Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Resumen

La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

Resumen

La mosca mediterránea de la fruta (mosca de la fruta) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) es una especie de plaga con extremadamente alta relevancia agrícola. Esto es debido a su comportamiento reproductivo: las hembras dañan la superficie externa de las frutas y verduras cuando se ponen los huevos y las larvas se alimentan tramado en su pulpa. Salvaje C. poblaciones capitata se controlan tradicionalmente a través de la aplicación de insecticidas y / o enfoques ecológicos, siendo el más exitoso de la técnica del insecto estéril (TIE). El SIT se basa en la cría en masa, la esterilización basada en la radiación y la liberación campo de los hombres que retienen su capacidad para aparearse pero no son capaces de generar progenie fértil. El advenimiento y la subsiguiente rápido desarrollo de herramientas biotecnológicas, junto con la disponibilidad de la secuencia del genoma de la mosca mediterránea, ha impulsado en gran medida nuestra comprensión de la biología de esta especie. Esto favoreció la proliferación de nuevas estrategias para la manipulación del genoma, que can aplicarse a control de la población.

En este contexto, la microinyección de embriones juega un doble papel en la expansión de la caja de herramientas para el control de la mosca mediterránea. La capacidad de interferir con la función de los genes que regulan los procesos biológicos claves, en efecto, expande nuestra comprensión de la maquinaria molecular que subyace a la invasividad de moscamed. Además, la capacidad para lograr la transformación de la línea germinal facilita la producción de múltiples cepas transgénicas que pueden ser probados para futuras aplicaciones en el campo de nuevos ajustes SIT. De hecho, la manipulación genética se puede utilizar para conferir rasgos deseables que pueden, por ejemplo, ser utilizados para monitorear el desempeño de los machos estériles en el campo, o que puede dar lugar a letalidad primeras fases de vida. Aquí se describe un método para microinyectar ácidos nucleicos en embriones de mosca mediterránea de alcanzar estos dos objetivos principales.

Introducción

La mosca mediterránea de la fruta (mosca de la fruta) Ceratitis capitata es una especie cosmopolita que daña ampliamente frutas y cultivos. Pertenece a la familia Tephritidae, que incluye varias especies de plagas, tales como los pertenecientes a los géneros Bactrocera y Anastrepha. La mosca de la fruta es la especie más estudiada de esta familia, y se ha convertido en un modelo no sólo para el estudio de las invasiones de insectos ^1, sino también para la optimización de las estrategias de control de plagas ^2.

La mosca de la fruta es una especie multivoltina que pueden atacar a más de 300 e....

Protocolo

1. Estructura del ensayo

1. requisitos insectarias
   1. Mantener toda C. la vida capitata etapas a 25 ° C, 65% de humedad y 12/12 horas de luz / oscuridad fotoperíodo.
   2. Poner alrededor de 1.500-2.000 pupas mosca de la fruta en una jaula de 6 l. Utilice una jaula con un latón de malla en un lado con orificios lo suficientemente pequeños como para estimular la oviposición ^42. Inserte una tira de esponja a través de una pequeña abertura en la base de la jaula para proporcionar moscas con agua por medio de la acción capilar. Usar una mezcla de levadura y azúcar (1:10) como fuente de alimento para los adul....

Resultados

Aquí mostramos dos aplicaciones de la microinyección de embriones dirigida a la caracterización funcional de un gen de interés (caso 1), y en la generación de cepas transgénicas (Caso 2), respectivamente.

Entrega de ARN de doble cadena en embriones de desentrañar la función de genes.

El gen innexin-5 codifica una brecha de unión que, en los insectos, se exp.......

Discusión

La microinyección de ácidos nucleicos en embriones de insectos es una técnica universal que facilita tanto el análisis de la función génica y aplicaciones biotecnológicas.

La reciente publicación de las secuencias del genoma de un número creciente de especies de insectos conduce a una necesidad urgente de herramientas para la caracterización funcional de los genes de función aún desconocida. La interferencia del ARN ha demostrado ser uno de los métodos más valiosos para inferir funciones mol.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 x tampón			0,1 mM tampón de fosfato pH 7,4, 5  mM KCl
Construct Plásmido
Ayudante Plásmido
dsRNA			Fenol-Cloroformo purificado
		para larvas estándar	1,5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g de agente antimicrobiano de amplio espectro utilizado en productos farmacéuticos disuelto en 50  ml de etanol, 400 g de azúcar, 175 g de levadura de cerveza desmineralizada, 1 kg de salvado de trigo blando
		para larvas de zanahoria	2,5 g de agar, 4 g de benzoato de sodio, 4,5 ml de HCl al 37%, 42 g de extracto de levadura, 115 g de zanahoria en polvo, 2,86  g de agente antimicrobiano de amplio espectro, agua a 1 L
alimentos			adultos (1:10)
Portaobjetos de microscopio	Sigma-Aldrich	Z692247
Agujas de inyección	Microcargadores Eppendorf	5242956000
	Eppendorf	5242956003
Cinta
Whatman Papel circular negro	Sigma-Aldrich Z695505
Bleach			Diluite 1:2 antes de usar
Pincel (000)
Micromanipulador	Narishige	MN-153
Microinyector	Eppendorf		Femtojet
Jaulas para adultos Aceite de
clorotrifluoroetileno	Sigma-Aldrich	H8898
Ceratitis capitata			La cepa utilizada es ISPRA

de inyección Alimento Alimento de extracto de levadura y azúcar paradeslizante doble