Describimos aquí un método para generar microarrays de antígenos personalizables que se pueden utilizar para la detección simultánea de autoanticuerpos séricos IgG e IgM de humanos y ratones. Estas matrices permiten la detección cuantitativa y de alto rendimiento de anticuerpos contra cualquier antígeno o epítopo de interés.
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Artículo de método
Generación de dos colores con antígeno microarrays para la detección simultánea de autoanticuerpos IgG e IgM
En este artículo
Resumen
Resumen
Los autoanticuerpos, que son anticuerpos contra los autoantígenos, están presentes en muchos estados de enfermedad y pueden servir como marcadores de la actividad de la enfermedad. Los niveles de autoanticuerpos contra antígenos específicos generalmente se detectan con la técnica de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Sin embargo, el cribado de múltiples autoanticuerpos con ELISA puede llevar mucho tiempo y requiere una gran cantidad de muestra del paciente. La técnica de microarrays de antígenos es un método alternativo que se puede utilizar para el cribado de autoanticuerpos de forma múltiple. En esta técnica, los antígenos se colocan en portaobjetos de microscopio especialmente recubiertos con un microarrayer robótico. Los portaobjetos se sondean con muestras de suero del paciente y, posteriormente, se añaden anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia para detectar la unión de los autoanticuerpos séricos a los antígenos. Las reactividades de los autoanticuerpos se revelan y cuantifican escaneando los portaobjetos con un escáner que puede detectar señales fluorescentes. Aquí describimos métodos para generar microarrays de antígenos personalizados. Nuestras matrices actuales se imprimen con 9 pines sólidos y pueden incluir hasta 162 antígenos detectados por duplicado. Las matrices se pueden personalizar fácilmente cambiando los antígenos en la placa fuente que utiliza el microarrayer. Hemos desarrollado un esquema de detección de anticuerpos secundarios de dos colores que puede distinguir las reactividades de IgG e IgM en la misma superficie de portaobjetos. El sistema de detección se ha optimizado para estudiar la unión de autoanticuerpos humanos y murinos.
Introducción
Los autoanticuerpos están presentes en muchos estados de enfermedad y a menudo pueden tener actividad patógena directa1. La identificación de autoanticuerpos es importante para el diagnóstico de ciertas enfermedades, para el pronóstico de la evolución de la enfermedad y para la clasificación de los pacientes que pueden beneficiarse de terapias específicas2. Por lo general, los autoanticuerpos se identifican en el suero del paciente mediante la técnica ELISA; Sin embargo, el cribado de múltiples antígenos con esta técnica es laborioso y consume una gran cantidad de muestra del paciente. Por lo tanto, se necesitan nuevas tecnologías para perfilar l....
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Protocolo
1. La dilución de antígenos y la generación de antígeno Microarrays
- Diluir antígenos en PBS a una concentración final de 0,2 mg / ml. Imprimir hasta 162 antígenos únicos en duplicado con una configuración microarrayer con 9 pines. Incluyen antígenos de IgG e IgM en la biblioteca de antígeno como controles positivos. Incluir PBS únicamente como un control negativo.
- Añadir 20 l de cada antígeno a la placa de fuente de 384 pocillos. Añadir antígenos a la placa de fuente en grupos que reflejan la configuración del cabezal de impresión (por ejemplo, organizar antígenos en grupos de 9 cuando se utilizan para la impresión de 9 pines).
- ....
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Resultados
Los antígenos están dispuestos en una placa de 384 pocillos y se imprimen en portaobjetos por un microarrayer robótico, como se muestra en la Figura 1. La figura 2 muestra las diapositivas colocados en un marco con cámaras de incubación y una diapositiva explorada después del procesamiento. La figura 3 muestra portaobjetos de control positivo y negativo. La corredera negativo solamente se sondea con anticuerpos secundarios, y el control .......
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Discusión
El protocolo descrito aquí permite la cuantificación de autoanticuerpos utilizando la técnica de microarray antígeno. microarrays de antígeno ofrecen varias ventajas sobre ELISA convencional en la detección de autoanticuerpos. En primer lugar, una variedad de antígenos, incluyendo ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, y los lisados celulares se puede vestida sobre los portaobjetos de nitrocelulosa recubierto, lo que permite la detección de autoanticuerpos multiplexada. Además, sólo microgramos de antígeno son necesar.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
C.A. fue apoyada por una beca postdoctoral de la Fundación del Corazón y el Accidente Cerebrovascular de Canadá y el Programa de Capacitación en Medicina Regenerativa (Institutos Canadienses de Investigación en Salud). F.Y.Y.H. fue apoyada por el Programa de Capacitación en Medicina Regenerativa. Este trabajo fue financiado por una subvención de Astellas Pharma Canadá. También nos gustaría agradecer al Dr. Mark Menenghini (Universidad de Toronto) por el uso de su escáner de microarrays Axon.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ribosomal P0 | Diarect | 14100 | diluido a 0,2 mg/ml en PBS |
| IgG humana | Jackson Immuno | 009-000-003 | diluido a 0,2 mg/ml en PBS |
| humano IgM | Immuno | 009-000-012 | diluido a 0,2 mg/ml en PBS |
| ratón IgG | Sigma-Aldrich | I5381 | diluido a 0,2 mg/ml en PBS |
| ratón IgM | Biolegend | 401601 | diluir a 0,2 mg/ml en PBS |
| ADN bicatenario | Sigma-Aldrich | D1626 | diluir a 0,2 mg/ml en PBS |
| ADN monocatenario | Sigma-Aldrich | D8899 | diluido a 0,2 mg/ml en PBS |
| microarrayer | Virtek | VersArray Chipwriter Pro | Muchos tipos de arrayers son adecuados |
| pines de impresión sólidos | Arrayit Corporation | SSP015 | |
| software para microarrayer robótico | Virtek | Chipwriter Pro | |
| Portaobjetos FAST (2 almohadillas) | GVS Northa America | 10485317 | |
| marco FAST | GVS Northa America | ||
| FAST (2 almohadillas) | GVS Northa America | 10486242 | |
| placas de 384 pocillos Selladoras de | Whatman | 7701-5101 | |
| 60941-062 | |||
| VWR | 60941-124 | ||
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Suero fetal para terneros | Invitrogen 12483020 | ||
| Cy3 cabra anti-humano IgG | Jackson Immuno | 109-165-096 | uso de material de trabajo en 50% glyercol |
| Cy5 cabra anti-humano IgM | Jackson Immuno | 109-175-129 | uso de material de trabajo en 50% glyercol |
| Cy3 cabra anti-ratón IgG | Jackson Immuno | 115-165-071 | uso de material de trabajo en 50% glyercol |
| Cy5 cabra anti-ratón IgM | Jackson Immuno | 115-175-075 | uso de material de trabajo en 50% glyercol |
| Escáner de microarrays | Molecular Devices | Axon 4200A | |
| Software de microarrays | Molecular Devices | Genepix 6.1 | |
| Software de agrupación | eisenlab.org | Cluster 3.0 | |
| Software de mapas de calor | eisenlab.org | Treeview 1.60 | |
| Software estadístico de microarrays | Universidad de Stanford | SAM 4.0 (Análisis de significación de microarrays) |
Referencias
- Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
- Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention....
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Reimpresiones y permisos
