Artículo de método

Antibody Labeling con tintes fluorescentes utilizando proteína magnética A y Proteína G cuentas

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DOI:

10.3791/54545

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15 de septiembre de 2016

 ,  , 
1Promega Corporation

En este artículo

Resumen

El método en el talón para el marcaje de anticuerpos con moléculas pequeñas permite el etiquetado de una pequeña cantidad de anticuerpos directamente desde el soporte celular. Este método es compatible con la amina y la química de tiol, y puede manejar múltiples muestras en paralelo, de forma manual o utilizando plataformas automatizadas.

Resumen

Anticuerpos marcados con pequeñas moléculas como colorantes fluorescentes, fármacos citotóxicos, y trazadores radiactivos son herramientas esenciales en la investigación biomédica, inmunodiagnóstico y más recientemente como agentes terapéuticos. Los métodos tradicionales para marcar anticuerpos con moléculas pequeñas requieren anticuerpos purificados a una concentración relativamente alta, implican múltiples etapas de diálisis y han limitado el rendimiento. Sin embargo, varias aplicaciones, incluyendo el campo de Drogas de anticuerpos conjugados (ADC), se beneficiarán de nuevos métodos que permitan el etiquetado de anticuerpos directamente desde el soporte de células. Tales métodos pueden permitir que los anticuerpos que se proyectarán en ensayos biológicamente relevantes, por ejemplo, el ensayo de internalización de anticuerpos mediada por el receptor en el caso de ADCs. A continuación, describimos un (método on-perla) método que permite el etiquetado de pequeñas cantidades de anticuerpos directamente desde el soporte celular. Este enfoque utiliza la alta capacidad de la proteína magnética A y la proteína G perlas de afinidad para capturar anticuerposde los medios de células seguido de marcaje con moléculas pequeñas usando ya sea química de amina o tiol y la posterior elución de los anticuerpos marcados. Tomando tintes fluorescentes como sustitutos de moléculas pequeñas, se demuestra el etiquetado en el cordón de tres diferentes anticuerpos de ratón directamente desde el soporte de células utilizando tanto la química amina y tiol etiquetado. La alta afinidad de unión de anticuerpos a la proteína A y la proteína G asegura recuperaciones altas así como una alta pureza de los anticuerpos marcados. Además, el uso de perlas magnéticas permite múltiples muestras para ser manejados manualmente, con lo que mejora significativamente el rendimiento de etiquetado.

Introducción

Anticuerpos marcados con moléculas pequeñas son, quizás, los reactivos usados ​​más comúnmente en biología 1,2. Los anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes y biotina se utilizan ampliamente en formación de imágenes, inmunoensayos, citometría de flujo, transferencias de Western, inmunoprecipitación y entre otras aplicaciones 3-6. Los anticuerpos radiomarcados 3,7 encuentran un amplio uso en formación de imágenes y terapia, anticuerpos marcados con fármacos citotóxicos (ADCs) están ofreciendo nuevas opciones para el tratamiento de cánceres, y dos ADC ya han sido aprobados para su uso terapéutico 8. A pesar de su amplio uso, los métodos para marcar anticuerpos se han mantenido sorprendentemente sin cambios y por lo general involucran a múltiples reacciones y desalado pasos 9-12. métodos de solución funcionan muy bien en los casos en que sólo unos pocos anticuerpos deben ser etiquetados y están disponibles en forma altamente purificada en una concentración elevada y en volúmenes suficientes. Sin embargo, para nuevas aplicaciones como ADCs, hay unatenga que marcar anticuerpos en la fase temprana de hibridoma para que puedan ser evaluados para propiedades biológicamente relevantes, por ejemplo, la internalización de anticuerpos mediada por receptores 13-16. En la etapa de hibridoma, los volúmenes de muestra son limitados, los anticuerpos se expresan en concentraciones bajas y un número de muestras son grandes, por lo tanto, métodos de etiquetado a base de soluciones no son adecuados.

Para simplificar y mejorar el rendimiento de los métodos tradicionales de etiquetado de anticuerpos, algunos enfoques alternativos se han propuesto 17,18. Un enfoque consiste en utilizar las proteínas no magnético A perlas de afinidad envasados ​​en pequeñas columnas para capturar anticuerpos seguido de la reacción de marcaje y la elución de la proteína marcada y purificada. Este método se puede utilizar para marcar anticuerpos directamente desde el soporte de células, sin embargo, el uso de columnas puede ser laborioso. Un método basado perla magnética Recientemente se ha informado 19 que elimina el uso de columnas y mejora el rendimiento pero debidoa la capacidad de las perlas de la unión del anticuerpo limitado, solamente nanogramo a cantidades de microgramos bajos de los anticuerpos podría ser etiquetado.

Recientemente hemos desarrollado y utilizado de alta capacidad magnética Proteína A y Proteína G cuentas (> 20 mg de IgG humana / ml de perlas sedentarios) para etiquetar los anticuerpos presentes en los medios de comunicación celular con moléculas pequeñas 20. La alta capacidad de las perlas permite decenas a cientos de microgramos de anticuerpo a ser etiquetados convenientemente y la respuesta magnética rápida de las perlas simplifica el manejo y procesamiento de un gran número de muestras en paralelo. El uso de colorantes fluorescentes como sustitutos de moléculas pequeñas, se muestra que el método es compatible con amina y tiol química etiquetado y ofrece altas recuperaciones de anticuerpos marcados y muy puros.

Este protocolo y el video que lo acompaña describen etiquetado en cordón de anticuerpos de ratón presentes en los medios de células utilizando cuentas de Proteína G magnética A y proteína. El protocolo esdividida en cuatro secciones: Sección 1 describe la captura de anticuerpos en la perla a partir de muestras biológicas. Después de la captura, el etiquetado de los anticuerpos con colorante fluorescente usando química de amina o tiol usando química se describe en las secciones 2 y la sección 3, respectivamente. Finalmente, la sección 4 se describe el método para el cálculo de la concentración de anticuerpos y el colorante a la proporción de anticuerpos.

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Protocolo

1. anticuerpo de captura sobre perlas de proteína de alta capacidad magnética A o proteína G Magnética

  1. Uniformemente vuelva a suspender las perlas magnéticas de agitación suave. Mantener la suspensión uniforme cuando alícuotas de perlas.
  2. Añadir 50 l de suspensión de perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Colocar en el soporte magnético durante 10 s. Con cuidado eliminar el tampón de almacenamiento.
  3. Añadir 250 l de tampón de unión del anticuerpo.
  4. Mezclar y colocar en el soporte magnético durante 10 s. Con cuidado, retire el tampón de unión.
  5. Añadir 1,0 ml de la muestra que contiene 50 a 100 mg de anticuerpo a las perlas. Las muestras se pueden purificar anticuerpos o anticuerpos en los medios de comunicación celular.
  6. Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo.
  7. Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el sobrenadante.
  8. Añadir 250 l de tampón de unión / lavado de anticuerpo y mezclar. Colocar en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar tampón de unión / lavado. Repita este sTEP para un total de dos lavados.
  9. Proceda a la Sección 2 de anticuerpos marcadores utilizando la química de amina o la Sección 3 para anticuerpos marcadores utilizando la química de tiol.

2. El anticuerpo etiquetado Uso de Química Amina

  1. Anticuerpo conjugado
    1. Añadir 100 ml de tampón de conjugación de amina a las perlas.
    2. Disolver los colorantes fluorescentes de amina reactiva (AlexaFluor 532-SE) en 10 mg / ml mediante la adición de 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 1,0 mg de tinte. Mezclar mediante agitación. Hacer esta solución justo antes de su uso.
    3. Añadir 2,5 l de colorante reactivo con aminas de 100 mg de anticuerpo.
      Nota: Por lo general se recomienda un exceso molar de 5-20 colorante reactivo. Sin embargo, la cantidad de colorante reactivo añadido a necesita ser optimizado empíricamente dependiendo de tinte deseado a la proporción de anticuerpo y las propiedades de anticuerpos intrínsecos la reacción.
    4. Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensionorte.
    5. Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el sobrenadante.
    6. Añadir 250 l de tampón de unión / lavado de anticuerpo y mezclar. Colocar en el soporte magnético durante 10 s. Retire y deseche tampón de unión / lavado. Repita este paso para un total de dos lavados.
  2. recuperación de anticuerpos
    1. Añadir 50 l de tampón de elución a las perlas.
    2. Mezclar durante 5 minutos a temperatura ambiente usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión.
    3. Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar la muestra y la transferencia se eluyó a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 5 l de tampón de neutralización.
    4. Repetir el proceso una vez más y aunar las muestras eluidas.
    5. Cuantificar la concentración de anticuerpos y teñir-a-anticuerpo relación como se describe en la Sección 4.

3. El anticuerpo etiquetado Usando tiol Química

  1. Reducción de anticuerpos
    1. Añadir 250 lde tampón de conjugación de tiol y mezcla. Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar y desechar el tampón. Repita este paso dos veces.
    2. Añadir 100 ml de tampón de conjugación de tiol.
    3. Añadir ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 2,5 mM.
    4. Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión.
    5. Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y desechar el tampón.
    6. Añadir 250 l de tampón de conjugación de tiol y mezclar. Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar y desechar el tampón. Repita este paso para un total de dos lavados.
    7. Añadir 100 ml de tampón de conjugación de tiol.
  2. Anticuerpo conjugado
    1. Se disuelve el colorante reactivo con tiol en 10 mg / ml mediante la adición de 100 l de DMSO a 1,0 mg de tinte. Mezclar mediante agitación. Hacer esta solución justo antes de su uso.
    2. Añadir 2,5 l de colorante reactivo con tiol de 100 mg de anticuerpos anticuerpo.
      Nota: Por lo general se recomienda un exceso molar de 5-20 colorante reactivo. Sin embargo, la cantidad de colorante reactivo añadido a necesita ser optimizado empíricamente dependiendo de tinte deseado a la proporción de anticuerpo y las propiedades de anticuerpos intrínsecos la reacción.
    3. Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión.
    4. Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el sobrenadante.
    5. Añadir 250 l de tampón de conjugación de tiol y mezclar. Colocar en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el tampón. Repita este paso para un total de dos lavados.
  3. Eluir Anticuerpo
    1. Añadir 50 l de tampón de elución a las perlas.
    2. Mezclar durante 5 minutos a temperatura ambiente usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión.
    3. Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar la muestra y la transferencia se eluyó a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 5 l de neutralization tampón.
    4. Repetir el proceso una vez más y aunar las muestras eluidas.
    5. Cuantificar la concentración de anticuerpos y teñir-a-anticuerpo relación como se describe en la Sección 4.

Relación 4. Calcular la Teñir-a-Anticuerpo

  1. Medir la absorbancia del conjugado anticuerpo-colorante a 280 nm (A280) y en la λmax para el tinte (Amax).
  2. Calcular la concentración de anticuerpo:
    Anticuerpo Concentración (mg / ml) = A280 - (A max × CF) / 1,4
    donde CF = factor de corrección del colorante (proporcionado por el fabricante).
  3. Se calcula la relación de colorantes-anticuerpo a:
    Teñir-a-Antibody Ratio (DAR) = (A max × 150.000) / Ab Concentración (mg / ml) x ε colorante
    donde, tinte ε = el coeficiente de extinción del colorante en su absorbancia máxima y el peso molecular del anticuerpo = 150000 Da.

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Resultados

Un esquema para el marcaje de anticuerpos con moléculas pequeñas usando G bolas de alta capacidad de la proteína magnética A y proteína se muestra en la Figura 1. Los anticuerpos capturados en la proteína magnético G cuentas se pueden marcar con moléculas pequeñas, por ejemplo, colorantes fluorescentes, utilizando la química de amina que las etiquetas aminas primarias de los ácidos amino de la lisina o usando química de tiol que las etiquetas en los tioles reducidos en l...

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Discusión

El objetivo de este estudio fue desarrollar un método para marcar anticuerpos, presentes en el medio celular a bajas concentraciones, con una variedad de moléculas pequeñas. Tal método permitirá a un gran número de anticuerpos, durante las primeras etapas de descubrimiento de anticuerpos, para ser etiquetados con moléculas pequeñas y se tamiza usando un ensayo biológicamente relevante. Uno de tales ensayos es el ensayo de internalización de anticuerpos mediada por el receptor, donde la internalización puede variar entre...

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Divulgaciones

Los autores son empleados de Promega Corporation.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Magne Protein A BeadsPromega Corporation  G8781
Magne Protein G PerlasPromega Corporation    G7471
AlexaFluor 532-SE (Éster de succinimidilo)Life TechnologiesA20001
AlexaFluor 532-ME (Malemida)Life TechnologiesA10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimida)Life TechnologiesA20347
Fluoresceína-ME (Maleimida)Life TechnologiesF-150
Soporte magnéticoPromegaZ5332

Referencias

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