Artículo de método

La detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de fuego

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DOI:

10.3791/54546

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17 de septiembre de 2016

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1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo para la detección colorimétrica de E. coli utilizando una prueba de fuego modificada que aprovecha una DNAzima que escinde el ARN, ureasa y perlas magnéticas.

Resumen

Cada vez hay más demanda de métodos sencillos pero eficaces que puedan utilizarse para detectar patógenos específicos en aplicaciones de punto de atención o de campo. Estos métodos deben ser fáciles de usar y producir resultados fiables que puedan ser fácilmente interpretados tanto por especialistas como por no profesionales. La prueba de tornasol para el pH es simple, rápida y efectiva, ya que informa el pH de una muestra de prueba a través de un simple cambio de color. Hemos desarrollado un enfoque para aprovechar la prueba de fuego para la detección de bacterias. El método explota una DNA escindidora de ARN específica de una bacteria para lograr dos funciones: reconocer una bacteria de interés y proporcionar un mecanismo para controlar la actividad de la ureasa. Mediante el uso de perlas magnéticas inmovilizadas con un conjugado DNAzima-ureasa, la presencia de bacterias en una muestra de prueba se transmite a la liberación de ureasa de las perlas a la solución. La ureasa liberada se transfiere a una solución de prueba para hidrolizar la urea en amoníaco, lo que resulta en un aumento del pH que se puede visualizar mediante la clásica prueba de tornasol.

Introducción

Los patógenos bacterianos son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad mundial. Los brotes de infecciones adquiridas en el hospital, patógenos transmitidos por los alimentos y contaminantes bacterianos en el medio ambiente plantean amenazas graves y continuas para la salud y la seguridad públicas. Para prevenir estos brotes, se necesitan herramientas eficaces que permitan la detección de patógenos de manera oportuna en una variedad de entornos. Las pruebas sencillas pero eficaces, que son portátiles y rentables, son muy codiciadas, especialmente en las regiones que son susceptibles a los brotes pero que no pueden permitirse costosas instalaciones de pruebas. 1-3 Aunque existe una multitud de métodos para detectar bacterias, muchos de ellos no son adecuados como herramientas de detección o pruebas in situ porque requieren largos tiempos de prueba, instrumentos costosos y procedimientos de prueba complicados.

Las pruebas colorimétricas son particularmente atractivas para aplicaciones en el punto de atención o en el campo, ya que los cambios de color se pueden detectar fácilmente a simple vista. La prueba de fuego para el pH es simple, rápida y efectiva. Aunque es una tecnología muy antigua, sigue siendo muy utilizada hoy en día debido a su simplicidad y efectividad. Sorprendentemente, esta simple prueba nunca se había modificado para lograr la detección de otros analitos antes de que recientemente desarrolláramos un enfoque de modificación de esta prueba para las pruebas de E. coli. 4

La prueba de tornasol ampliada para E. coli emplea tres componentes adicionales: una DNAzima de escisión de ARN activada por E. coli (EC1), 5 ureasa y perlas magnéticas. Las DNAzimas se refieren a moléculas sintéticas de ADN monocatenario con actividad catalítica. 6 Se pueden aislar de grupos de ADN de secuencia aleatoria mediante selección in vitro. 7,8 Son muy estables y pueden producirse de forma rentable mediante la síntesis de ADN automatizada de alta eficiencia. 9 Por estas razones, las DNAzimas, en particular las DNAzimas que escindien el ARN, han sido ampliamente examinadas para aplicaciones de biodetección. Se han desarrollado 6,10,11 sensores de ADN que escindien el ARNzyme para detectar iones metálicos,12-16 moléculas pequeñas,17,18 patógenos bacterianos5,19-21 y células cancerosas. 22 Dada la gran disponibilidad de ADNzimas de escisión de ARN inducidas por el objetivo, cualquier ensayo que utilice una DNAzima puede ampliarse potencialmente para detectar una amplia gama de analitos.

La ureasa se elige por su capacidad para hidrolizar la urea en amoníaco,23,24 lo que resulta en un aumento del pH. La ureasa también es altamente eficiente, estable y susceptible de conjugación con otras biomoléculas. Por lo tanto, postulamos que un conjugado de una DNAzima de escisión de ARN con ureasa permitiría el uso de la prueba de fuego para la detección de otros objetivos. 5

La acción de la DNAzima que escinde el ARN se transmite al aumento del pH mediado por la ureasa mediante el uso de perlas magnéticas que se inmovilizan con el conjugado DNAzyme-ureasa. Debido a que la actividad de la DNAzima bajo investigación depende estrictamente de E. coli, la presencia de esta bacteria en la solución de prueba dará lugar a la liberación de ureasa de las perlas magnéticas a la solución, que luego se toma y se utiliza para hidrolizar urea en una solución reportera que contiene un colorante sensible al pH. El resultado final de este procedimiento es un cambio de color que puede ser reportado convenientemente por el tinte o el papel de pH.

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Protocolo

1. Preparación de los reactivos y búferes

  1. M de ácido 0,5 etilendiaminotetraacético (EDTA)
    1. En un vaso de precipitados de 2 L, agregar 186,1 g EDTA a 800 ml de agua destilada-desionizada (ddH 2 O). Ajustar el pH de la solución a 8,0 usando gránulos de NaOH. Añadir ddH2O a un volumen final de 1,0 L y transferir la solución a una botella de vidrio en autoclave para la esterilización en autoclave y se almacena a 4 ° C.
  2. EDTA 10 × Tris-borato (10x TBE)
    1. En un vaso de precipitados de plástico 4 L, añadir 432 g de Tris-base, 200 g de ácido bórico, 80 ml ​​de 0,5 M EDTA (pH 8,0) y ddH 2 O hasta un volumen final de 4 L. Mix usando una barra de agitación hasta que todos los componentes se disuelven. Transferir la solución a botellas de vidrio de 1 L de autoclave y se almacena a 4 ° C.
  3. 10% de poliacrilamida desnaturalizante Stock
    1. En un vaso de precipitados de plástico 4 L, añadir 1.681,7 g de urea, 400 ml de 10x TBE, 1 L de 40% de acrilamida / bisacrilamida (29: 1) solución y ddH 2 O hasta que la final volumen es de 4 L. Mezclar con una barra de agitación hasta que se disuelve la urea. Transferir la solución a botellas de vidrio ámbar de 1 L y se almacena a 4 ° C.
  4. 2x tampón de carga de gel (2x GLB)
    1. En un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml, añadir 44 g de urea, 8 g de sacarosa, 10 mg de azul de bromofenol, 10 mg de xileno cianol FF, 400 l de 10% de dodecil sulfato de sodio, y 4 ml de 10 x TBE. Añadir ddH 2 O hasta un volumen final de 40 ml y disolver los componentes con calentamiento suave a 50 ° C mientras se mezcla con una barra de agitación magnética. Transferir 1 ml de alícuota de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a 4 ° C.
      NOTA: El uso anterior requiere breve calentamiento a 90 ° C para volver a disolver cualquier sólido.
  5. 1 M Tris-hidrocloruro (Tris-HCl) (pH 7,5)
    1. En una botella de vidrio, añadir 12,1 g de Tris-base y 70 ml de ddH2O y mezclar hasta que se disuelva el sólido. Ajustar el pH a 7,5 utilizando ácido clorhídrico 1 M (HCl). Añadir ddH 2 O hasta un volumen final de 100 ml, autoclave y store a 4 ° C
  6. 5 M de cloruro de sodio (NaCl)
    1. En una botella de vidrio, se disuelven 58,4 g de NaCl en 150 ml de ddH2O Ajuste el volumen a 200 ml con ddH 2 O. Almacenar a 4 ° C.
  7. DNA tampón de elución
    1. En una botella de vidrio, mezclar 2,0 ml de 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,0 ml de 5 M de NaCl y 0,4 ml de 0,5 M EDTA (pH 8,0). Ajuste el volumen a 200 ml con ddH2O, autoclave y se almacena a 4 ° C.
  8. 1 M 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (pH 7,4)
    1. En una botella de vidrio, se disuelven 2,38 g de HEPES en 80 ml ​​de ddH2O Ajustar el pH a 7,4 usando NaOH 5 N y añadir ddH 2 O hasta un volumen final de 100 ml.
  9. 1 M de cloruro de magnesio (MgCl 2)
    1. En una botella de vidrio, añadir 2,03 g de MgCl 2 6H 2 O y llevar el volumen a 100 ml con ddH 2 O.
  10. El tampón de reacción (RB)
    1. En un tubo cónico de 50 ml, añadir 50 l de 1 M HEPES (pH 7,4), 1,5 ml de 5 M NaCl, 0,75 ml de 1 M MgCl 2 y 5 l de Tween-20. Añadir ddH 2 O a un volumen final de 50 ml. Mezclar la solución y filtrar en otro tubo cónico utilizando un filtro de jeringa impulsada (0,22 m) y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
  11. Tampón de unión (BB)
    1. En un tubo cónico de 50 ml, añadir 500 l de 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,8 g de NaCl, 50 l de 1 M de MgCl 2 y 5 l de Tween 20. Añadir ddH 2 O hasta un volumen final de 50 ml. Mezclar la solución y filtrar en otro tubo cónico utilizando un filtro de jeringa impulsada (0,22 m) y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
  12. Solución de sustrato (SS)
    1. En un tubo cónico de 50 ml, añadir 5,8 g de NaCl, 3 ml de 1 M MgCl 2, 1,5 g de urea, y 40 ml de ddH 2 O. Ajustar el pH de la solución a 5,0 usando HCl 10 mM. Debido a que la solución no es amortiguada, ajustar el pH utilizando HClcuidado a través de la adición de pequeñas alícuotas de HCl. Añadir ddH 2 O a un volumen final de 50 ml.
    2. Mezclar la solución y filtrar en otro tubo cónico utilizando un filtro de jeringa impulsada (0,22 m) y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
  13. Luria Bertani (LB) Broth
    1. En un vaso de precipitados, se disuelven 20,0 g de polvo LB en 1 l de ddH 2 O. Transferencia a una botella de vidrio, autoclave, y se almacena a 4 ° C.
  14. 1,5% de agar LB
    1. En un matraz de 250 ml, añadir 1,5 g de agar y 100 ml de caldo LB. Autoclave y se almacena a 4 ° C.
  15. Las placas de agar
    1. Se vuelve a disolver el agar LB en un horno de microondas y enfriar la solución a ~ 50 ° C. Verter la solución en placas de Petri, haciendo ~ 5 placas y dejar que se solidifique.

2. Síntesis y purificación de E. colitis sensibles ADNzima EC1

  1. Síntesis de CE1 por la plantilla mediada por ligación enzimática
    1. purificar commoligonucleótidos sintetizados ercially BS1, DE1, y T1 (secuencias proporcionadas en la Tabla 1) por 10% de desnaturalización de electroforesis en gel de poliacrilamida (dPAGE) de acuerdo con protocolos estándar.
    2. Preparar una solución madre 100 mM de BS1, DE1, y T1. Almacenar a -20 ° C hasta su uso.
    3. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 38,5 l de ddH 2 O, 5 l de DE1, y 5 l de tampón de reacción de polinucleótido quinasa 10x T4 proporcionados por el proveedor de enzima (500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl 2, ditiotreitol 50 mM (DTT), espermidina 1,0 mM).
    4. Añadir 1 l de trifosfato de adenosina (ATP) (100 mM). Añadir 5 unidades de polinucleótido quinasa de T4 (10 U / l). Mezclar pipeteando cuidadosamente la mezcla de reacción.
    5. Incubar la reacción a 37 ° C durante 30 min.
    6. Se detiene la reacción por calentamiento a 90 ° C durante 5 min.
    7. Añadir 118 l de ddH2O, 5 l de BS1, y 5 l de T1. La reacción se calienta a 90 ° C durante 2 millasn y después se enfría a temperatura ambiente durante 10 min.
    8. Añadir 20 l de 10 × T4 ADN ligasa tampón de reacción proporcionado por el proveedor de la enzima (400 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl 2 mM, DTT 100 mM, ATP 5). Añadir 10 unidades de ADN ligasa de T4 (5 U / l) y mezclar cuidadosamente mediante pipeteo.
    9. Incubar a temperatura ambiente durante 2 hr.
    10. Añadir 20 l de acetato de sodio 3 M (NaOAc) (pH 5,2), 500 l de etanol frío al 100%. Mezclar la solución mediante agitación y se coloca el tubo en un congelador C -20 ° durante 30 min.
    11. Centrifugar la microcentrífuga a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante con la pipeta.
    12. Lavar el precipitado con etanol frío al 70% y se centrifuga de nuevo a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Una vez más, eliminar el sobrenadante y secar el pellet al vacío durante 10 min.
    13. Resuspender el ADN con 15 l de ddH2O y luego añadir 15 l de 2x GLB.
    14. Vortex vigorosamente y se calienta a 90 ° C durante2 minutos. Se purifica el ADN de longitud completa en un 10% dPAGE como se describe a continuación.
  2. Configuración de un 10% dPAGE
    1. Limpiar las placas de vidrio de dos (un plato completo y uno con muescas), dos de 0,75 mm de espesor, separadores y un peine de 12 pocillos. Coloque una placa de vidrio sobre una superficie plana con dos espaciadores en cada lado y la placa dentada en la parte superior. Cortar las dos placas juntas utilizando los cuatro clips proporcionados por el proveedor.
    2. En un vaso de precipitados de plástico de 150 ml, verter 40 ml de 10% dPAGE, 40 l de tetrametiletilendiamina (TEMED) y 400 l de persulfato de amonio al 10% (APS). Mezclar los componentes y se vierte la solución lentamente entre las placas.
    3. Inserte el peine y luego permitir que el gel se polimeriza durante 10 minutos. Una vez que se polimeriza el gel, retire lentamente el peine y lavar los pocillos con ddH2O
    4. Montar las placas en el aparato de electroforesis en gel. Utilice una placa de metal para disipar el calor generado para evitar el sobrecalentamiento.
    5. Verter TBE 1x a las cámaras superior e inferiory asegurar que los pocillos son bien sumergidos en el tampón. Lavar los pocillos con TBE 1x utilizando una pipeta o una jeringa.
    6. Ajuste el aparato para funcionar a 35 mA y pre-una duración de 15 minutos antes de cargar las muestras.
  3. La elución de ligado EC1 de 10% dPAGE
    1. Después de la etapa 2.2.6, ejecute el gel a 35 mA hasta que el colorante de fondo (azul de bromofenol) alcanza la parte inferior de la placa de vidrio. Esto debe tomar aproximadamente 1,5 horas. Desconecte la alimentación y retire las placas del aparato.
    2. Colocar las placas en unas cuantas hojas de papel toalla y retirar con cuidado los separadores de las placas de vidrio. Retirar con cuidado la placa de vidrio superior y envolver el gel con una envoltura de plástico.
    3. Da la vuelta al gel sobre quitar la segunda placa de vidrio y cubrir con plástico nuevo. Tenga cuidado para evitar las arrugas de la envoltura de plástico.
    4. Visualizar el producto ligado mediante el uso de UV sombreado (260 nm), que producirá 4 bandas de ADN distintos (EC1 totalmente ligado, DE1, BS1, y T1).
    5. Impuestos Especiales de la banda superior (EC1) con una hoja de afeitar estéril y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aplastar el gel con una punta de pipeta estéril (tamaño de la punta 200 l) hasta que se convierte en una pasta fina. Añadir 550 l de tampón de elución de ADN, cubrir el tubo con papel de aluminio para proteger el fluoróforo incrustado, y agitar durante 15 min.
    6. Centrifugar la solución de gel a 20.000 xg durante 5 min y transferir cuidadosamente 400 l del sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Evitar la retirada de piezas de gel durante el pipeteado.
    7. Para el tubo de microcentrífuga con el sobrenadante se transfirió añadir 40 l de 3 M NaOAc (pH 5,2), y 1,0 ml de etanol frío al 100%. Mezclar la solución mediante agitación y se coloca el tubo en un congelador C -20 ° durante 30 min.
    8. Centrifugar la microcentrífuga a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante con la pipeta.
    9. Lavar el precipitado con etanol frío al 70% y se centrifuga de nuevo a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Una vez más, retire elsobrenadante y secar el pellet al vacío durante 10 min.
    10. Determinar la concentración de EC1 midiendo la absorbancia UV a 260 nm. Hacer a 10 mM de valores y almacenar la muestra a -20 ° C hasta su uso.

3. Conjugación de ureasa para DNA

  1. Preparación de succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de etilo (SMCC) Stock
    1. Disolver 1 mg de SMCC en 676 l de DMSO. Vortex y el lugar en hielo hasta su uso.
  2. Preparación de la ureasa de la
    1. Disolver 1 mg de ureasa en 1 ml de 1 × PBS (sin Mg2 + o Ca2 +). Colocar en hielo hasta su uso.
      NOTA: Se cristalizó ureasa es lento para disolver y se necesita un mezclado suave para evitar la desnaturalización.
  3. Síntesis de la ureasa-DNA (UrDNA)
    1. Añadir 10 l de 100 mM LD1 a un tubo de microcentrífuga de 2,5 ml. Añadir 140 l de ddH2O, 40 l de 10x PBS, y remolino.
    2. Añadir 80,5 l de SMCC stac, 159,5 l de DMSO, vortex y centrifugar brevemente utilizando una centrífuga de mesa.
    3. Incubar a 37 ° C durante 60 min. Evitar la condensación debajo de la tapa de microcentrífuga.
    4. Añadir 200 l de 1x PBS, 60 l de 3 M NaOAc (pH 5,2), y 1,5 ml de etanol frío al 100%. Mezclar la solución por agitación e incubar a -20 ° C durante 30 min.
    5. Centrifugar la solución a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y secar el precipitado al vacío. Evitar el exceso de secado.
    6. Para el sedimento se secó añadir 400 l de ureasa de stock y se incuba a temperatura ambiente durante 5 hr.
    7. Transferir 200 l de conjugado en bruto a una columna de filtro centrífugo 100k MWCO previamente lavado. Centrifugar la columna a 14.000 xg durante 5 min.
    8. Transferir los 200 l restantes de conjugado crudo a la columna y se centrifuga a 14.000 xg durante 5 min. Retire la columna y colocarlo boca abajo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 2,0 ml ( "tubo de extracción").
    9. CentrifUGE el tubo de recogida (con la columna invertida) a 1.000 xg durante 2 min. Retire el tubo de recogida y añadir 30 l de PBS 1x a la columna centrífuga para lavar la membrana para la recuperación adicional de los conjugados.
    10. Una vez más invertir la columna y colocar de nuevo en el tubo de recogida. Centrifugar el tubo de recogida (con la columna invertida) a 1.000 xg durante 2 min. Retirar y desechar la columna.
    11. Almacenar el UrDNA a 4 ° C hasta su uso.

4. Montaje de EC1 y UrDNA sobre perlas magnéticas

  1. Mezclar la población de perlas magnéticas (MB) y así transferir 100 l de suspensión MB a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se coloca el tubo de microcentrífuga en un soporte de estante magnético para aislar el MB.
  2. Eliminar el sobrenadante por pipeteo y añadir 150 l de tampón (BB) de unión al tubo. Retire el tubo del soporte y golpee suavemente el tubo para resuspender el MB a una solución homogénea. Evitar salpicaduras de la suspensión de la top del tubo o tapa. Si esto sucede, utilice una centrífuga de mesa a girar brevemente el residuo de nuevo a la suspensión.
  3. Repita el paso 4.2 dos veces más.
  4. A esta suspensión se añaden 10 l de 10 mM EC1. Mezclar con cuidado con un toque en el tubo.
  5. Incubar la solución con agitación suave durante 30 min. Toque en el tubo de 2-3 min para evitar la precipitación de la MB.
  6. Se coloca el tubo de microcentrífuga de nuevo en el estante magnético para aislar el MB y eliminar el sobrenadante con la pipeta. Lavar el MB tres veces con 150 ml de BB (como se describe en el paso 4.2).
  7. Una vez que el lavado sea totalmente efectivo, suspender la MB en un total de 150 l de BB. A esta solución, añadir 15 l de UrDNA y se calienta la solución a 45 ° C durante 2 min. Enfriar la solución a temperatura ambiente y se incuba durante 2 hr.
  8. Se coloca el tubo de microcentrífuga de nuevo en el estante magnético para aislar el MB y eliminar el sobrenadante con la pipeta.
  9. Añadir 100 l de tampón de reacción (RB). Retire tque microfuga tubo del bastidor magnético y resuspender cuidadosamente el MB.
  10. Lavar los tres MB más veces repitiendo el paso 4.9.
    NOTA: El sobrenadante se lavó rápidamente puede ser probado para determinar si sin hibridar UrDNA aún está presente, lo que puede dar lugar a una falsa señal positiva. La prueba se puede realizar mediante la adición de 10 l de urea 50 mM y 10 l de 0,04% de rojo de fenol a la solución de lavado. Continuar para lavar el MB hasta que la solución de lavado no causa un cambio de color. La suspensión 100 l se almacena a 4 ° C hasta su uso.

5. Preparación de células bacterianas 20

  1. El cultivo E. coli y Cotizaciones
    1. Placa E. coli K12 (MG1655) en placas de agar LB a partir de un stock de glicerol en virtud de una llama o en una cabina de seguridad biológica.
    2. Con una punta de pipeta estéril, toque suavemente la población de glicerol y la ligera racha de la superficie de una placa de agar para evitar perforar el agar LB.
    3. Invertir el veteadola placa e incubar a 37 ° C durante 14 horas.
    4. Sellar la placa con Parafilm y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas.
  2. El cultivo E. coli para Recuento celular
    1. En un tubo de cultivo de 14 ml estéril, prescindir de 2 ml de caldo LB.
    2. Con una punta de pipeta estéril, se toma una única colonia de la placa de agar con rayas preparado en la etapa 5.1 y transferirla al tubo de cultivo.
    3. Incubar el cultivo a 37 ° C y agitar a 230 rpm durante 14 horas.
    4. En serie diluir el cultivo bacteriano en intervalos de 10 veces.
    5. Para cada muestra diluida, de manera uniforme la placa cinco 100 ml de alícuotas sobre placas de agar LB separadas. Invertir las placas e incubar a 37 ° C durante 14 horas.
    6. Contar las células de cada muestra para obtener la concentración celular media de cada dilución.
      NOTA: 10 7 células a menudo se utilizan para configurar una prueba de fuego de referencia para E. coli ya que este nivel de E. coli puede desencadenar un color rápida Change. Sin embargo, una prueba de fuego debidamente ejecutada puede detectar tan bajo como 500 células, como se discutió en la sección Resultados.
  3. Preparación E. Las células de E. coli para la prueba
    1. Para una suspensión celular deseada, la transferencia de 1 ml de Stock cultivaron a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Centrifugar las células a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular.
    3. Añadir 10 l de tampón de reacción al sedimento celular y resuspender las células. Sonicar la suspensión celular durante 5 min. Transferir la suspensión celular a una caja de hielo durante 5 min.
    4. Sonicar la suspensión de células durante otros 5 min.
    5. Centrifugar la suspensión celular a 13.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Utilice el sobrenadante para el ensayo (10 l).

6. prueba de fuego

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, prelavado del tubo y añadiendo vórtex 100 l de tampón de reacción (RB) en el tubo de microcentrífuga ydesechar el tampón.
  2. Transferencia de 15 l de EC1 ensamblado (protocolo 4) en el tubo de microcentrífuga de lavado.
  3. Lavar las perlas magnéticas colocando el tubo de microcentrífuga sobre una rejilla magnética. Eliminar el sobrenadante con la pipeta. Retire el tubo de microcentrífuga del bastidor, añadir 100 l de RB, y volver a suspender cuidadosamente las perlas magnéticas.
  4. Se lavan las dos MB más veces repitiendo el paso 6.3.
  5. Se coloca el tubo de microcentrífuga de nuevo en el estante magnético, eliminar el sobrenadante y añadir el 10 l E. muestra coli preparó a partir de la etapa 5.3.
  6. Mezclar las perlas magnéticas de muestra y cuidadosamente golpeando suavemente en el tubo de microcentrífuga.
  7. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 1 hr.
  8. Para la reacción, añadir 90 l de ddH2O y colocar el tubo de microcentrífuga sobre una rejilla magnética.
  9. Después de aproximadamente 3 min de separación magnética, transferir cuidadosamente 85 l del sobrenadante a un tubo de 0,5 ml de microcentrífuga. Retirar el sobrenadante lentamente aevitar la recogida de cualquier perlas magnéticas.
  10. Para el tubo de microcentrífuga por encima de añadir 15 l de 0,04% de rojo de fenol, y 100 l de solución de sustrato.
  11. Tome una fotografía a intervalos de tiempo específicos para registrar el cambio de color.
    NOTA: El cambio en el pH también se puede monitorizar utilizando un medidor de pH con un microelectrodo. El pH de partida debe ser de aproximadamente 5.2 a 5.5 (la solución es de color amarillo). Si no, la solución se puede ajustar mediante la adición de 1 mM tampón de acetato pH 5,0).

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Resultados

El principio de la prueba de fuego bacteriano se explica en la Figura 1 La prueba utiliza tres materiales principales:. Una ADNzima RNA-cleaving que se activa por una bacteria específica, ureasa y perlas magnéticas. La ADNzima se utiliza como el elemento de reconocimiento molecular para lograr una detección altamente específica de una bacteria de interés. La ureasa y perlas magnéticas se utilizan para conseguir la transducción de señales de la actividad de ARN-escisión d...

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Discusión

La traducción de la acción de la actividad RNA escisión de una ADNzima bacteria sensible a una prueba de fuego se hace posible mediante el uso de la ureasa y la separación magnética, como se ilustra en la Figura 1. Aunque la demostración de la prueba de fuego modificado para la detección bacteriana es hecho con una E. coli dependiente de ARN de escisión ADNzima, 5,19,20 el diseño en general se puede ampliarse para cualquier ADNzima ARN de escisión. Dada la gran disponibilidad de DNAz...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La financiación para este proyecto de investigación fue proporcionada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) a través de una Beca de Descubrimiento para YL.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)VWR AMRESCO0105
Pellets de hidróxido de sodio (NaOH)BIO BASIC CANADA INC.SB6789
Tris-baseVWR AMRESCO0497
Ácido bóricoAMRESCO0588
UreaVWR AMRESCOM123
40% solución de acrilamida/bisacrilamida (29:1)BIO BASIC CANADA INC.A0007
SacarosaBioshop Canadá inc.SUC507
Azul de bromofenolBioshop Canada inc.BRO777
Xilenecianol FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10% dodecil sulfato de sodioBioshop Canada inc.SDS001
Ácido clorhídrico (HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
Cloruro de sodio (NaCl)Bioshop Canada inc.SOD001
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanoácido sulfónico (HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
Cloruro de magnesio (II) hexahidratadoVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
Trifosfato de adenosina (ATP)AMRESCO0220
Acetato de sodio trihidrato (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
EtanolAlcoholes comercialesP016EAAN
tetrametileetilendiamina (TEMED)AMRESCO0761
Persulfato de amonio al 10% (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
Succinimidilo 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
Dimetilsulfóxido (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreasaSIGMA-ALDRICHU0251
1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0.04% Rojo de fenolSIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 tampón de reacción de polinucleótido quinasaLucigen30061-1
10x T4 tampón de reacción de ADN ligasaBasics CanadaB1122-B
T4 ADN ligasa (5 U/μ l)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) CaldoAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 polinucleótido quinasa (10 U/μ l)Lucigen30061-1
E. coli K12 (MG1655)ATCCATCC700926
CentrífugaBeckman Coulter, Inc.
Placas de vidrioCBS scientificNGP-250NR
Espaciadores de 0,75 mm de espesorCBS scientificVGS-0725r
Peine de 12 pocillosCBS scientificVGC-7512
Lámpara UV UVP95-0017-09
Espectrofotómetro (NanoVue)GE HealthcareN/A
Placa metálicaCBS scientificCPA165-250
VortexVWR International58816-123
Aparato de electroforesis en gelCBS scientificASG-250
Placas de PetriVWR International25384-342
100 kDa Filtros centrífugos MWCOEMD MilliporeUFC510024
Magnetic Bead (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
Rack de separación magnéticaNew England BioLabsS1506S
Tubos de microfugaSarstedt72.69
Filtro de jeringa (0.22 μ m)VWR International28145-501
Tubo de cultivo de 14 mlVWR International60818-725
Incubadora de cultivo celularEppendorf ScientificM13520000
Branson Limpiador ultrasónicoBransonN/A
Cámara (Canon Powershot G11)CanonN/A
Tubo cónico de 50 mlVWR International89004-364
Bio 392187

Referencias

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