Un modelo de lesión en la cabeza repetidos de conmoción en ratones

Resumen

La conmoción cerebral presenta el tipo más común de lesión cerebral traumática. Por lo tanto, un modelo animal de conmoción cerebral repetitivo, que replica las características importantes de una lesión en los pacientes, puede proporcionar un medio para estudiar la conmoción cerebral de una manera rigurosa, controlada y eficiente.

Resumen

A pesar de que la conmoción cerebral/lesión cerebral traumática leve (mTBI) es la ocurrencia más frecuente de lesión cerebral traumática, todavía existe una falta de conocimiento sobre la lesión y sus efectos. Para desarrollar una mejor comprensión de las conmociones cerebrales, a menudo se utilizan animales porque proporcionan un modelo controlado, riguroso y eficiente. Los estudios han adaptado modelos animales tradicionales para realizar mTBI para estimular la gravedad de la lesión leve mediante el cambio de los parámetros de la lesión. Estos modelos se han utilizado porque pueden producir lesiones cerebrales morfológicamente similares a la condición clínica y proporcionar un espectro de severidades de las lesiones. Sin embargo, están limitados en su capacidad para presentar las características idénticas de las lesiones en los pacientes. Utilizando un sistema de impacto tradicional, un modelo de lesión por conmoción cerebral repetitiva (rCHI) puede inducir una conmoción cerebral de leve a moderada similar a la humana. El grado de lesión se puede determinar midiendo el período de pérdida de conciencia (LOC) con un signo de terminación transitoria de la respiración. El modelo rCHI es beneficioso por su precisión y simplicidad para determinar los efectos del mTBI y los posibles tratamientos.

Introducción

Conmoción cerebral, también llamada lesión cerebral traumática leve (LCTL), es la ocurrencia más frecuente de lesión cerebral traumática (TBI) y afecta a millones de personas en los Estados Unidos. Las conmociones cerebrales pueden ser difíciles de diagnosticar y no existe una cura específica para la conmoción cerebral. Hay un creciente reconocimiento y alguna evidencia de que los traumatismos mecánicos leves como consecuencia de lesiones deportivas, combate militar, y otras actividades atractivas físicamente puede tener consecuencias neurológicas crónicas y acumulativas ^1,2. Sin embargo, todavía hay una falta de conocimiento sobre las conmociones cerebrales y sus efectos. metodología actual restringe los estudios de patología y el tratamiento en humanos, ya que sólo la valoración neurológica y evaluación de imágenes están disponibles para el diagnóstico clínico. Los modelos animales proporcionan un medio para estudiar conmociones cerebrales de una manera eficiente, riguroso y controlado con la esperanza de diagnóstico y tratamiento de LCTL.

Los estudios han adaptado tradicional TBImodelos como el impacto cortical controlado (CCI), el impacto de percusión de fluido (FPI), lesión de caída de peso, y la lesión por estallido para realizar LCTL y estimulan la gravedad de lesiones bajas cambiando los parámetros de lesiones. Estos modelos son beneficiosos de usar debido a su capacidad para replicarse trauma cerebral morfológicamente similar a la situación clínica; sin embargo, también tienen sus propias limitaciones. La gravedad de la lesión inducida por una lesión de aceleración (caída de peso) es a menudo muy variable. Los dos resultados de la ICC leve - hemorragia subaracnoidea y contusión focal - no son comparables con las conmociones cerebrales humanas típicas. CCI y FPI requieren una craneotomía, que no es clínicamente relevante, mientras que la lesión por estallido es un modelo más controvertida en lo que respecta a las diferentes medidas de posición de la exposición y el pico de presión, así como lesión secundaria variable durante la exposición ^_3-6. Un modelo animal de conmoción actualizado que se puede traducir la investigación preclínica a la clínica setting es necesaria en la investigación.

La cuestión clave en el modelado de una LCT leve es definir la gravedad de la lesión experimental, que se replica más de cerca posible de la lesión en un entorno clínico. Recientemente, diferentes grupos de investigación desarrollaron la lesión en la cabeza cerrada o lesión en la cabeza de conmoción (CHI) modelo ^7-10. CHI es una modificación del CCI sin una craneotomía, pero todavía utiliza un sistema electrónico de impacto magnética tradicional para generar un impacto de la cabeza. Un CHI puede inducir una conmoción cerebral que van de leves a moderados mediante el ajuste de los parámetros de impacto. La pérdida de conciencia (LOC) se puede observar inmediatamente después de un impacto por la detección de una disminución en la tasa de respiración o la terminación transitoria de la respiración. El período de LOC se usa para determinar la gravedad de la lesión. Este documento incluye una versión ligeramente mejorada y actualizada de un modelo repetitivo CHI (rCHI) en ratones, junto con un protocolo detallado paso a paso y los resultados representativos. El rCHI estrategias de investigación modelo de unare beneficiosa en la determinación de los efectos LCTL y posibles tratamientos, sobre todo porque no existe un modelo animal individual capaz de imitar todos los cambios patológicos de conmoción cerebral inducida.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron bajo protocolos # 201207692 aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Universidad de Florida y de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Cuidado de Animales

1. Utilice 3-4 meses de edad de sexo masculino C57BL / 6J. Proporcionar ropa de cama, material de nidificación, alimentación y agua ad libitum. Mantener los ratones en una temperatura ambiente controlada a 20 - 22 ° C, con constantes de 12 horas de luz / 12-hr ciclos de oscuridad.

2. Pre-impactación Preparación

1. Coloque una punta de metal revestida de silicona a medida para un dispositivo de impacto estereotáxica electromagnética. Asegúrese de que la parte inferior plana de la punta es paralela a la superficie de la punta de la sonda (Figura 1A).
2. Anestesiar al ratón con 4% de isoflurano seguido de anestesia de mantenimiento de 2,5% de isoflurano. Compruebe la anestesia a través del medidor de flujo. monitor el nivel de la anestesia hasta que el animal alcanza un nivel quirúrgico de anestesia, mostrando la pérdida del reflejo de retirada pedal.
3. Ponga el ratón en una posición de decúbito prono sobre una almohadilla térmica. Use un cono de la nariz en forma de embudo para mantener el ratón bajo anestesia. Afeitarse completamente la cabeza utilizando un condensador de ajuste. Utilizar vaselina ungüento oftálmico en los ojos del ratón para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.

3. Ajuste los parámetros de impacto

NOTA: El sistema de impacto incluye una caja de control para ajustar los parámetros de impacto, un actuador para realizar la impactación, y un marco de estereotaxia digital con los ejes 3-movimiento.

1. Pre-establecer la velocidad del dispositivo de impacto a 4 m / s, y el tiempo de permanencia de 240 ms en la caja de control.

4. Colocación del Centro de Impacto

1. Aplique una almohadilla eléctrica suave bajo el cuerpo del animal para mantener la temperatura corporal alrededor de 39 ° C. Montar el ratón en un marco estereotáxico en un pronposición e con las barras de oído sin filo.
2. Bajar la punta de impacto cerca de la cabeza del ratón moviendo el Z-conductor. Ajustar la punta de impacto plana (9 mm de diámetro) moviendo los ejes X e Y en los conductores a medio camino a la meta coordina por encima de la sutura sagital.
3. Asegúrese de que uno de los bordes de la punta de impacto sea vertical paralelo a una línea horizontal imaginaria trazada entre los dos oídos (Figura 1C). El centro de impacto corresponde a la mitad de camino entre el centro de sutura sagital suturas interfrontal y lamboidea (interaurales 9 mm a interauricular 0 mm, lateral 4,5 mm).

5. Profundidad de impacto Marco

1. Para configurar correctamente la profundidad del impacto, usar punta de la sonda adicional para reemplazar la punta de impacto revestida de silicona con aislamiento.
2. Para asegurarse de que no hay un desplazamiento del centro de conmutación de impacto después de consejos, establecer los ejes X e Y del canal en el panel de control estereotáxico digitales a cero antes de cambiar las puntas.
3. Mueva el probe punta hasta el centro de la zona de impacto moviendo manualmente los X-e Y unidades.
4. sensor de contacto del clip de la cola del ratón.
5. Mover el impactador (unidad Z) hacia abajo hasta que la punta de la sonda toca la superficie del lugar del impacto.
6. Ajuste el canal Z en el panel de control estereotáxico a cero.
7. Mueva la punta de impacto de nuevo a la zona de impacto ajustando manualmente X e Y en los conductores (no con los botones de cero en el panel de control estereotáxica digital) hasta que X e Y son los conductores de cero (donde la punta de impacto anteriormente se ha posicionado).
8. Retraer el accionador moviendo el interruptor de retracción en la caja de control. mover manualmente el impactador hacia abajo (controlador Z) a los 4 mm.

6. Impacto

1. Desencadenar el impacto pulsando el interruptor impacto en la caja de control y lograr una profundidad de deformación de 4 mm.

7. Post-impactación

1. Se mide el tiempo desde el impacto hasta primera respiración del ratón utilizando un temporizador.
2. Eliminar el animal del instrumento y colocarlos sobre una almohadilla caliente para mantener la temperatura corporal. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
3. Permitir la recuperación antes de volver al animal en una jaula limpia. No devuelva un animal a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
4. Observar y sopesar los ratones diariamente. Si los ratones muestran signos de dolor, por vía intraperitoneal a inyectar con Meloxicam en 1 - 2 mg / kg cada 12 a 24 hr.

8. La impactación repetitivo

1. Dar a los ratones lesiones adicionales en los días 4, 7 y 10 después de la lesión inicial (intervalo de 72 horas entre los impactos).

9. La inmunohistoquímica (IHC)

1. perfusión transcardial
   1. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal con 200 m / kg de pentobarbital.
   2. Evaluar y asegurar la anestesia quirúrgica placa de circuitos mediante una pizca dedo del pie. SegundoUre el ratón en la posición supina con cinta adhesiva suavemente las patas delanteras y las patas traseras a una superficie de trabajo de espuma de poliestireno dentro de una campana de humos química.
   3. Hacer una incisión a través de la piel a lo largo de la línea media dorsal desde justo debajo de la apófisis xifoides hasta la clavícula. Hacer dos incisiones adicionales de la piel en el proceso xifoides y proceder a lo largo de la base de la caja torácica ventral lateralmente.
   4. Abra la cavidad torácica y exponer el corazón cortando a través de la musculatura torácica y la caja torácica.
   5. Asegure el corazón que late con unas pinzas romas y hacer un 1 - 2 mm incisión en el ventrículo izquierdo.
   6. Inmediatamente inserte una aguja de mariposa en la aurícula derecha. Comience la infusión de solución salina 20 ml empujando la jeringa lentamente.
   7. Cambiar de solución salina al 4% de paraformaldehído. Continuar la perfusión con 20 ml de paraformaldehído.
   8. Decapitar al ratón y quitar la piel con unas tijeras. Aislar el cerebro del cráneo siguiendo un cortador de hueso.
2. doryostat seccionar
   1. tejidos cerebrales incrustar en la formulación temperatura óptima de corte (OCT) y la congelación a -80 ° C. Coloque el cerebro en el criostato en una orientación sagital. secciones de cerebro de corte 5 m de espesor.
3. tinción
   1. Secar las secciones congeladas a temperatura ambiente durante 1 hr.
   2. Incubar los portaobjetos con 100 l de suero de cabra 2% y 0,1% de Triton X-100 en tampón fosfato salino (PBS) durante 1 hr a RT.
   3. Se lavan los portas 3 veces con 300 l de PBS. Entonces se incuban los portaobjetos con anti-GFAP (1: 200) o anticuerpo anti-ferritina (1: 200) por separado durante la noche a 4 ° C.
   4. Se lavan los portas 3 veces con 300 l de PBS. Entonces se incuban los portaobjetos durante 2 hr a temperatura ambiente con anticuerpo secundario conjugado con biotina.
   5. Se lavan los portas 3 veces con 300 l de PBS. Entonces se incuban los portaobjetos con solución de complejo avidina-biotina (ABC) (1:50) a temperatura ambiente durante 30 min.
   6. Se lavan los portas 3 veces con 300 l de PBS. A continuación se incuban en 3,3 '-Diaminobencidina solución (DAB) sustrato (50 ml de PBS, 10 l _de H ₂ O _2, 10 mg pastillas DAB, filtro antes de usar) durante 5 - 8 minutos. Los portaobjetos bajo el microscopio hasta que aparezcan las células positivas.
   7. Enjuague los portaobjetos en agua del grifo funcionamiento lento durante 5 minutos. diapositivas limpias con un laboratorio de borrado. A continuación, montar las secciones con medio de montaje y cubreobjetos.

Resultados

En este modelo (Figura 1 AC), hubo breves períodos de jadeos y respiraciones superficiales. Una pérdida de la conciencia (inconsciente) se define como una disminución en el ritmo de la respiración o la terminación transitoria de la respiración antes de reanudar una respiración normal. Un impacto en el centro de la cabeza causado inconsciencia a corto plazo (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 seg en cada impacto por separado, la Figura 1D). Cereb...

Discusión

Para imitar las lesiones cerebrales morfológicamente similares a la condición clínica, se espera que los síntomas post-concusión. síntomas post-concusión generalmente incluyen dolores de cabeza, mareos, vértigo, fatiga, problemas de memoria y de sueño, dificultad para concentrarse, así como la ansiedad y estado de ánimo depresivo. Dado que los síntomas somáticos sin embargo, no pueden ser medibles en modelos animales, los cambios de motor y la función cognitiva y el comportamiento emocional se utilizan como criterios pa...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
máquina de anestesia	Eagle Eye Anesthesia, Inc	Modelo 150	anestesia
Impactador electromagnético	LeicaBiosystems	Impact One Impactor estereotáxico	realizar impactación
Instrumento estereotáxico digital	LeicaBiosystems		Ratón de montaje 39462501 y puntas
de posicionamiento Punta de metal recubierta de caucho de silicona	Herramienta de precisión & Ingeniería, Gainesvill FL	punta de impacto	hecha a medida
Recortadora todo en uno de iones de litio	WAHL Home Products	9854-600	afeitado de pelo de ratón
clips de papel punta de sonda hecha a
Aplicadores con punta de algodón	MEDLINE	MDS202055	cabezal de exfoliante con solución salina
Tissue Tek O.C.T.	ASKURA FINETEK USA INC	4583	incrustación de tejido
anti-GFAP	Anticuerpo Dako	CA93013	para IHC
anti ferritina	Sigma	F6136	anticuerpo para IHC
Kit VECTASTAIN Elite ABC  Laboratorios	vectoriales	PK-6100 Sistema de	detección IHC
Medio de montaje Permount Fisher	Scientific	SP15-100
Aperio XT ScanScope scanner	Leica Microsystems Inc,escaneo		de diapositivas
Leica AutoStainer XL	Leica la patología Company	ST2010	H& E tinción
DAB	Sistema de detección sigma	D3939	IHC

medida