Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del patógeno.
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Artículo de método
La infección experimental con
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Resumen
Resumen
L. monocytogenes es una bacteria gram-positiva que es una causa de enfermedad transmitida por alimentos en seres humanos. La infección experimental de ratones con este patógeno ha sido altamente informativo sobre el papel de las células inmunes innatas y adaptativas y citocinas específicas en la inmunidad del huésped contra los patógenos intracelulares. La producción de IFN-γ por las células innatas durante la infección subletal con L. monocytogenes es importante para la activación de los macrófagos y el control temprano del patógeno 1-3. Además, la producción de IFN-γ por los linfocitos de memoria de adaptación es importante para la imprimación de la activación de las células innatas a la reinfección 4. La L. monocytogenes modelo de infección por lo tanto sirve como una gran herramienta para investigar si las nuevas terapias que están diseñados para aumentar la producción de IFN-γ tener un impacto en las respuestas de IFN-γ in vivo y tienen efectos biológicos productivos, tales como el aumento de la eliminación de bacterias o la mejora de la supervivencia del ratón deinfección. Se describe aquí es un protocolo básico para cómo llevar a cabo las infecciones intraperitoneales de ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y para medir la producción de IFN-γ por las células NK, células NKT, y linfocitos de adaptación por citometría de flujo. Además, los procedimientos se describen a: (1) crecer y preparar las bacterias para la inoculación, (2) medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado, y (3) la supervivencia medida de los animales a los puntos finales. También se proporcionan datos representativos para ilustrar cómo este modelo de infección se puede utilizar para probar el efecto de agentes específicos en las respuestas de IFN-gamma a L. monocytogenes y la supervivencia de los ratones de esta infección.
Introducción
IFN-γ es una citoquina que es crucial para la mediación de la inmunidad contra los patógenos intracelulares y para controlar el crecimiento del tumor 5. La importancia de esta citocina en la resistencia bacteriana es evidente en la observación de que los seres humanos con mutaciones en la vía de señalización de IFN-γ son altamente susceptibles a la infección por micobacterias y salmonelas 6. De manera similar, los ratones deficientes en IFN-γ o los defectos de exhibición receptor de IFN-γ en la resistencia a las micobacterias 7-9 y otros patógenos intracelulares, incluyendo L. monocytogenes 10,11, Leishmania ma....
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Protocolo
Notificación de seguridad
Este protocolo describe la infección de ratones con L. monocytogenes en vivo. El patógeno se maneja con seguridad bajo condiciones BSL2 por personal capacitado que no están inmunocomprometidos. Las personas inmunocomprometidas son las mujeres embarazadas, los ancianos y las personas que están infectadas con el VIH o que tienen enfermedades crónicas que requieren tratamiento con la terapia inmunosupresora. El personal debe ponerse una capa protectora de laboratorio o una bata, guantes, máscara y protección para los ojos durante la manipulación de las muestras infectadas. El trabajo descrito en este document....
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Resultados
La Figura 3 presenta un poco de flujo típico de citometría de tinción de IFN-γ en las células NK y NKT esplénicas a las 24 horas después de la infección con 10 5 CFU del patógeno. Esta figura también ilustra la estrategia de gating para el panel de tinción descrito en la Tabla 2. La Figura 4 muestra algunos datos representativos que se obtuvieron en un experimento donde los ratones macho se trataron con el antagonista de PPAR .......
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Discusión
Aquí se describe un protocolo sobre cómo llevar a cabo una infección experimental básico con la cepa EGD de L. monocytogenes en 25 ratones C57BL / 6J macho o hembra. Este protocolo se creó con el fin de estudiar el efecto de una novela pequeña molécula IS001 en la producción de IFN-γ por los linfocitos innata y adaptativa in vivo 31. Mediante el control de la eliminación bacteriana y la supervivencia después de la infección, se adquirieron conocimientos sobre cómo estos cambios en.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de intereses que divulgar.
Agradecimientos
El desarrollo de este protocolo fue apoyado por una subvención operativa de CIHR (MOP97807) a SED.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caldo de infusión Brain Heart, Modificado | BD | 299070 | cualquier marca debe ser apropiada |
| Agar | BD | 214010 | cualquier marca debe ser apropiada |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | cualquier marca debe ser apropiada |
| 1x PBS | Sigma | D8537 | cualquier marca debe ser apropiada |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | cualquier marca debe ser apropiada |
| Cloruro de amonio (NH3Cl) | cualquier marca debe ser apropiada | ||
| KHCO3 | cualquier marca debe ser apropiada | ||
| Na2EDTA | cualquier marca debe ser apropiada | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | cualquier marca debe ser apropiada |
| Suero fetal bovino | Gibco | 12483 | Antes de usar, inactive el calor a 56 & grados; C durante 30 min |
| L-glutamina | Gibco | 25030 | cualquier marca debe ser apropiada |
| Aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140 | cualquier marca debe ser apropiada |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco | 15140 | cualquier marca debe ser apropiada |
| GolgiStop Inhibidor del Transporte de Proteínas (que contiene Monensina) | BD | 554724 | Uso 4 μ l en 6 ml de cultivo celular |
| 16% Paraformaldehye | Electrónica Microscopy Sciences | 15710 | Diluido a 4% PFA en ddH2O o 1x PBS |
| 10x Tampón de permeabilidad/lavado | BD | 554723 | Diluido 1x en ddH2 |
| O bloque Fc, Anti-Ratón CD16/CD32 Purificado | eBioscience | 14-0161 | Diluido 1:50 |
| Tinte de viabilidad fijable eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Diluir 1:1.000 (también hemos utilizado tintes de viabilidad de Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, esto debe valorarse antes de su uso. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, este debe ser valorado antes de su uso. |
| PBS57/mCD1d tetrámero-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtenido como regalo de la instalación |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, esto debe valorarse antes de su uso. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, este debe ser valorado antes de su uso. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, este debe ser valorado antes de su uso. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, este debe ser valorado antes de su uso. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Use una gota por tinción |
| Kit de ELISA gamma IFN para ratones | eBioscience | 88-7314 | Se utiliza para medir el interferón gamma en el sobrenadante |
| cultivo Tubos ventilados de 50 ml para cultivo | Utilizado para el cultivo de bacterias, cualquier marca debe ser apropiada | ||
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml cualquier | marca debe ser apropiada | ||
| placas de Petri | cualquier marca debe ser apropiada | ||
| 2 ml de Cyrovials | cualquier marca debe ser apropiada | ||
| Espectrómetro | cualquier marca debe ser apropiada | ||
| agujas de ingeniería de | marca debe ser apropiada | ||
| C57BL/6J | Laboratorios Jackson | Stock#000664 | Ordene para llegada a las 7 semanas |
| Lejía | Para la descontaminación | ||
| 70% Etanol | Para la descontaminación | ||
| Perlas | cualquier marca debe ser apropiada | ||
| Rotor centrífugo | , cubos, tapas de cubos. | ||
| Microcentrífuga: | cualquier marca, debe ser apropiada | ||
| Glicerol | cualquier marca, debe ser apropiada | ||
| Puntas | cualquier marca, debe ser apropiada | ||
| Pipeta | : cualquier marca | ||
| coladores | cualquier marca, debe ser apropiada | ||
| jeringa | cualquier marca, debe ser apropiada | ||
| Pistola | cualquier marca, debe ser apropiada | ||
| Las unidades | cualquier marca, debe ser apropiada | ||
| Azul | diluido de 1 a 9 en ddH2O, cualquier marca debe ser apropiada | ||
| Hemocitómetro | de cualquier marca debe ser apropiado | ||
| Placas de fondo redondo de | cualquier marca debe ser apropiada | ||
| Tubos FACs | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| BD LSR II | BD | Cualquier citómetro de flujo puede ser utilizado para la adquisición que tenga una configuración de láser apropiada y un conjunto de filtros para discriminar los fluorocoromas | |
| Flowjo software | Treestar | Se utiliza para el análisis de datos. Otros tipos de software de análisis de datos también serán apropiados | |
| Pipeta multicanal (0 - 300 y micro; l) | Eppendorf | Se utiliza para lavar células y agregar anticuerpos durante la tinción con citometría de flujo | |
| Ácido | Se utiliza para lavar perlas de vidrio, cualquier marca debe ser apropiada | ||
| Sistema de preservación bacteriana de microbanco | Diagnóstico | Se utiliza como alternativa a las reservas de glicerol para el almacenamiento a largo plazo de bacterias |
Referencias
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol.
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Reimpresiones y permisos
