Artículo de método

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos, Ceratitis capitata

DOI:

10.3791/54528

⸱

1 de octubre de 2016

 , 
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

En este artículo

Resumen

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La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

Resumen

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La mosca mediterránea de la fruta (mosca de la fruta) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) es una especie de plaga con extremadamente alta relevancia agrícola. Esto es debido a su comportamiento reproductivo: las hembras dañan la superficie externa de las frutas y verduras cuando se ponen los huevos y las larvas se alimentan tramado en su pulpa. Salvaje C. poblaciones capitata se controlan tradicionalmente a través de la aplicación de insecticidas y / o enfoques ecológicos, siendo el más exitoso de la técnica del insecto estéril (TIE). El SIT se basa en la cría en masa, la esterilización basada en la radiación y la liberación campo de los hombres que retienen su capacidad para aparearse pero no son capaces de generar progenie fértil. El advenimiento y la subsiguiente rápido desarrollo de herramientas biotecnológicas, junto con la disponibilidad de la secuencia del genoma de la mosca mediterránea, ha impulsado en gran medida nuestra comprensión de la biología de esta especie. Esto favoreció la proliferación de nuevas estrategias para la manipulación del genoma, que can aplicarse a control de la población.

En este contexto, la microinyección de embriones juega un doble papel en la expansión de la caja de herramientas para el control de la mosca mediterránea. La capacidad de interferir con la función de los genes que regulan los procesos biológicos claves, en efecto, expande nuestra comprensión de la maquinaria molecular que subyace a la invasividad de moscamed. Además, la capacidad para lograr la transformación de la línea germinal facilita la producción de múltiples cepas transgénicas que pueden ser probados para futuras aplicaciones en el campo de nuevos ajustes SIT. De hecho, la manipulación genética se puede utilizar para conferir rasgos deseables que pueden, por ejemplo, ser utilizados para monitorear el desempeño de los machos estériles en el campo, o que puede dar lugar a letalidad primeras fases de vida. Aquí se describe un método para microinyectar ácidos nucleicos en embriones de mosca mediterránea de alcanzar estos dos objetivos principales.

Introducción

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La mosca mediterránea de la fruta (mosca de la fruta) Ceratitis capitata es una especie cosmopolita que daña ampliamente frutas y cultivos. Pertenece a la familia Tephritidae, que incluye varias especies de plagas, tales como los pertenecientes a los géneros Bactrocera y Anastrepha. La mosca de la fruta es la especie más estudiada de esta familia, y se ha convertido en un modelo no sólo para el estudio de las invasiones de insectos 1, sino también para la optimización de las estrategias de control de plagas 2.

La mosca de la fruta es una especie multivoltina que pueden atacar a más de 300 especies de plantas silvestres y cultivadas 3,4. El daño es causado tanto por los adultos y los estadios larvarios: hembras apareadas perforan la superficie de la fruta para la oviposición, permitiendo que los microorganismos que afectan su calidad comercial, mientras que las larvas se alimentan de la pulpa de la fruta. Después de tres etapas larvales, las larvas emergen desde el host y se transforman en crisálidas en el suelo. Ceratitiscapitata muestra una distribución casi todo el mundo, incluyendo África, Oriente Medio, Australia Occidental, América Central y del Sur, Europa, y las áreas de los Estados Unidos 5.

Las estrategias más comunes para limitar las infestaciones de mosca mediterránea implican el uso de insecticidas (por ejemplo, malatión, Spinosad) y la técnica del insecto estéril con el medio ambiente (SIT) 6. El último enfoque implica la liberación en el medio natural de cientos de miles de machos estériles prestados por la exposición a la radiación ionizante. El acoplamiento de tales machos esterilizados a hembras silvestres da lugar a ninguna progenie, causando una reducción en tamaño de la población, llevando eventualmente a la erradicación. Aunque SIT ha demostrado su eficacia en múltiples campañas en todo el mundo, sus principales desventajas incluyen los altos costos de la crianza y la esterilización de millones de insectos para ser lanzado. Marcado de los individuos liberados es necesario distinguir estéril de los insectos salvajes capturados en el campo duranteseguimiento de las actividades y en la actualidad se consigue utilizando polvos fluorescentes. Estos procedimientos son costosos y tienen efectos secundarios indeseables 7.

Con el fin de optimizar y / o para desarrollar enfoques más eficaces para el control de esta plaga, la biología y la genética mosca de la fruta han sido ampliamente explorado por numerosos investigadores de todo el mundo. La disponibilidad de la secuencia del genoma de moscamed 8,9, facilitará nuevas investigaciones sobre funciones de genes. La interferencia de ARN es una poderosa herramienta para tales estudios y se puede lograr a través de la microinyección de dsRNA (RNA de doble cadena) o siRNA (ARN interferente pequeño). Esta técnica se ha utilizado, por ejemplo, para demostrar que la cascada molecular determinación del sexo en C. capitata se conserva sólo en parte con respecto a la de Drosophila 10.

El desarrollo de protocolos para microinyectar embriones de mosca mediterránea permitidos C. capitata para ser el primer noespecies de moscas -Drosophilid a ser modificados genéticamente. Como sus huevos son similares a las de Drosophila, tanto en términos de morfología y la resistencia a la desecación 11, el protocolo para administrar ADN de plásmido en los embriones pre-blastoderm desarrollados primero por D. 12,13 melanogaster fue adaptado inicialmente para su uso en C. capitata. Estos primeros experimentos permitieron la transformación de la línea germinal mosca mediterránea basada en el elemento de transposición Minos 11. Posteriormente, el sistema original fue modificado 14 usando otros enfoques basados en transposón. Este es el caso de piggyBac de los lepidópteros Trichoplusia ni 15. El protocolo ya ha sido optimizado, lo que ha permitido la transformación de otras especies -tephritidae- 16-21 y también de muchos otros dípteros 22-31. Todos estos sistemas se basan en el uso de un sistema de transformación de plásmido binario típico vector / ayudante: artificial, transpo defectuosohijos que contienen los genes deseados se ensamblan en el ADN plásmido y se integran en el genoma del insecto mediante el suministro de la enzima transposasa 32. Una serie de líneas de mosca mediterránea transgénicas se han generado, con múltiples funciones que incluyen cepas que portan un gen letal dominante condicional que induce letalidad, cepas que producen sólo para hombres progenie y lo que no requiere de estrategias de sexado adicionales, y las cepas con espermatozoides fluorescente, lo que puede aumentar la precisión de la fase de seguimiento SIT 33-37. A pesar de la liberación en el medio natural de los organismos transgénicos se ha producido en las pruebas piloto contra los mosquitos solamente 38,39, al menos una compañía está evaluando una serie de cepas de mosca mediterránea transgénicos para su uso en el campo 40.

microinyección de embriones también puede favorecer el desarrollo de nuevas herramientas de edición de genoma, tales como nucleasas de transcripción activador de efectores (Talens), agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / CRISPR proteína asociada 9 nucleasa (Cas9) y la vivienda de endonucleasas genes (HEGs), lo que permitirá nuevos estudios evolutivos y de desarrollo, así como la expansión de la caja de herramientas biotecnológicas disponibles. Enfoques de edición de genoma que ya permitió la generación de sistemas de genes sin conductor en mosquitos 41, y su transferencia a la mosca de la fruta es inminente. Aquí se describe un protocolo universal para la microinyección de ácidos nucleicos en embriones de mosca mediterránea que pueden ser útiles para todas las aplicaciones antes mencionadas.

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Protocolo

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1. Estructura del ensayo

  1. requisitos insectarias
    1. Mantener toda C. la vida capitata etapas a 25 ° C, 65% de humedad y 12/12 horas de luz / oscuridad fotoperíodo.
    2. Poner alrededor de 1.500-2.000 pupas mosca de la fruta en una jaula de 6 l. Utilice una jaula con un latón de malla en un lado con orificios lo suficientemente pequeños como para estimular la oviposición 42. Inserte una tira de esponja a través de una pequeña abertura en la base de la jaula para proporcionar moscas con agua por medio de la acción capilar. Usar una mezcla de levadura y azúcar (1:10) como fuente de alimento para los adultos (Figura 1A). Aumentar la cantidad de levadura (hasta 1: 3, levadura: azúcar) deben dejar de las hembras ponen huevos.
    3. Coloque un plato lleno de agua debajo de la caja para recoger los huevos depositados a través de la malla. Como hembras vírgenes pueden poner huevos, espere hasta que las moscas son al menos 6-7 días antes de la recogida de los huevos para los experimentos de microinyección. Esto asegurará que las hembras se han apareadoy que habrán sido fertilizado los huevos.
    4. Recoger los huevos filtrando el agua con un colador de red fina. La transferencia de los huevos del colador en una caja de plástico que contiene alimentos larval estándar (1,5 LH 2 O, 100 ml de HCl 1%, 5 g de agente antimicrobiano de amplio espectro disolvió en 50 ml de etanol, 400 g de azúcar, 175 g de levadura de cerveza desmineralizada, 1 kg de salvado de trigo blando) utilizando una pipeta Pasteur.
    5. Coloque cada caja en un recipiente transparente cerrado con una tapa de red para permitir la circulación de aire y que contiene una capa de salvado para favorecer la pupación (Figura 1B).
    6. Después de 10 días, comprobar si hay 3º estadio las larvas que emergen de la comida de larvas y saltar hacia abajo en la capa de salvado de la fase de pupa.
    7. 24 horas más tarde, recoger las pupas en una taza pequeña con un cepillo suave y transferirlos a una nueva jaula para adultos. Los adultos emergen normalmente 10 días después de la fase de pupa. La mosca emergente utiliza el ptilino, una bolsa inflable situada en su cabeza por encima de THe base de las antenas, para forzar el extremo de la pupa. Después de la emergencia, la ptilino colapsa de forma permanente al interior de la cabeza.
  2. Preparación de alimentos para las larvas L 1 microinyectados
    1. Disolver 2,5 g de agar en 300 ml de H2O
    2. Caliente 500 ml H 2 O en una placa de agitación caliente y disolver 4 g Benzoato de sodio, 4,5 ml 37% de HCl, 42 g de extracto de levadura y 115 g de polvo de zanahoria deshidratada.
    3. Añadir a la mezcla una solución de 2,86 g de agente antimicrobiano de amplio espectro disuelto en 10 ml de etanol absoluto.
    4. Distribuir el medio en 15 cm redondas placas de Petri y se deja enfriar. Si es necesario, se almacena a 4 ° C.
  3. preparación de los portaobjetos
    1. Coloque una tira de 2 cm de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de microscopio (75 x 26 mm 2) y marcar los bordes con un marcador de porcelana, para evitar la propagación del petróleo y la consiguiente desecación de los embriones inyectados.
  4. nucleicos Preparación de ácido
    1. Aislar el plásmido de ADN usando kits disponibles en el mercado 34. Precipitar el plásmido utilizando etanol y resuspender en tampón de inyección (0.1 mM de tampón de fosfato de pH 7,4, KCl 5 mM) a la concentración deseada.
    2. Purificar sintetizado in vitro a largo dsRNA utilizando fenol-cloroformo, precipitado con isopropanol y volver a suspender en tampón de inyección 43.

2. Preparación de embriones

  1. Colocar una bandeja llena de agua bajo una jaula que contiene los adultos 6-7 días de edad.
  2. Permitir que las hembras ovipositaran durante 30 min y a continuación recogen los embriones mediante el filtrado de agua utilizando un colador fino. Siempre mantenga el colador en agua para evitar la desecación de los embriones.
  3. Dechorionate los embriones sumergiéndola el filtro durante 5 s en una solución comercial blanqueador 50%.
  4. Lavar cuidadosamente los embriones sumergiéndola repetidamente el colador en agua ultrapura limpia (al menos4-5 veces). Por último, colocar el filtro en agua ultrapura limpia. Usa los embriones en un máximo de 2 horas.
    NOTA: El momento de la microinyección se relaciona con la necesidad de inyectar en embriones pre-blastodermo, durante una fase de divisiones nucleares antes de cellularization. Esto permite que el ADN inyectado a ser tomado arriba en los núcleos, especialmente en los núcleos de células germinales primordiales que originan los gametos. En Drosophila, cellularization en las células de polos comienza a alrededor de 90 min después de la fertilización (a 25 ° C), con la formación de blastodermo se producen alrededor de 30 min más tarde 44, mientras que en el cellularization moscamed tiene lugar entre 9 y 12 hr 45,46.
  5. La orientación del embrión en filas
    1. El uso de un pincel fino, reunir a cerca de 50 embriones y colocarlos en un disco de papel de filtro negro empapado con agua.
    2. Bajo un microscopio estereoscópico de disección, disponer los embriones en una fila en la superficie superior de la cinta de doble cara enel portaobjetos de microscopio utilizando un pincel fino (000) (Figura 1C).
      NOTA: Alinear los embriones en la misma orientación, como la inyección se realiza en el polo posterior, en donde la línea germinal se originará; el polo posterior es opuesta a la región micropilo.
    3. Cubrir los embriones con una capa de aceite clorotrifluoroetileno asegurándose de que el aceite no se derrame sobre China bordes de los marcadores (véase 1.3).
      NOTA: Antes de cubrir los embriones con aceite, un paso más allá se puede realizar: los embriones pueden ser desecados durante unos minutos para reducir su contenido de líquido y de este modo facilitar la entrada de la solución de ADN inyectado. Esto puede ayudar a evitar la rotura del embrión durante la inyección o la fuga excesiva de la solución inyectada, como una consecuencia de la alta presión del líquido.

La microinyección de embriones 3.

  1. Llenar una aguja (1-2 l) con ADN de plásmido o solución dsRNA (1-2 mg / l) utilizando una micropipeta.
  2. Conectar la aguja al aparato de microinyección, que controla el tiempo de inyección (0,5 seg), la presión (800 hPa) y la contrapresión (150 hPa).
  3. Realizar la microinyección en un estereomicroscopio, usando un micromanipulador para controlar los movimientos de la aguja (Figura 1D). Utilice la platina del microscopio para mover la corredera.
    1. Colocar el portaobjetos en el escenario del alcance.
    2. Inserte la punta de la aguja en el polo posterior del embrión (Figura 1E).
    3. Se inyecta la solución mediante la activación del sistema de microinyección con el pedal. El líquido inyectado induce un aumento de la presión interna, lo que resulta en un ligero movimiento del embrión.
    4. Suelte el pedal y de inmediato, pero con cuidado, retire la aguja del embrión.
    5. Observar un derrame citoplasmática en el lugar de la inyección.
      NOTA: Para discriminar entre los posibles efectos letales de ADN / ARN de doble cadena / siRNA y la mortalidad debido a la pro microinyecciónprocedimiento en sí, los experimentos de control se deben realizar. Estos comprenden la inyección de tampón solamente, o, en el caso de experimentos de genética inversa, de una proteína verde fluorescente (GFP) -derivado ARN de doble cadena (dsRNA-GFP), o siRNA.
  4. Después de la inyección incubar los embriones a 25 ° C.

4. Procedimientos posteriores a la inyección

  1. Dos días después de la inyección, compruebe las diapositivas para la eclosión de larvas (Figura 1F) bajo un microscopio estereoscópico. Las larvas pueden mover en el aceite pero necesitan ser transferidos a la alimentación de las larvas tan pronto como sea posible. Por esta razón, comprobar las diapositivas varias veces al día.
  2. El uso de un pincel fino (000), transferir suavemente la eclosión de larvas al alimento de las larvas a base de zanahoria. Transferir hasta un máximo de 200 larvas por cada placa de Petri.
  3. Incubar las larvas en 65% de humedad (25 ° C). Asegúrese de que la tapa no se pega a la placa, impidiendo el intercambio de aire.
  4. Mantener las placas de Petri con la tapaprincipalmente cerrado, así que todavía hay flujo de aire para las larvas. Para evitar el secado excesivo, revise los platos todos los días y, si es necesario, añadir agua para compensar la evaporación.
  5. Colocar las placas de Petri en un recipiente transparente cerrado por una tapa de red y que contiene una capa de salvado para favorecer la pupación. En cuanto a la crianza de insectario rutina, 3 º estadio las larvas de saltar de la comida de larvas se transforman en crisálidas y en el salvado.
  6. Recoger las pupas y colocarlos en una pequeña jaula para la cría de adultos y cribado (esto es la generación 0, G0). Trasera de la progenie alimento larval estándar.
  7. En el caso de los experimentos de transformación de línea germinal, la verificación de posibles individuos transformados en la próxima generación (G1), como individuos inyectados por lo general son quimeras. eventos de transposición, de hecho, podrían haber ocurrido en cualquiera de los núcleos del sincitio embrionaria, que formarán ya sea la línea germinal o el soma.
    1. Poco después de la emergencia, anestesiar a los individuos G1 usando CO2 y comprobar si hay transformación eventos bajo un microscopio estereoscópico de epifluorescencia. Para detectar la presencia de fluorescencia roja, utilizar un filtro DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), mientras que para la detección de fluorescencia verde utilizar el filtro EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) .
    2. Coloque individuos transformados en una pequeña jaula con los de tipo salvaje adultos del sexo opuesto y originar una nueva, en un principio heterocigóticos, cepa.

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Resultados

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Aquí mostramos dos aplicaciones de la microinyección de embriones dirigida a la caracterización funcional de un gen de interés (caso 1), y en la generación de cepas transgénicas (Caso 2), respectivamente.

Entrega de ARN de doble cadena en embriones de desentrañar la función de genes.

El gen innexin-5 codifica una brecha de unión que, en los insectos, se exp...

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Discusión

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La microinyección de ácidos nucleicos en embriones de insectos es una técnica universal que facilita tanto el análisis de la función génica y aplicaciones biotecnológicas.

La reciente publicación de las secuencias del genoma de un número creciente de especies de insectos conduce a una necesidad urgente de herramientas para la caracterización funcional de los genes de función aún desconocida. La interferencia del ARN ha demostrado ser uno de los métodos más valiosos para inferir funciones mol...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a todos los miembros del Laboratorio de "Genética y Genómica de Insectos", en particular a Lorenzo Ghiringhelli que ha trabajado en el desarrollo, adaptación y mantenimiento de la cría de la mosca del mediterráneo durante los últimos treinta años. Parte de los resultados representativos de este trabajo han sido reimpresos de N. Biotechnology, 25(1) por Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Dípteros: Tephritidae), 76-84, 2008, con permiso de Elsevier (Número de licencia 3796240759880). Este trabajo contó con el apoyo de Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 x tampón0,1 mM tampón de fosfato pH 7,4, 5  mM KCl
Construct Plásmido
Ayudante Plásmido
dsRNAFenol-Cloroformo purificado
para larvas estándar1,5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g de agente antimicrobiano de amplio espectro utilizado en productos farmacéuticos disuelto en 50  ml de etanol, 400 g de azúcar, 175 g de levadura de cerveza desmineralizada, 1 kg de salvado de trigo blando
para larvas de zanahoria2,5 g de agar, 4 g de benzoato de sodio, 4,5 ml de HCl al 37%, 42 g de extracto de levadura, 115 g de zanahoria en polvo, 2,86  g de agente antimicrobiano de amplio espectro, agua a 1 L
alimentosadultos (1:10)
Portaobjetos de microscopioSigma-AldrichZ692247
Agujas de inyección Microcargadores Eppendorf5242956000
Eppendorf5242956003
Cinta
Whatman Papel circular negroSigma-Aldrich Z695505
BleachDiluite 1:2 antes de usar
Pincel (000)
MicromanipuladorNarishigeMN-153
MicroinyectorEppendorfFemtojet
Jaulas para adultos Aceite de
clorotrifluoroetilenoSigma-AldrichH8898
Ceratitis capitataLa cepa utilizada es ISPRA
de inyección Alimento Alimento de extracto de levadura y azúcar paradeslizante doble

Referencias

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