colución 2: 20 mM de ácido cítrico, 1 M de sorbitol, añadir la solución 2 en la solución 1 hasta alcanzar un pH de 5,8; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM CaCl2; filtro | ||
| estéril STC/PEG | 40 % (v/v) PEG en tampón STC | ||
| Tampón TE, pH 8 | 1,31 mM Tris-Base, 8,69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNasa | 10 y micro; g/ml de RNasa en tampón TE | ||
| Oligoelementos | 0,06‰ (s/v) H3BO3, 0.14‰ (s/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (s/v) ZnCl2, 0.4 y permil; (s/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (s/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (s/v) CuSO4*5H2O | ||
| de enzimas lisantes de Trichoderma | 12,5 mg/ml SCS; filtro estéril; preparar poco antes de usar | ||
| Tris-HCl pH 7,5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; comprobar el pH y, si es necesario, ajustar con HCl; | ||
| autoclave Tampón de usitis 1, pH 8 | 10 mM de Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM de NaCl, 1% (p/v) de SDS, 2% (v/v) de TritonX-100, 1 mM de EDTA. No mida el pH con un medidor de pH. | ||
| Tampón de usti-lisis 2 | mezcle el tampón de lisis Usti 1 con 1x TE en una proporción de 1:1 | ||
| YEPS-Medio | 1,0% (p/v) Extracto de levadura, 0,4% (p/v) Bacto Peptona, 0,4% (p/v) Sacarosa, para placas: 1,5% (p/v) Bacto Agar |
Referencias
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (201....
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Reimpresiones y permisos
