Generación de dos colores con antígeno microarrays para la detección simultánea de autoanticuerpos IgG e IgM

Resumen

Describimos aquí un método para generar microarrays de antígenos personalizables que se pueden utilizar para la detección simultánea de autoanticuerpos séricos IgG e IgM de humanos y ratones. Estas matrices permiten la detección cuantitativa y de alto rendimiento de anticuerpos contra cualquier antígeno o epítopo de interés.

Resumen

Los autoanticuerpos, que son anticuerpos contra los autoantígenos, están presentes en muchos estados de enfermedad y pueden servir como marcadores de la actividad de la enfermedad. Los niveles de autoanticuerpos contra antígenos específicos generalmente se detectan con la técnica de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Sin embargo, el cribado de múltiples autoanticuerpos con ELISA puede llevar mucho tiempo y requiere una gran cantidad de muestra del paciente. La técnica de microarrays de antígenos es un método alternativo que se puede utilizar para el cribado de autoanticuerpos de forma múltiple. En esta técnica, los antígenos se colocan en portaobjetos de microscopio especialmente recubiertos con un microarrayer robótico. Los portaobjetos se sondean con muestras de suero del paciente y, posteriormente, se añaden anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia para detectar la unión de los autoanticuerpos séricos a los antígenos. Las reactividades de los autoanticuerpos se revelan y cuantifican escaneando los portaobjetos con un escáner que puede detectar señales fluorescentes. Aquí describimos métodos para generar microarrays de antígenos personalizados. Nuestras matrices actuales se imprimen con 9 pines sólidos y pueden incluir hasta 162 antígenos detectados por duplicado. Las matrices se pueden personalizar fácilmente cambiando los antígenos en la placa fuente que utiliza el microarrayer. Hemos desarrollado un esquema de detección de anticuerpos secundarios de dos colores que puede distinguir las reactividades de IgG e IgM en la misma superficie de portaobjetos. El sistema de detección se ha optimizado para estudiar la unión de autoanticuerpos humanos y murinos.

Introducción

Los autoanticuerpos están presentes en muchos estados de enfermedad y a menudo pueden tener actividad patógena directa¹. La identificación de autoanticuerpos es importante para el diagnóstico de ciertas enfermedades, para el pronóstico de la evolución de la enfermedad y para la clasificación de los pacientes que pueden beneficiarse de terapias específicas². Por lo general, los autoanticuerpos se identifican en el suero del paciente mediante la técnica ELISA; Sin embargo, el cribado de múltiples antígenos con esta técnica es laborioso y consume una gran cantidad de muestra del paciente. Por lo tanto, se necesitan nuevas tecnologías para perfilar los autoanticuerpos a mayor escala.

La técnica de microarrays de antígenos es una tecnología proteómica que permite perfilar autoanticuerpos de forma múltiple³. En el primer paso de este proceso, una biblioteca de antígenos se coloca en una superficie de portaobjetos utilizando un microarray robótico. Los portaobjetos se sondean con suero diluido y luego se agregan anticuerpos secundarios marcados con fluorescente. Las reactividades de los anticuerpos se visualizan escaneando los portaobjetos con un escáner de microarrays y se cuantifican mediante intensidades fluorescentes. Los microarrays de antígenos ofrecen múltiples ventajas sobre la técnica ELISA en el cribado de autoanticuerpos: 1) sólo requieren microlitros de suero para perfilar los autoanticuerpos frente a múltiples antígenos simultáneamente, 2) utilizan el antígeno con moderación, ya que sólo se detectan nanolitros de antígeno en las matrices, 3) tienen una sensibilidad mejorada³ en comparación con ELISA y 4) permiten la simultaneidad todavía, Detección por separado de más de un isotipo de anticuerpo. Los microarrays de antígenos se han utilizado para perfilar autoanticuerpos en enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple y el lupus eritematoso sistémico^4-6. En estas tres enfermedades, se obtuvo una nueva visión de la patogénesis de la enfermedad a partir del perfil de autoanticuerpos a gran escala con las matrices.

Aquí describimos un protocolo para generar microarrays de antígenos utilizando portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa. Con esta técnica, se puede colocar una variedad de antígenos, incluidas proteínas, péptidos y lisados celulares. Las matrices se pueden personalizar fácilmente incluyendo antígenos de interés en la placa fuente que contiene la biblioteca de antígenos. Además, mostramos cómo se puede utilizar un par de anticuerpos secundarios para separar las reactividades de IgG e IgM en la misma superficie de portaobjetos. Ahora hemos optimizado esta técnica para medir los autoanticuerpos tanto en humanos como en ratones.

Protocolo

1. La dilución de antígenos y la generación de antígeno Microarrays

1. Diluir antígenos en PBS a una concentración final de 0,2 mg / ml. Imprimir hasta 162 antígenos únicos en duplicado con una configuración microarrayer con 9 pines. Incluyen antígenos de IgG e IgM en la biblioteca de antígeno como controles positivos. Incluir PBS únicamente como un control negativo.
2. Añadir 20 l de cada antígeno a la placa de fuente de 384 pocillos. Añadir antígenos a la placa de fuente en grupos que reflejan la configuración del cabezal de impresión (por ejemplo, organizar antígenos en grupos de 9 cuando se utilizan para la impresión de 9 pines).
3. placa de fuente de la cubierta con papel aluminio y congelar a -80 ° C hasta que esté listo para imprimir matrices.
4. Limpiar pasadores microarrayer sólidos mediante su incubación en un baño de sonicación con agua desionizada durante 3 x 1 min. Coloque pines en rejilla para que se seque y luego ordenar alfileres en la cabeza de impresión de microarrays. Por 9 pines, utilice una configuración de 3 x 3.
5. microarrayer programa para ejecutar la impresión mediante el establecimiento de botones número de cabezal de impresión,número de diapositivas para imprimir, el número de pastillas en cada diapositiva, y el número de manchas idénticas para cada antígeno. Por lo general, el uso de 9 pines, 70 toboganes, 2 almohadillas / deslizante, y 2 puntos idénticas para cada antígeno. microarrayer programa para sonicar pasadores en el agua entre los diferentes grupos de antígenos.
6. placa de fuente de deshielo y la placa después centrifugar durante 1 min a 100 x g. Coloque la placa de origen en lugar designado en microarrayer. Retire la sección de papel de aluminio que cubre el primer grupo de antígenos para ser impreso.
7. Organizar las diapositivas impresas en la superficie arrayer y ejecución del programa de impresión. Imprimir diapositivas a temperatura ambiente con humedad establecido en el arrayer al 55 - 60% con la estructura en humidificador de la máquina matriz.
8. Después de cada grupo de antígenos se imprime en todas las diapositivas, hacer una pausa en la microarrayer. Cubrir los antígenos que se acaban de imprimir con papel de aluminio (para evitar la evaporación) y descubrir el siguiente grupo de antígenos que se desea imprimir. Continuar programa de impresión.
9. Después de que se impriman todas antígenos, fuente cubierta de plcomió con el nuevo trozo de papel de aluminio y se congelan a -80 ° C. Coloque las diapositivas impresas en la caja portaobjetos y sellado al vacío. Las diapositivas se puede usar al día siguiente o hasta un mes después.

2. Sondeo de antígeno diluido con micromatrices Sera

1. Colocar los portaobjetos en tramas utilizando cámaras de incubación. Añadir 700 l de tampón de bloqueo (2,5% [vol / vol] de suero de ternera fetal (FCS), 0,1% [vol / vol] de Tween 20 en PBS) a cada superficie de la matriz.
2. Coloque película adhesiva sobre el marco y colocar en un recipiente sellado con un trozo de tejido húmedo. Incubar O / N a 4 ° C en un agitador.
3. Diluir las muestras de suero 1: 100 en tampón de bloqueo. Aspirar la solución de bloqueo de las matrices y añadir 500 l de muestra diluida a cada superficie de la matriz.
4. Cubrir con film adhesivo y se incuba durante 1 hora a 4 ° C con agitación.
5. Diluir los anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo. Para los estudios en humanos, se diluye un anticuerpo de cabra IgG Cy3 anti-humana marcada a 0,33 g / ml y un Cy5 etiquetados de cabra anti-human anticuerpo IgM a 0,25 g / ml. Para los estudios del ratón, diluir una Cy3 marcado anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón a 0,38 g / ml y un anticuerpo marcado con Cy5 anti-IgM de ratón de cabra a 0,7 g / ml.
6. muestras de aspirado de matrices y enjuagar las superficies de matriz 4 veces con tampón de lavado (0,1% Tween 20 en PBS). Vierta en tampón de diapositivas y con un tirón rápidamente.
7. Añadir 700 l de tampón de bloqueo para lavar cada superficie de la matriz e incubar 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Repita el paso de lavado dos veces más.
8. Añadir 500 l de anticuerpo secundario diluido a cada superficie de deslizamiento y cubrir con film adhesivo. Incubar 45 min a 4 ° C con agitación.
9. Aspirar mezcla secundaria de anticuerpos a partir de diapositivas y enjuague 4 veces más arriba. Lavar los portaobjetos 3 veces con 700 l de tampón de bloqueo / dilución que el anterior.
10. Retirar los portaobjetos de marcos y lugar en la parrilla corrediza de metal que se encuentra inmersa en PBS. Incubar 20 min a RT con agitación orbital. Colocar en nuevo contenedor de PBS y se incuba otros 20 mcon agitación.
11. rejilla deslizante depositarlo en un recipiente de agua desionizada 15 seg. Coloque la parrilla en un nuevo recipiente con agua y se incuba otros 15 seg.
12. Para secar los portaobjetos, coloque el estante deslizante en un adaptador de placa de ELISA en centrífuga y centrifugado a 220 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente.
13. Colocar los portaobjetos en la caja hermética a la luz hasta que esté listo para escanear.

3. Escaneo antígeno Microarrays y exportación de datos

1. diapositivas de escaneo mediante un escáner de microarrays que puede detectar señales fluorescentes Cy3 y Cy5. Con el fin de ajustar los niveles de tubo fotomultiplicador (PMT) del scanner, pre-escanear una diapositiva que sólo se sondeó con anticuerpos secundarios.
   Nota: Esta diapositiva debe tener la biblioteca antígeno completo impreso en ella incluyendo positivo (IgG e IgM), así como controles negativos (PBS). El pre-scan es una exploración de baja resolución, que permite al usuario encontrar rápidamente a los ajustes óptimos PMT.
2. Establecer los valores de PMT para que las funciones humanas IgG (en el canal de Cy3) y el zumbidouna características IgM (en el canal Cy5) tienen una intensidad media de fluorescencia similares, menos de fondo (IMF-B) (típicamente 40.000). Los niveles de PMT se ajusta pulsando el botón de "hardware". Una vez establecido, mantener estos ajustes PMT constante.
3. Escanear las diapositivas experimentales en los dos canales pulsando el botón "Scan". Guardar las imágenes de diapositivas (ambos canales) después de cada escaneo.
4. Cargar la diapositiva a analizar en el software de microarrays utilizando el botón "archivo".
5. Cargar el archivo de lista de conjunto de genes (GAL) utilizando el botón "archivo". El archivo GAL tiene el diseño de la matriz con la identidad de las características de la matriz.
6. Colocar la plantilla de matriz sobre la imagen escaneada de manera que las matrices de características coinciden con la plantilla lo más estrechamente posible.
7. Alinear características en todos los bloques con la plantilla pulsando el botón "align". El programa general, encontrar el resumen de las características circulares pero algunos ajustes manuales, puede ser necesario. Estos ajustes se pueden hacer entrando al modo de función. El software calculará entonces un MFI-B para cada uno de los antígenos.
8. Utilice el botón "archivo" para exportar estos resultados como un archivo de texto.

4. Análisis de datos de matriz con el análisis de la importancia microarrays (SAM)

1. Cargar archivos de texto individuales en Excel e identificar las columnas que tienen MFI-B para los canales de Cy3 y Cy5.
2. Calcular la media de las funciones duplicadas.
3. Para cualquier negativa MFI-B, reemplace el número negativo con 10. Transformar los datos en bruto dividiendo MFI-B por 100 y después mediante el cálculo de logaritmo en base 2.
4. Analizar los datos transformados logarítmicamente con el análisis de la importancia microarrays (SAM) como se ha descrito previamente ^7.
5. Para un estudio con dos grupos (por ejemplo, controles sanos frente a pacientes), la etiqueta de un grupo "1" y el grupo "2." Utilice una de dos clases, el análisis no apareado en el SAM para identificar los antígenos que son reactividades significantly diferente entre los dos grupos (valor q <0,05).
6. Utilice el software de clustering y de generación de calor de ruta para hacer imágenes para su presentación ^8.

Resultados

Los antígenos están dispuestos en una placa de 384 pocillos y se imprimen en portaobjetos por un microarrayer robótico, como se muestra en la Figura 1. La figura 2 muestra las diapositivas colocados en un marco con cámaras de incubación y una diapositiva explorada después del procesamiento. La figura 3 muestra portaobjetos de control positivo y negativo. La corredera negativo solamente se sondea con anticuerpos secundarios, y el control ...

Discusión

El protocolo descrito aquí permite la cuantificación de autoanticuerpos utilizando la técnica de microarray antígeno. microarrays de antígeno ofrecen varias ventajas sobre ELISA convencional en la detección de autoanticuerpos. En primer lugar, una variedad de antígenos, incluyendo ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, y los lisados ​​celulares se puede vestida sobre los portaobjetos de nitrocelulosa recubierto, lo que permite la detección de autoanticuerpos multiplexada. Además, sólo microgramos de antígeno son necesar...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ribosomal P0	Diarect	14100	diluido a 0,2 mg/ml en PBS
IgG humana	Jackson Immuno	009-000-003	diluido a 0,2 mg/ml en PBS
humano IgM	Immuno	009-000-012	diluido a 0,2 mg/ml en PBS
ratón IgG	Sigma-Aldrich	I5381	diluido a 0,2 mg/ml en PBS
ratón IgM	Biolegend	401601	diluir a 0,2 mg/ml en PBS
ADN bicatenario	Sigma-Aldrich	D1626	diluir a 0,2 mg/ml en PBS
ADN monocatenario	Sigma-Aldrich	D8899	diluido a 0,2 mg/ml en PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	Muchos tipos de arrayers son adecuados
pines de impresión sólidos	Arrayit Corporation	SSP015
software para microarrayer robótico	Virtek	Chipwriter Pro
Portaobjetos FAST (2 almohadillas)	GVS Northa America	10485317
marco FAST		GVS Northa America
FAST (2 almohadillas)	GVS Northa America	10486242
placas de 384 pocillos Selladoras de	Whatman	7701-5101
		60941-062
	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Suero fetal para terneros	Invitrogen 12483020
Cy3 cabra anti-humano IgG	Jackson Immuno	109-165-096	uso de material de trabajo en 50% glyercol
Cy5 cabra anti-humano IgM	Jackson Immuno	109-175-129	uso de material de trabajo en 50% glyercol
Cy3 cabra anti-ratón IgG	Jackson Immuno	115-165-071	uso de material de trabajo en 50% glyercol
Cy5 cabra anti-ratón IgM	Jackson Immuno	115-175-075	uso de material de trabajo en 50% glyercol
Escáner de microarrays	Molecular Devices	Axon 4200A
Software de microarrays	Molecular Devices	Genepix 6.1
Software de agrupación	eisenlab.org	Cluster 3.0
Software de mapas de calor	eisenlab.org	Treeview 1.60
Software estadístico de microarrays	Universidad de Stanford	SAM 4.0 (Análisis de significación de microarrays)