Artículo de método

Creación y el transplante de una hoja de células madre derivadas de adiposo (ASC) en un modelo de curación de herida diabética

DOI:

10.3791/54539

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4 de agosto de 2017

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1Diabetic Center, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, 2The Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 3The Department of Anatomy and Developmental Biology, Tokyo Women's Medical University School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Células madre procedentes de adiposo (ASCs) son fácilmente aisladas y extraídas de la grasa de las ratas normales. Hojas de ASC pueden crearse utilizando ingeniería hoja de la célula y pueden ser transplantadas en Zucker ratas diabéticas grasosas exhibiendo espesor total defectos con hueso expuesto de la piel y luego se cubrieron con una bicapa de piel artificial.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Piel artificial ha logrado considerables resultados terapéuticos en la práctica clínica. Sin embargo, tratamientos de piel artificial para las heridas en pacientes diabéticos con flujo sanguíneo impedida o con heridas grandes podrían ser prolongados. Terapias basadas en células han aparecido como una nueva técnica para el tratamiento de las úlceras diabéticas, y hoja de la célula Ingeniería ha mejorado la eficacia del trasplante de la célula. Varios informes han sugerido que células madre procedentes de adiposo (ASCs), un tipo de células mesenquimales estromales (MSC), exhiben potencial terapéutico debido a su relativa abundancia en el tejido adiposo y su accesibilidad para la recolección en comparación con MSCs de otros tejidos. Por lo tanto, ASCs parecen ser una buena fuente de células madre para uso terapéutico. En este estudio, hojas ASC de la grasa adiposa Epididimal de las ratas de Lewis normales fueron creadas con éxito utilizando platos de cultivo temperatura sensible y normal medio de cultivo que contiene ácido ascórbico. Las hojas ASC fueron transplantadas en ratas diabéticas grasos (ZDF) de Zucker, un modelo de diabetes tipo 2 y obesidad, que muestran disminución de ratas la cicatrización de heridas. Una herida fue creada en la superficie craneal posterior, hojas ASC se trasplantaron en la herida y la piel de una bicapa artificial fue utilizada para cubrir las hojas. Las ratas ZDF que recibieron hojas ASC habían mejor cicatrización que las ratas ZDF sin el trasplante de las hojas de la ASC. Este enfoque fue limitado porque las hojas de ASC son sensibles a las condiciones secas, requiriendo el mantenimiento de un entorno húmedo de la herida. Por lo tanto, la piel artificial fue utilizada para cubrir la hoja de la ASC para evitar que se sequen. El trasplante alógeno de hojas ASC en combinación con piel artificial también podría ser aplicable a otras úlceras intratables o quemaduras, como los observados con la enfermedad arterial periférica y enfermedad del colágeno y puede ser administrado a pacientes que están desnutridos o que están usando esteroides. Así, este tratamiento podría ser el primer paso hacia la mejora de las opciones terapéuticas para el diabético herida curativo.

Introducción

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La población de pacientes diabéticos está aumentando en todo el mundo y llegó a 400 millones en el 20151; aproximadamente 15-25% de pacientes con diabetes están en riesgo de la progresión de una úlcera diabética de extremidades inferiores2. Las úlceras diabéticas de la extremidad inferior son insuperables y podrían requerir un período terapéutico prolongado con entrenamiento de rehabilitación después de una recuperación completa. Un período largo de la terapia a menudo resulta en una reducción significativa en la paciente calidad de vida. Así, hay que desarrollar nuevas terapias que disminuirán o impedir la agravación para el tratamiento de las heridas diabéticas. Para evaluar la cicatrización de la herida diabética, hemos optimizado una úlcera diabética cicatrización modelo en ratas, que imita las condiciones clínicas prácticas, y evaluó si el transplante de células madre derivadas de adiposo (ASC) hojas utilizando ingeniería hoja de la célula acelerado la cicatrización de heridas.

Las células estromales mesenquimales (MSCs) presentan un excelente potencial para acelerar la cicatrización de heridas por su capacidad de auto renovación, por sus efectos inmunomoduladores y su capacidad de diferenciarse en varios linajes de células3. ASCs son un tipo de MSC derivada de tejido adiposo, y presentan varias ventajas sobre los MSCs derivadas de otros tejidos, incluyendo su potencial angiogénico y paracrina actividad4,5. Tejido adiposo es relativamente abundante en el cuerpo humano, y su accesibilidad permite colección mediante procedimientos mínimamente invasivos. Por lo tanto, se han utilizado experimentalmente ASCs para cicatrización aplicaciones6,7.

Informes anteriores han demostrado que la inyección directa de suspensiones MSC unicelular en áreas alrededor de las heridas puede acelerar la cicatrización en8,9. Sin embargo, a pesar de informes de la aceleración de la cicatrización de heridas en los modelos de úlcera diabética después de la inyección de suspensiones celulares solo, no está claro el tiempo de supervivencia de las células trasplantadas en el sitio de la herida.

En este estudio, aplicamos ingeniería hoja de la célula usando platos de cultura sensible a la temperatura. Estos platos tienen la temperatura sensible polímero N- isopropylacrylamide covalentemente a su superficie10. La capa de polímero injertado permite la adhesión celular con control de temperatura a o desprendimiento de la superficie de la placa de cultivo. La superficie del plato se vuelve hidrofóbica a 37 ° C, permitiendo que las células para adherirse y proliferar, mientras que las células suelte espontáneamente de la superficie cuando se vuelve hidrófilo a temperaturas por debajo de 32 ° C. Las células cultivadas se pueden cosechar como una hoja de celdas contiguas con uniones célula a célula intactas y matrices extracelulares (ECMs) simplemente mediante la reducción de la temperatura; así, las enzimas proteolíticas que dañan el ECM, como la tripsina, no son necesarios11. Por lo tanto, ingeniería hoja de la célula puede preservar las conexiones de la célula a célula y mejorar la eficacia del trasplante de la célula.

Además, trasplante de la hoja de la célula aumenta las tasas de supervivencia de la célula en comparación con la célula de inyección12. En este protocolo, Zucker ratas diabéticas de (ZDF) grasosas fueron seleccionadas como un modelo de obesidad y diabetes tipo 2 con retraso de la cicatrización de heridas. Las ratas ZDF espontáneamente desarrollan obesidad en aproximadamente 4 semanas. Luego desarrollan diabetes tipo 2 con obesidad entre 8 y 12 semanas de edad, momento en el que exhiben hiperglucemia asociada con insulina resistencia, dislipemia e hipertrigliceridemia13. Retraso herida que cura, reducción del flujo sanguíneo en los vasos sanguíneos periféricos y la nefropatía diabética también se observan14,15,16. Además, las ratas ZDF podrían ser un modelo apropiado para el estudio de la curación de las úlceras cutáneas intratables, como las úlceras diabéticas.

Las diferencias entre los seres humanos y roedores en los mecanismos de cicatrización se asocian a las diferencias anatómicas en la piel. Herida que cura en ratas normales se basa en la contracción de la herida, mientras que la cicatrización de heridas en seres humanos se basa en la formación de tejido de granulación y reepitelización. Por lo general, herida ferulización utilizado en modelos de roedores ayuda a minimizar la contracción de la herida y permite la formación gradual de tejido de granulación17, aunque las heridas en diabéticos ratas son casi completamente cerradas por contracción. Sin embargo, el diabético herida contracción en ZDF ratas se deteriora, y cicatrizantes sobre todo se produce a través de reepitelización y formación de tejido de granulación; así, este proceso es más similar a la cicatrización humana14.

Diabéticas heridas con hueso expuesto después de desbridamiento se encuentran a menudo clínicamente. Estudios previos han examinado las heridas de piel de espesor total de 12 mm de diámetro sobre las espaldas de athymic mice desnudas18,19 y heridas de la piel de espesor total de 10 mm de diámetro sobre las espaldas de los ratones normales20. Para desarrollar un modelo clínico para heridas diabéticas severas, defectos más grandes de piel de espesor total (15 x 10 mm2) con exponen hueso y sin el periostio se crearon, como se describió anteriormente21, en ratas con diabetes tipo 2 y obesidad.

Hojas ASC (rASC) rata de ASCs de ratas Lewis normales fueron creadas por el trasplante alógeno de hojas ASC. En la práctica clínica, el trasplante autólogo es inviable porque los pacientes diabéticos con úlceras a menudo exhiben graves complicaciones diabéticas, como niveles de glucosa sanguínea alta sin control, índices de masa corporal alta y estos complicaciones causa cicatrización los trastornos que aumentan la dificultad de obtención de tejido adiposo de estos pacientes. Además, ASCs de animales con exposición de diabetes alteración propiedades y deterioraron función22. Por lo tanto, el protocolo que presentamos describe el trasplante alógeno de rASC hojas de ratas normales y la aplicación de piel artificial a ratas diabéticas.

La piel artificial de dos capas usada en este protocolo evita la contracción espontánea de las heridas, promueve la síntesis de una nueva matriz de tejido conectivo y se asemeja a la verdadera dermis23. En el presente Protocolo, la piel artificial se coloca en una hoja de rASC y fijo con hilos de nylon para evitar la contracción de la herida o ampliación resultante de piel de rata suelta. Además, la piel artificial proporciona un marco tridimensional para las hojas de la ASC, mantiene un ambiente húmedo para el trasplantado hojas ASC y heridas y protege las heridas de la infección y las fuerzas externas. Finalmente, se coloca un apósito no adhesivo sobre la herida para protegerla del impacto externo, mantener un ambiente húmedo de la herida y absorber el exudado.

Una hoja de rASC es fina, flexible y deformable y puede adherir a sitios receptores, como un latido corazón24en movimiento. Ingeniería de la hoja de la célula se ha utilizado para la reconstrucción de varios tejidos y puede generar efectos curativos25,26. Hojas ASC que exhiben potencial clínico terapéutico podrían acelerar la curación de muchos tipos de heridas. Además, el trasplante alogénico de las hojas de la ASC, combinado con el uso de piel artificial, podría ser aplicable al tratamiento de las úlceras intratables o quemaduras, como los observados en la enfermedad arterial periférica o enfermedad del colágeno, o puedan ser administrados a pacientes que están desnutridos o que están usando esteroides. Este enfoque aumenta la eficacia del trasplante ASC. El modelo de rata ZDF cicatrización produce una condición de la herida grave que se asemeja el proceso de cicatrización humana y simula las condiciones clínicas en un animal experimental pequeño.

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Protocolo

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Todos los protocolos experimentales presentados a continuación fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad Médica de Mujeres de Tokio y cumplieron con todos los requisitos de las Directrices para la Realización Adecuada de Experimentos con Animales.

1. Preparación de animales, instrumentos, medios de cultivo y platos

  1. Prepare un medio de cultivo completo utilizando un medio alfa esencial mínimo que contenga un 20% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina. Guárdelo durante varios meses a 4 °C hasta su uso.
  2. Utilice ratas ZDF macho adultas como modelo de obesidad diabética tipo 2. Utilice la almohadilla de grasa de ratas Lewis macho para aislar el tejido adiposo y preparar las láminas de células.

2. Aislamiento y cultura de rASCs

  1. Obtener tejido adiposo de ratas Lewis (8 a 33 semanas de edad, macho) bajo anestesia general con isoflurano.
    1. Prepare un ventilador mecánico para roedores e isoflurano al 4%. Prepare varias puntas de algodón estériles, gasas limpias, un bisturí, un portaagujas, tijeras de operación, un par de pinzas y una sutura de nailon 5-0. Esterilizar los instrumentos y suministros quirúrgicos.
    2. Prepare una placa de Petri de 100 mm con 10 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para preservar temporalmente el tejido adiposo obtenido. Pese la placa de Petri con PBS usando una balanza antes de comenzar la cirugía para medir el tejido adiposo recolectado. Coloque los instrumentos y suministros quirúrgicos sobre un paño estéril.
    3. Anestesiar a las ratas usando isoflurano al 3 - 4% a través de un ventilador mecánico para roedores y mantener a las ratas al 2 - 3% de isoflurano durante la cirugía. Controle la profundidad de la anestesia observando la profundidad y la frecuencia respiratoria de cada rata.
    4. Mientras usa guantes estériles, coloque a la rata en posición supina sobre un paño estéril. Afeitar el área operatoria con una maquinilla de afeitar eléctrica y limpiar la sección abdominal de la rata con una gasa estéril empapada en etanol al 70%.
    5. Realiza una incisión en la piel de aproximadamente 5 cm de largo con un bisturí en la parte inferior lateral del abdomen de la rata. Exponer y diseccionar el músculo oblicuo externo. Luego, exponer el tejido adiposo del epidídimo que rodea el epidídimo. Extraiga suavemente el tejido adiposo del epidídimo.
      NOTA: El tejido adiposo se puede obtener a ambos lados del abdomen de la rata.
    6. Extirpar solo el tejido adiposo del epidídimo, evitando dañar el epidídimo, los testículos y los vasos sanguíneos del epidídimo (Figura S1). Remoje el tejido adiposo extirpado en el PBS en la placa de Petri para evitar la sequedad y pesar el tejido.
    7. Cerrar el músculo abdominal con VICRYL 5-0 y la piel con una sutura de nylon 5-0. Luego, devuelva cada rata que se haya sometido a una cirugía a una jaula separada (una rata por jaula).
      NOTA: Monitoree a las ratas hasta que se recuperen por completo.
  2. Aísle rASCs de 2 a 3 g de tejido adiposo (extirpado de una rata Lewis y procesado de acuerdo con un método previamente informado)27. Digestión enzimática y breve del tejido adiposo extirpado con colagenasa tipo A al 0,1% a 37 °C durante 1 h para obtener la fracción estroma-vascular (SVF; Figura S2).
    1. Prepare varios filtros de células de 100 μm, varios tubos de 50 mL, varios tubos de 15 mL y dos bisturíes en un banco de limpieza biológica. Encienda una centrífuga y caliente un baño de agua a 37 °C. Además, prepare aproximadamente 50 mL de PBS estéril en un tubo de 50 mL con 0,1% (concentración final) de colagenasa tipo A.
    2. Pica el tejido adiposo en trozos pequeños con dos bisturís.
    3. Mueva todo el tejido adiposo picado a un tubo de 50 mL y agregue PBS para llevar el volumen total a 15 mL.
    4. Coloque el tubo de 50 ml en posición vertical durante 5 min. Deseche la capa superior y recoja la capa inferior excepto los residuos.
    5. Añadir un 0,1% de solución de colagenasa tipo A al tubo de 50 mL con PBS que contiene la capa superior para digerir enzimáticamente el tejido adiposo.
      NOTA: Calentar aproximadamente 20 mL de PBS por 2 - 3 g de tejido adiposo en un baño de agua a 37 °C.
    6. Incline y agite suavemente el tubo de 50 ml a 120 - 130 rpm durante 1 h en un baño de agua a 37 °C.
    7. Coloque el tubo de 50 ml en posición vertical durante 5 minutos después de agitar.
    8. Filtre la solución con un filtro de células de 100 μm y vierta la solución en un nuevo tubo de 50 mL. Dispense la solución filtrada en dos tubos de 15 ml.
    9. Centrifugar la solución en los tubos de 15 ml durante 5 min a 700 x g. Retire con cuidado la capa superior del sobrenadante y deje 5 mL de la capa inferior de la solución. No aspire el pellet.
    10. Agregue aproximadamente 5 mL de medio de cultivo completo a cada tubo de 15 mL, hasta 10 mL por tubo de 15 mL, y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet.
    11. Repita los pasos 2.2.8 - 2.2.9. A continuación, obtenga el SVF.
  3. Prepara dos platos de cultivode 60 cm 2. Recoja la SVF después de dos centrifugaciones a 700 × g durante 5 min. Suspenda la SVF y coloque 10 mL de solución de SVF en cada placa de cultivo de60 cm 2.
  4. Cultive las placas durante 24 h a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2.
  5. Prepare PBS y ácido tetraacético de tripsina-etilendiamina (EDTA) al 0,25%, almacenable durante varios meses a 4 °C hasta su uso.
  6. Después del recubrimiento inicial (24 h), lave las celdas con PBS 3 veces para eliminar las celdas sueltas y los desechos. Agregue el medio completo fresco.
  7. Pase las células que están casi subconfluentes en el día 3. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 3 - 5 min.
    NOTA: Complete el paso de tripsinización dentro de los 10 minutos para evitar el daño celular.
  8. Observe las células bajo un microscopio óptico después de la tripsinización para confirmar que todas las células se han desprendido completamente de los platos. A continuación, añada 9 mL de medio de cultivo completo a los platos.
  9. Cuente el número de células con un hemocitómetro.
  10. Subcultive las células a una densidad de 1,7 x 103 células/cm2 cada 3 días hasta el paso 3. Cultive las células subcultivadas a 37 °C en la atmósfera humidificada de una incubadora con 5% de CO2.

3. Creación de hojas rASC

  1. Prepare varias placas de cultivo de 35 mm de diámetro que respondan a la temperatura. Cubra previamente las placas con FBS (o medio completo que contenga FBS) a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5% durante más de 1 h.
    NOTA: Una placa de cultivo sensible a la temperatura de 35 mm de diámetro es un producto disponible comercialmente.
  2. Preparar una placa térmica e incubar a 37 °C para los siguientes procedimientos experimentales.
    NOTA: Realice todos los procedimientos utilizando placas de cultivo sensibles a la temperatura en una placa térmica a 37 °C para evitar que las células se desprendan espontáneamente de la placa.
    1. Calentar el medio de cultivo completo utilizado en los procedimientos a 37 °C antes de la experimentación.
    2. Paso de semillas 3 rASCs derivadas de ratas Lewis a una placa de cultivo sensible a la temperatura de 35 mm de diámetro a una densidad de 1,5 x 105 células/placa durante 3 días utilizando un volumen total de 2 mL de medio de cultivo completo.
      NOTA: Cuando los rASC se colocan en una nueva placa de cultivo, la placa debe balancearse lentamente hacia adelante y hacia atrás y hacia la izquierda y hacia la derecha en una incubadora para lograr una siembra uniforme de rASC y una hoja de rASC uniformemente gruesa.
    3. Cambie 2 mL del medio por 2 mL de medio de cultivo completo que contenga 16,4 μg/mL de ácido L-ascórbico, fosfato, sal de magnesio, n-hidrato (AA) el día 3 después de la siembra en las placas de cultivo sensibles a la temperatura incubadas en una termoplaca a 37 °C.
      NOTA: El AA disuelto puede almacenarse a -30 °C durante meses.
    4. Cultive las células durante 4 a 5 días adicionales y reemplace el medio cada 2 días con medio fresco que contenga AA.
    5. Confirmar la proliferación y generación de ASC bajo un microscopio óptico para determinar si se produjeron espacios entre las células en una lámina celular contigua.
  3. Transfiera las láminas de celdas de la incubadora a la mesa de trabajo durante 15 a 20 minutos para enfriarlas a temperatura ambiente; observe cómo las celdas se desprenden espontáneamente como una lámina de celdas contigua. Coseche la hoja de rASC de la superficie del plato con un par de pinzas.
    NOTA: Por lo general, las sábanas rASC se pueden manipular con un par de pinzas. Si es necesario, se puede usar una membrana de transferencia para transferir una lámina celular desde la placa de cultivo hasta el sitio de la herida si la lámina celular es quebradiza y frágil.

4. Preparación del modelo de herida con defecto cutáneo de espesor completo y trasplante de láminas rASC

  1. Prepare un ventilador mecánico para roedores e isoflurano al 4%. Prepare varias puntas de algodón estériles, gasa limpia, sutura de nailon 5-0, un bisturí, una raspadora perióstica, un portaagujas, tijeras de operación y un par de pinzas. Esterilizar los instrumentos y suministros quirúrgicos. Coloque los instrumentos y suministros quirúrgicos sobre un paño estéril.
  2. Prepare el PBS y manténgalo a temperatura ambiente, junto con un poco de piel artificial y un apósito no adhesivo. Precorte la piel artificial (15 x 10 mm) y el apósito no adhesivo (20 × 15 mm). Remoje la capa interna de esponja de colágeno de la piel artificial en solución salina antes de usar la piel artificial.
    NOTA: La piel artificial está formada por dos capas: una capa exterior de lámina de silicona y una esponja interior de colágeno.
  3. Utilice ratas ZDF (de 16 a 18 semanas de edad, machos, 500 a 600 g) como modelo de cicatrización de heridas para la diabetes tipo 2 y la obesidad.
  4. Anestesiar a las ratas ZDF por inhalación de isoflurano al 4% utilizando un ventilador mecánico para roedores. Inducir la anestesia mediante el uso de isoflurano al 4 - 5% a través de un ventilador mecánico en roedores y mantenerla al 3 - 4% durante la cirugía. Controle la profundidad de la anestesia observando la profundidad y la velocidad de la respiración de cada rata a través de un pellizco en el dedo del pie.
  5. Mientras usa guantes estériles, coloque a la rata en posición prona sobre un paño estéril. Limpie la cabeza de la rata con una gasa estéril empapada en etanol al 70%, afeite el área operatoria con una maquinilla de afeitar eléctrica y limpie la piel después del afeitado con una gasa estéril empapada en etanol al 70%.
  6. Crear un defecto cutáneo cuadrado de espesor completo (15 x 10 mm2) en la cabeza de las ratas ZDF anestesiadas mediante la eliminación del tejido cutáneo desde la epidermis hasta el periostio. Extirpar la piel y el tejido cutáneo con un bisturí y extraer el periostio con un raspador perióstico.
  7. Mueva los rASC de la placa de cultivo sensible a la temperatura de 35 mm de la incubadora a un entorno a temperatura ambiente inmediatamente antes del trasplante.
  8. Observe que los rASC en la placa de cultivo sensible a la temperatura de 35 mm se desprenden espontáneamente como una hoja de la superficie de la placa después de la formación de una herida. Coseche las hojas de rASC después de 7 días de cultivo en placas de cultivo sensibles a la temperatura. Retire el medio cultivado y lave la hoja de rASC con PBS tres veces. Remoje la lámina de rASC en PBS hasta el trasplante para evitar la desecación.
  9. Coloque la lámina rASC inmediatamente sobre el defecto del cráneo con un par de pinzas. Si la lámina celular es quebradiza y frágil, se puede usar una membrana como andamio para transferir la lámina celular desde la placa de cultivo hasta el sitio de la herida.
  10. Cubrir la lámina de rASC y el defecto con la piel artificial (15 x 10mm2) y cerrar la herida con aproximadamente 10 puntos utilizando la sutura de nylon 5-0. Para proteger la herida, coloque un apósito no adhesivo (20 x 15 mm2) sobre la piel artificial, utilizando suturas de nailon 5-0 para mantener húmedo el entorno de la herida y absorber los exudados><. NOTA: Los apósitos no adhesivos serán retirados por las ratas ZDF a los pocos días de su aplicación. Por lo tanto, es necesario monitorear regularmente a las ratas después del trasplante. Por lo general, el apósito no adhesivo se reemplaza cada 2 días bajo anestesia general.
  11. Regrese cada rata que se haya sometido a una cirugía a una jaula separada hasta que se hayan recuperado por completo (una rata por jaula). Después de un período de observación, eutanasiar a las ratas utilizando el método aprobado de sobredosis de isoflurano.

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Resultados

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Este protocolo intentó establecer una nueva terapia celular para las heridas diabéticas insuperables. Brevemente (como se ilustra en la figura 1), hojas de allogeneic rASC fueron creadas de las ratas normales utilizando ingeniería hoja de la célula y luego fueron trasplantadas con una bicapa de piel artificial a un defecto de piel de espesor total en una rata diabética. Imágenes de microscopio de luz de un buen ejemplo de una hoja de rASC (figura 2A) y un...

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Discusión

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Los pasos más críticos para el cultivo con éxito de una hoja de rASC son los siguientes: 1) la temperatura debe mantenerse a unos 37 ° C durante el cultivo en los platos de la cultura sensible a la temperatura. Durante la creación de una hoja de rASC, cada procedimiento fue realizado en una placa térmica de 37 ° C, y cada reactivo fue calentado a 37 ° C para evitar que las células espontáneamente extracción desde el plato31. 2) las ratas ZDF destinatarias deben controlarse para evitar la remoción ...

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Divulgaciones

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Los siguientes autores revelen relaciones financieras relevantes para esta publicación: Teruo Okano es fundador y director de la Junta de la célula semilla Inc., que licencias de tecnología y patentes de la Universidad de medicina de la mujer de Tokio, y Teruo Okano y Masayuki Yamato son partes interesadas en la Universidad de medicina de la célula semilla Inc. Tokyo mujeres recibe fondos de la investigación de la célula semilla Inc. Otros autores declaran que no tienen relaciones financieras relevantes para esta publicación.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a Dr. Yukiko Koga del Departamento de plástica y reconstructiva, Juntendo University School of Medicine, para proporcionar consejos prácticos. También agradecemos al Sr. Hidekazu Murata del centro de Tokio diabéticas de médica Facultad de Medicina Universidad excelente soporte técnico. Este estudio fue apoyado por la creación de centros de innovación de avanzada programa interdisciplinario de investigación áreas del proyecto para los sistemas de innovación en desarrollo "celda hoja de tejido ingeniería centro (CSTEC)" desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT) de Japón.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
α-MEM glutamaxInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
Suero fetal bovino (FBS)Japan Bioserum Co Ltd.S1650-500
Penicilina/estreptomicinaLife Technologies15140-122
Colagenasa ARoche Diagnostics10 103 578 001Mannheim, Alemania
60 cm2 Placa de cultivo de tejidos primariaBD Biosciences353803Franklin Lakes, NJ
Solución salina tampón de fosfato de Dulbecco (PBS)Life Technologies1490-144
0.25% Tripsina-etilendiamina ácido tetraacético (EDTA)Life Technologies25200-056
Ácido L-ascórbico fosfato sal de magnesio n-hidratoWako013-19641
placa de cultivo sensible a la temperatura de 35 mm (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904Tokio, Japón
Placa de microcalentamiento (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Ventilador mecánico para roedoresStoelting#50206Wood Dale, IL
4% isofluranoPfizer Japón114-13340-3Tokio, Japón
Piel artificial (Pelnac® )Smith & SobrinoPN-R40060  Tokio, Japón
Apósito no adhesivo (Hydrosite plus® )Smith & Sobrino66800679Conocido como Allevyn sin adhesión® en Estados Unidos
5-0 sutura de nylonAlfresaEP1105NB45-KF2
20 TUBOS CELLSTARGreiner Bio-One227 261
15 mL Tubo de centrífugaCorning Incorporated430791
14 GOLDMAN-FOX PERIÓSTICOHu-FriedyP14Chicago, IL

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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