La adsorción de péptidos a los materiales de plástico durante las diluciones en serie tradicionales basadas en puntas puede afectar significativamente la determinación de la potencia y confundir la comprensión de las relaciones estructura-actividad utilizadas para las fases de identificación y optimización de pistas del descubrimiento de fármacos. Aquí se describen los métodos para la dilución en serie acústica automatizada sin contacto de muestras de péptidos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Automatizado de dispensación acústica para la dilución en serie del péptido Los agonistas de la potencia Ensayos de Determinación
En este artículo
Resumen
Resumen
Al igual que con el descubrimiento de fármacos pequeña molécula, el cribado de agonistas de péptidos requiere la dilución en serie de péptidos para producir curvas de concentración-respuesta. Screening péptidos proporciona una capa adicional de complejidad como los métodos de manipulación de muestra basada en la punta convencionales exponen péptidos a una gran superficie de material de plástico, proporcionando una mayor oportunidad para la pérdida de péptido a través de la adsorción. La prevención de la exposición excesiva a recipientes de plástico reduce la pérdida de péptido a través de la adhesión a los plásticos y por lo tanto minimiza las imprecisiones en la predicción de la potencia, y se han descrito anteriormente los beneficios de la acústica de no contacto de dispensación para cribado de alto rendimiento in vitro de agonistas de péptido 1. Aquí hablamos de una solución de automatización totalmente integrado para la preparación de no contacto acústico de diluciones en serie de péptidos en placas de microtitulación utilizando el ejemplo de la detección de agonistas peptídicos en el péptido similar al glucagón-1 receptor de ratón (GLP-1R). Nuestros métodos permiten altaLos ensayos para la detección de agonistas -throughput basados en células y son fácilmente escalable para soportar el aumento de rendimiento de la muestra, o para permitir el aumento del número de copias placa de ensayo (por ejemplo, para un panel de más líneas de células diana).
Introducción
El GLP-1R es una diana de fármaco establecido en el tratamiento de la diabetes tipo 2 2. El agonista de péptido nativo para este receptor, GLP-1, tiene una in vivo la vida media de 2 a 3 min 3. La unión de GLP-1 a sus acoplados a proteínas G resultados receptor diana en la producción corriente abajo de la segunda mensajero AMPc a través de acoplamiento nativo proteína G a la activación de la adenilato ciclasa. La medición de la cAMP acumulado proporciona un sólido ensayo para controlar la activación del receptor y para la detección de activos análogos de GLP-1 con propiedades físico-químicas preferidas. un ensayo de este tipo requiere l....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Péptido dilución en serie
- Preparar tampón de ensayo: solución salina tamponada Hanks (HBSS) suplementado con HEPES 25 mM, 0,1% de BSA y 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), pH 7,4.
- Utilice un dispensador de reactivos a granel para añadir sistemáticamente 5 l de tampón de ensayo a cada pocillo de cinco placas de 384 pocillos de bajo volumen de ensayo.
- Utilice el software interno para crear un programa de dispensación para 5 l volumen de adición a cada pocillo de una placa de 384 pocillos según las instrucciones del fabricante.
- Sumergir los tubos de distribución de cassette en tampón de ensayo y líquido primordial.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Como rutina usamos un método de dos pasos para diluir los péptidos a través de transferencia acústica. Para el primer paso, un distribuidor acústico alineado con la automatización se utiliza para crear cuatro diluciones intermedias de stock de péptidos a través de dos placas de origen (Figura 1a, b). Para la segunda etapa, se utiliza un distribuidor acústico para diluir aún más diluciones del stock de placas de fuente A y B para crear un intervalo .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo describe la aplicación exitosa de dispensación acústico automatizado para diluir en serie muestras de péptidos en un rango de concentración de 3 x 10 6 que requiere menos de 1 l de muestra. La principal ventaja de este método es aumentar la calidad de los datos a través de minimizar la adsorción de péptido a recipientes de plástico a través de una menor exposición de las muestras a los contenedores experimentales y recipientes de plástico (por ejemplo, puntas de pipeta) que normalmente se requi.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Hanks' Solución salina equilibrada | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-isobutil-1-metilxantina | Sigma-Aldrich | I7018 | Preparada como culata de 0,5 M en DMSO |
| GLP-1 (7-36) amida | Bachem | H-6795 | Preparado como un stock de 1 mg/ml en PBS, denominado 'control de referencia 100x' |
| Péptidos de prueba | Producido internamente en MedImmune | Suministrado a varias concentraciones en DMSO o PBS, según corresponda | |
| Stock de péptidos 100x | Producido internamente en MedImmune | Péptido de prueba diluido en tampón de ensayo a 100 veces la concentración final requerida | |
| Solución de azul de tripano, 0,4 % | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Analizador de células Cedex XS | Innovatis | ||
| Corning Placas de 384 pocillos, bajo volumen | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Microplaca de polipropileno | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Manipulador de líquidos | Labcyte Inc. | Volúmenes de transferencia de gotas en incrementos de 2,5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Volúmenes de transferencia de gotas en incrementos de 25 nl | |
| ACell Automatización de sobremesa | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Software de programación para robótica de ciencias | de la vida HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Dispensador de reactivos | ThermFisher Scientific | 5840300 | Denominado 'dispensador de reactivos a granel'HTRF |
| cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
Referencias
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, phys....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
