Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

La infección experimental con

12.8K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/54554

⸱

16 de noviembre de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del patógeno.

Resumen

L. monocytogenes es una bacteria gram-positiva que es una causa de enfermedad transmitida por alimentos en seres humanos. La infección experimental de ratones con este patógeno ha sido altamente informativo sobre el papel de las células inmunes innatas y adaptativas y citocinas específicas en la inmunidad del huésped contra los patógenos intracelulares. La producción de IFN-γ por las células innatas durante la infección subletal con L. monocytogenes es importante para la activación de los macrófagos y el control temprano del patógeno 1-3. Además, la producción de IFN-γ por los linfocitos de memoria de adaptación es importante para la imprimación de la activación de las células innatas a la reinfección 4. La L. monocytogenes modelo de infección por lo tanto sirve como una gran herramienta para investigar si las nuevas terapias que están diseñados para aumentar la producción de IFN-γ tener un impacto en las respuestas de IFN-γ in vivo y tienen efectos biológicos productivos, tales como el aumento de la eliminación de bacterias o la mejora de la supervivencia del ratón deinfección. Se describe aquí es un protocolo básico para cómo llevar a cabo las infecciones intraperitoneales de ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y para medir la producción de IFN-γ por las células NK, células NKT, y linfocitos de adaptación por citometría de flujo. Además, los procedimientos se describen a: (1) crecer y preparar las bacterias para la inoculación, (2) medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado, y (3) la supervivencia medida de los animales a los puntos finales. También se proporcionan datos representativos para ilustrar cómo este modelo de infección se puede utilizar para probar el efecto de agentes específicos en las respuestas de IFN-gamma a L. monocytogenes y la supervivencia de los ratones de esta infección.

Introducción

IFN-γ es una citoquina que es crucial para la mediación de la inmunidad contra los patógenos intracelulares y para controlar el crecimiento del tumor 5. La importancia de esta citocina en la resistencia bacteriana es evidente en la observación de que los seres humanos con mutaciones en la vía de señalización de IFN-γ son altamente susceptibles a la infección por micobacterias y salmonelas 6. De manera similar, los ratones deficientes en IFN-γ o los defectos de exhibición receptor de IFN-γ en la resistencia a las micobacterias 7-9 y otros patógenos intracelulares, incluyendo L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13, y ciertos virus 11. Además de los agentes patógenos que combaten, IFN-γ juega un papel crucial en la defensa de huésped contra tumores 14. Aunque una mayor producción de IFN-γ es beneficioso en el contexto de la infección o el cáncer, la producción prolongada de esta citocina se ha relacionado to el desarrollo de autoinmunidad sistémica 15-17 y la aceleración de la diabetes tipo I en el modelo de ratón diabético no obeso 18.

Las principales fuentes de IFN-γ incluyen células NK, células NKT, delta gamma células T, células T auxiliares 1 (Th1) y linfocitos T citotóxicos (CTL) 5,19,20. IFN-γ aumenta tanto la inmunidad innata y adaptativa por: (1) hasta la regulación de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II expresión, (2) el aumento de la expresión de moléculas co-estimuladoras en las células presentadoras de antígeno, (3) los macrófagos mejora la fagocitosis y la producción de citoquinas pro-inflamatorias y microbicidas factores (por ejemplo, óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno), (4) la promoción de la diferenciación de células T CD4 + vírgenes en células efectoras Th1, (5) la promoción de cambio de clase de anticuerpo a la inmunoglobulina ( Ig) 2a y IgG3 (en el ratón), (6) la inducción de la producción de quimiocinas para reclutar células inmunes a sitios de iNFECCIÓN, y (7) el aumento de células NK y las respuestas de CTL 5,19. Dada la importancia crucial de IFN-γ en la respuesta del huésped a patógenos y tumores, IFN-γ recombinante ha sido probado como tratamiento para diversas infecciones y neoplasias (revisado en 19). Sin embargo, ya que la administración sistémica de IFN-γ o la citoquina Th1 promoción de la interleucina-12 (IL-12) está asociada con efectos secundarios y la toxicidad relacionada con la dosis 19,21, existe un interés en el desarrollo de estrategias alternativas para aumentar la producción de IFN-γ por células inmunes. El desarrollo de nuevos productos biológicos y moléculas pequeñas requiere herramientas de cribado in vivo para probar si tales agentes aumentan la producción de IFN-γ durante una respuesta inmune y si esto se traduce en efectos biológicos significativos tales como el aumento en la supervivencia animal.

La infección experimental de ratones con la bacteria L. monocytogenes gram positivas ha sido un modelo Instrumental paradescifrar el papel del IFN-γ en el huésped-inmunidad contra patógenos intracelulares 1,22. La infección de ratones con el patógeno por vía intravenosa o por vía intraperitoneal (ip) conduce a la rápida difusión de las bacterias en el bazo y el hígado, donde quedan internalizadas por los macrófagos residentes y los hepatocitos con cargas bacterianas pico en el bazo se producen entre 3 y 4 días post 1,3,22 infección. La producción de IFN-γ por las células NK es importante para la activación de macrófagos y la resistencia temprana contra el patógeno 3; Sin embargo, a dosis altas infecciosas, producción de IFN-γ también puede ser perjudicial para aclaramiento patógeno 23. Células NKT son también una fuente de IFN-γ en el bazo y el hígado durante el control temprano de patógenos 2,24 y esta producción se ha demostrado para amplificar la producción de IFN-γ por otros tipos de células incluyendo las células NK 2. Por otra parte, después de acción linfocitos T de adaptación, las células T CD8 + en particular, son importantes para mediar en la eliminación del patógeno y proporcionando protección contra 1,4,22 reinfección.

Este modelo de infección ha sido atractivo para los investigadores para una serie de razones (revisado en 1). En primer lugar, la infección con el patógeno es altamente reproducible e induce una fuerte respuesta inmune Th1 y celular. En segundo lugar, durante la infección subletal, la carga bacteriana se concentra en el hígado y el bazo en los que se puede medir fácilmente. En tercer lugar, el patógeno puede ser manejado con seguridad bajo nivel de bioseguridad 2 (BSL2) condiciones. En cuarto lugar, el organismo y la respuesta inmune que genera se han caracterizado ampliamente. Por último, una variedad de cepas mutantes y genéticamente modificados han sido desarrollados que están disponibles para su uso.

Aquí se describe un protocolo básico para la inoculación de los ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y 25 para la medición de IFN - γ rerespuestas por NK, NKT, y los linfocitos de adaptación después de la infección. También se describe cómo medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado después de la infección subletal y para llevar a cabo estudios de supervivencia después de la infección con un LD 50 dosis modificada del patógeno. Finalmente, los datos representativos se muestran de cómo este protocolo se puede utilizar para detectar el efecto de los nuevos tratamientos en las respuestas de IFN-gamma y la supervivencia del ratón de L. monocytogenes infección.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Notificación de seguridad

Este protocolo describe la infección de ratones con L. monocytogenes en vivo. El patógeno se maneja con seguridad bajo condiciones BSL2 por personal capacitado que no están inmunocomprometidos. Las personas inmunocomprometidas son las mujeres embarazadas, los ancianos y las personas que están infectadas con el VIH o que tienen enfermedades crónicas que requieren tratamiento con la terapia inmunosupresora. El personal debe ponerse una capa protectora de laboratorio o una bata, guantes, máscara y protección para los ojos durante la manipulación de las muestras infectadas. El trabajo descrito en este documento se realizó en condiciones BSL2 con un certificado (# 32876) que fue emitido por la Red de Salud de la Universidad (UHN) Bioseguridad oficina. Los cadáveres de los ratones infectados o cualquier tejidos utilizados fueron doble bolsa y desecharse de residuos biológicos peligrosos. Las jaulas de los ratones infectados también fueron descontaminados en autoclave.

Declaración de Ética

Los ratones fueron mantenidos y se infectaron en un quarasala de ntine dentro de las instalaciones de animales UHN y fueron atendidos de acuerdo con las directrices establecidas por el Consejo Canadiense de Protección de los Animales. Todos los procedimientos realizados en ratones se llevaron a cabo en virtud de la utilización de animales protocolo # 3214, que fue aprobado por el comité de cuidado de los animales UHN. Debido a consideraciones éticas, la muerte no se utilizó como un punto final para estudios de supervivencia. La DL 50 dosis modificada presentada aquí por L. monocytogenes se determinó que la dosis a la cual el 50% de los ratones alcanzó criterios de valoración específicos, que consistía en una pérdida del 20% en el peso corporal o que presenten al menos dos de los siguientes signos clínicos: letargo, pelo erizado, postura encorvada, dificultad para respirar, los ojos apagados o hundidos. Los ratones fueron sacrificados cuando alcanzaron los puntos finales a través de la exposición al dióxido de carbono (CO 2) de acuerdo con normas de su institución UHN.

1. Preparación de reservas de glicerina para el almacenamiento a largo plazo

NOTA: Este procedimiento describe cómo las existencias de glicerol de laEGD cepa de L. monocytogenes se preparan a partir de un stock de glicerol originales. Pasos que tienen el potencial de generar aerosoles deben llevarse a cabo dentro de una cabina de bioseguridad certificada (BSC).

  1. Preparar placas de agar de infusión de cerebro y corazón (BHI) para el crecimiento bacteriano. Para ello coloca el 3,8% (w / v) de caldo BHI y el 1,5% (w / v) de agar a doblemente destilada H2O (ddH2O). líquido autoclave. Una vez que el agar se enfría a 50 ° C, dispensar líquido en placas de petri bacterianas (25 ml / placa) y dejar que las placas secas (no cubierto) en el BSC para 1 hr.
    NOTA: BHI agar de transferencia en un 50 ° C baño de agua después de la esterilización en autoclave para evitar la solidificación antes de verter las placas. Almacene las planchas BHI a 4 ° C al revés (con la cara de impresión hacia arriba) hasta que esté listo para su uso.
  2. Preparar medios BHI líquido. Para esto, la mezcla 3,8% (w / v) de caldo de BHI en ddH 2 O. Autoclave.
  3. Retire el glicerol congelada balance de la cepa de L. monocytogenes EGD de la congelación de -80 ° Cr y descongelación a temperatura ambiente.
  4. Sumergir la punta de pipeta estéril en el stock de glicerol descongelados e inmediatamente consecutivas la punta hacia atrás y adelante a través de una sección de una placa BHI. Esta es la racha primaria.
  5. Gire la placa a 90 ° C y con una punta de pipeta nueva, arrastre a través de la primera racha y se extendió a la siguiente cuarta parte de la placa (esto es la racha secundaria). Repetir una vez más para hacer que la racha terciaria.
  6. Invertir la placa y se incuba a 37 ° C durante la noche. Las colonias individuales uniformes deben ser obtenidos en la última serie de rayas y visible entre 16 y 24 horas.
  7. Dispensar 10 ml de caldo de BHI estéril en un tubo de ml estéril con ventilación 50. Elige una colonia de L. monocytogenes de la placa usando una punta de pipeta estéril e inocular el caldo. Incubar el cultivo en un incubador con agitación orbital 37 ° C durante la noche o hasta DO600 = 1,0 con ajustes a 225 revoluciones por minuto (rpm).
    NOTA: El vidrio desechable o plamatraces Erlenmeyer STIC también se pueden utilizar para cultivar bacterias. Independientemente del tipo de recipiente utilizado, asegurarse de que es estéril, ventilación y que el volumen de cultivo no exceda del 20% del volumen total del recipiente para asegurar la aireación adecuada de la bacteria.
  8. Preparar las existencias de glicerol mezclando glicerol estéril 100% con cultivo líquido bacteriano durante la noche a una proporción de 1: 1. Distribuir la mezcla de bacterias / glicerol en viales de 2 ml criogénicos (500 l / vial) y viales de transferencia a -80 ° C congelador para su almacenamiento.
    NOTA: métodos de valores del grano también se pueden utilizar en lugar de las existencias de glicerol para almacenar las bacterias. Mediante este método, microperlas porosas se inoculan con un cultivo puro de L. monocytogenes y se almacenan a -80 ° C. Cada cuenta puede ser utilizado para inocular un cultivo fresco como sea necesario. Ver la lista de materiales para obtener más información.

2. Determinación de la curva de crecimiento de L. monocytogenes en el Día de la Cultura

NOTA: Este procedimiento describe cómo generar la curva de crecimiento de L. monocytogenes que se utiliza para estimar las unidades formadoras de colonias (UFC) para estudios de infección. Todos los pasos que tienen el potencial de generar aerosoles deben realizarse dentro de un BSC certificada.

  1. Tomar 100 l de cultivo de una noche generada en la etapa 1.7 a los medios BHI 10 ml en un tubo de ventilación 50 ml y crecer a 37 ° C en una incubadora con agitación (225 rpm, inclinado en 45 ° de ángulo). Use un tubo no inoculado como control.
  2. Tomar muestras de 0,5 ml del cultivo a intervalos de una hora (1, 2, 3, 4, 5, 6 hr, etc.). Diluir cada alícuota 1: (v / v) 1 con los medios BHI en una cubeta de plástico. Pipetear arriba y abajo para mezclar. Medir la densidad óptica (DO) a 600 nm (OD 600) usando un espectrómetro. Continuar el cultivo de bacterias hasta que OD 600 = 1.
  3. Al mismo tiempo, tomar una muestra de 100 l de la cultura y se diluye con 900 l de medios BHI en una estéril 1,5 ml micrtubo ocentrifuge (esta es la dilución 10 -1). Centrifugar las bacterias a 6000 xg durante 5 min, y aspirar el sobrenadante.
  4. Lavar dos veces las bacterias resuspendiendo el sedimento en 1 ml de medio BHI, centrifugación durante 5 min a 6.000 xg, a continuación, aspirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 1 ml de medio BHI. Preparar una serie de diluciones de 10 veces de esta muestra en medios BHI (10 -2-10 -9). Spread 100 l de cada diluyente en placas de agar BHI separadas. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C en una incubadora.
  5. Al día siguiente, recoger placas que tienen encuentre entre 30 - 300 colonias. Desechar el resto. Contar las colonias de estas placas. Tabla 1 muestra un ejemplo de los recuentos obtenidos en una parte alícuota que se tomó cuando OD 600 = 0,84. En este ejemplo, una de las placas (es decir, 10 -6 dilución) tenían recuentos de colonias entre 30 a 300 y se utilizó para el cálculo CFU / ml.
    NOTA: Las placas con mayorde 300 colonias no se utilizan, ya que el hacinamiento puede obstaculizar el crecimiento bacteriano y también hace que sea difícil de discernir y enumerar las colonias individuales. Las placas con recuentos de <30 también no se utilizan debido a pequeños errores en la técnica de dilución o la presencia de contaminantes pueden tener un gran impacto en la precisión de los recuentos en el extremo inferior de la gama.
  6. Se divide el número de colonias por el volumen plateado y luego se multiplica por el factor de dilución para obtener el valor de ufc / ml para una dilución particular. En el ejemplo de la Tabla 1, el recuento a la dilución 10 -6 era 70. Dividir este valor en 0,1 ml para obtener el valor ufc / ml para el cultivo diluido. Entonces multiplicar este valor por el factor de dilución (10 6) para obtener el valor de ufc / ml del cultivo no diluido (7,0 x 10 8).
  7. Trazar la OD 600 (eje y) frente al tiempo en h (eje x) para identificar la fase logarítmica de crecimiento 26.
    NOTA: Este curv crecimientoE proporciona una estimación de la UFC / ml del cultivo de día cuando se cultiva a una cierta lectura de la DO. Elija una lectura de DO 600 que está en la fase logarítmica de crecimiento que puede ser utilizado como un OD de destino 600 para el cultivo de cultivos de día. Estos datos ahora pueden ser utilizados para estimar el UFC en una cultura para la preparación del inóculo (Procedimiento 3).

3. Preparación del inóculo para la infección experimental con L. monocytogenes

NOTA: Este procedimiento describe la preparación del inóculo infeccioso de una cultura día en que se inició a partir de un cultivo de una noche (preparado en el Procedimiento 2). Todos estos pasos se realizan en el BSC a menos que se indique lo contrario.

  1. Calcular el número de CFU necesaria para la infección sobre la base del número de ratones y el diseño experimental del estudio. Añadir un volumen apropiado de medios BHI a un matraz o tubo de cultivo Erlenmeyer de ventilación estéril.
    NOTA: La UFC de bacterias preparados será dependiente del tipo de experimento realizado. Para el estudio de NK y respuestas de las células NKT durante la infección, cada ratón se inocula con 10 5 UFC de bacterias (Procedimiento 6). Si el estudio de respuestas de células T de adaptación a la infección o la medición de la carga bacteriana, cada ratón se inoculó con 2 x 10 4 UFC de bacterias (Procedimiento 8). Si el estudio de la supervivencia a los puntos finales, cada ratón se inocula con la dosis LD 50 del patógeno (que es de 10 5 UFC para los hombres y 1,5 x 10 5 UFC para las mujeres, véase el Procedimiento 9).
  2. Inocular el tubo que contiene el medio BHI con 100 l de cultivo durante la noche. Incubar el cultivo en una incubadora a 37 ° C agitación orbital (225 rpm) hasta OD diana 600 se alcanza. Transferir el contenido de cultivo en un tubo de centrífuga estéril.
  3. bacterias de centrífuga en un gránulo durante 5 min a 6000 xg utilizando una centrífuga. Aspirar el sobrenadante utilizando un vacío unido a un matraz trampa que contiene cloro.
  4. Lavado de pellets dos veces con fosfato 1x solución salina tamponada (PBS), centrifugación (5 min a 6.000 xg) en el medio.
  5. Aspirar el segundo lavado y diluir las bacterias a la concentración apropiada en PBS 1x para entregar la CFU de interés para cada ratón en un volumen de 200 l.
    NOTA: Lo mejor es utilizar una fuente comercial de PBS estéril 1x para el lavado de las bacterias y para la preparación del inóculo, ya que la cristalería de laboratorio puede introducir contaminantes inmunológicas tales como lipopolisacárido.

4. La infección experimental de ratones con L. monocytogenes

NOTA: Este procedimiento describe cómo infectan los ratones con el inóculo preparado en el paso 3 y cómo comprobar el UFC entregado en el inóculo. Manipulación de los ratones y las inyecciones se realizan en un BSC.

  1. Pedir un número suficiente de ratones C57BL macho o hembra / 6J para su experimento. También ordenan los ratones que sirven como controles no infectados.
  2. Permitir a los ratonesaclimatar durante 1 semana antes de la inoculación bacteriana.
    NOTA: Este es debido a que el estrés asociado con el transporte de los animales puede desencadenar un aumento transitorio en la producción de la hormona del estrés y linfopenia 27,28.
  3. En el día de la inoculación, obtener un peso corporal inicial para cada ratón y la inscribirá en el cuaderno de laboratorio.
  4. En el BSC, mezclar la suspensión bacteriana arriba y hacia abajo utilizando una pipeta estéril para asegurar que las bacterias se distribuyen uniformemente y luego tomar hasta 200 l de inóculo en una jeringa de 1 ml de ingeniería de seguridad provista de una aguja 25 G.
  5. Inyectar una ip ratón con 200 l de inóculo preparado (por ejemplo, 10 5 UFC por la infección de las células NK, Procedimiento 6). Para este procedimiento, pescuezo ratones con la mano menos dominante por el acaparamiento de la piel suelta alrededor de los hombros del ratón. Después de asegurarse de que el ratón está bien contenida, inyectar el ratón en el cuadrante inferior del abdomen, justo lateral a la midline para evitar la vejiga.
  6. Deseche la aguja y la jeringa en un recipiente previsto.
  7. Repetir los pasos 4.3 a 4.6 hasta que se inyectan todos los ratones. Llevar a cabo medidas similares con 1x PBS inyectaron a los ratones (controles no infectados).
    NOTA: Dado que el UFC es una estimación basada en la curva de crecimiento, sino que también es una buena práctica para comprobar el UFC real en el inóculo. Para ello, se prepara 3 - 4 diluciones diferentes del inóculo preparado (utilizando series de dilución de 10 veces) que haya indicado dará lugar a colonias contables. Spread 100 l de cada diluyente sobre una placa de agar BHI y se incuba durante la noche a 37 ° C. Contar las colonias y calcular los reales UFC / ml como se describe en el Procedimiento 2.

5. Preparación de L. monocytogenes muertas por calor para Estudios inmune

NOTA: Todos los pasos que tienen el potencial de generar aerosoles se llevan a cabo dentro del BSC.

  1. Cultive hasta el día hasta 600 OD valores de unare alcanzado que están dentro de la fase logarítmica. Prescindir de la cultura en 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
  2. Incubar los tubos en un 70 ° C en un baño de agua durante 1 hora para matar las bacterias.
  3. Lavar las bacterias dos veces con 1x PBS que en los pasos 3.3 y 3.4. Resuspender en medios RPMI completo estériles que contienen suero de ternera fetal (FCS) (véase el archivo de consulta 1 para la receta) a una concentración de 4 x 10 6 / ml. Alícuota mató bacterias en viales de 2 ml criogénicos estériles y se almacena a -80 ° C.
  4. Confirmar la muerte de las bacterias mediante la difusión de 100 l de la preparación de bacterias muertas por calor en placas de agar BHI y se incubó durante la noche a 37 ° C.
    NOTA: Estas bacterias muertas por calor deben estar preparados para estimular los linfocitos en cultivo in Procedimiento 8. Si hay colonias que crecen en la placa de agar BHI, repita el procedimiento para matar el calor.

6. Medición de las respuestas de IFN-gamma por células NK y NKT durante la infección

NOTA: Este procedimiento describe cómo medir las respuestas de IFN-gamma por las células NK y NKT en los ratones a las 24 horas después de la infección con 10 5 UFC de L. monocytogenes. Esta dosis se utiliza debido a que induce respuestas robustas IFN-gamma por las células NK y NKT en el bazo 24. Llevar a cabo todos los pasos en el BSC. Para ayudar a mantener la viabilidad celular, a mantener las células en hielo siempre que sea posible y utilizar tampones fríos como el hielo.

  1. Inocular a los ratones como se describe en el Procedimiento 4 con 10 5 UFC de L. monocytogenes. Al mismo tiempo, se inyectan ratones de control no infectados IP con un volumen igual de PBS 1x.
  2. La eutanasia a los ratones a las 24 horas después de la inoculación mediante inhalación de CO2 de acuerdo con las directrices institucionales.
  3. Mentir cada ratón sobre su lado derecho y humedecer la piel con etanol al 70% usando un frasco lavador.
  4. El uso de pinzas asépticas o estériles y tijeras-difíciles de cortar, una incisión en la piel justo por debajo de la parte inferior de la caja torácica.
  5. rocíela capa muscular expuesta con 70% de etanol. El bazo debe ser visible debajo de la capa muscular (cabeza de flecha abierta en la figura 1).
  6. El uso de pinzas asépticas o estériles y tijeras finas, una incisión en la capa muscular para revelar el bazo. agarrar suavemente el bazo con las pinzas y el uso de tijeras finas para cortar el bazo lejos del tejido conectivo circundante.
  7. Coloque el bazo en un tubo cónico de 15 ml que contenía 1x estéril PBS.
  8. La mitad de llenado en placas de Petri estériles con estéril 1x PBS. Disociar el bazo a través de un filtro de células de nylon 70 micras en la placa de Petri con el extremo plano de una jeringa estéril de 3 ml.
  9. Transferir la suspensión de esplenocitos en un tubo cónico de 15 ml estéril limpia utilizando una pipeta serológica de 10 ml estéril.
  10. Centrifugar las muestras a 335 xg durante 10 min a 4 ° C.
  11. Aspirar el sobrenadante en un matraz trampa que contiene cloro. Aflojar el sedimento celular colocando el tubo con un dedo o arrastrando el tubo inferiorde ida y vuelta a lo largo de una superficie corrugada (por ejemplo, el flujo de salida de aire en el BSC).
  12. Lisar las células rojas de la sangre mediante la adición de 1,5 ml de amonio-cloruro y potasio (ACK) de tampón de lisis (ver Archivo Suplementario para la receta 1) a cada bazo. Después de exactamente 1 min y 15 segundos, llenar el tubo con 1x PBS para detener la lisis celular.
  13. centrifugar las células como se describe en el paso 6.10. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de células activadas por fluorescencia (FACS) Buffer (estéril 1x PBS que contenía 2% FCS).
  14. Contar las células utilizando un hemocitómetro. Para ello, tomar dos alícuotas de la suspensión celular para contar. Añadir 15 l de cada suspensión celular a un volumen igual de Trypan azul (0,04%, preparada diluyendo una solución de azul de tripano al 0,4% en ddH 2 O). Carga de 15 l de cada suspensión celular azul / tripán en la cámara del hemocitómetro (es decir, uno en la cámara superior, una en la cámara inferior).
  15. Usando un microscopio, contar todas las células no azules encinco grandes plazas de la red central en cada cámara (Figura 2). Tome este recuento y se divide por 10 para obtener el número de células en 10 6 / ml. En el ejemplo de la Figura 2, el recuento es de 215 células en los 5 cuadrados; Por lo tanto, la concentración de células es de 21.5 x 10 6 / ml. La media de los concentraciones de células obtenidas a partir de las dos muestras.
  16. Semillas 1 x 10 6 células por pocillo / mancha en una placa de fondo redondo de 96 pocillos para la tinción de citometría de flujo. Asegúrese también de sembrar las células sin teñir y menos de uno de fluorescencia controles (FMO). Ver citometría de flujo recomendada panel de tinción en la Tabla 2.
    NOTA: Para los siguientes pasos, se recomienda mantener las células en hielo oa 4 ° C y para proteger las células de la luz con papel de aluminio cuando fluorocromos están presentes. Una pipeta multicanal puede ser utilizado para dispensar líquidos en placas de 96 pocillos de tinción para acelerar el procesamiento. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento celular cuandoaspirar el sobrenadante de la placa de centrifugado. La tinción también se puede hacer en los tubos de FACS si la centrífuga no está equipado con adaptadores de placas. Todas las etapas de centrifugación partir de este momento se llevan a cabo en 456 g durante 5 min a 4 ° C.
  17. Se centrifuga la placa y lavar las células dos veces con tampón FACS. Uno de lavado se realiza mediante la adición de 200 l de tampón de FACS a cada pocillo, centrifugación de la placa, y luego aspirar el sobrenadante.
  18. Realizar etapa de bloqueo mediante la adición de 50 l / pocillo de tampón FACS que contiene anti-ratón CD16 / CD32 (bloque Fc purificada) (0,5 g). Se incuban las células a 4 ° C durante 15 min. Lavar las células una vez en 1 x PBS como se describe anteriormente.
  19. Añadir 100 ml de colorante de viabilidad (tinte viabilidad fixable diluyó 1: 1000 en 1 x PBS) a las células. células de la mancha a 4 ° C en la oscuridad (en el refrigerador) durante 30 min. Lavar las células dos veces en tampón FACS como se describe anteriormente.
  20. Después de un segundo lavado, añadir 100 l de anticuerpos de la superficie celular o tetrámeros a respectivos pozos de acuerdo to El panel de tinción se describe en la Tabla 2. células de la mancha a 4 ° C en la oscuridad (en el refrigerador) durante 30 min. En este momento, también añadir anticuerpos para la tinción de controles positivos y FMO individuales.
    NOTA: En cuanto a los controles positivos individuales, se recomienda a cualquiera de los esplenocitos de uso que se tiñen con diferentes versiones fluorocromo del anticuerpo CD4 o bolas de compensación comerciales que se tiñen con los anticuerpos utilizados en el panel. Antes de la realización de este procedimiento de tinción, todos los anticuerpos FACS se deben titular en los estudios de prueba para determinar las concentraciones óptimas para la tinción.
  21. Lavar las células dos veces en tampón FACS como se describe anteriormente y a continuación, fijar las células mediante resuspensión en 50 l de 4% de paraformaldehído (16% de paraformaldehído Stock diluido en ddH 2 O) e incubando durante 10 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El paraformaldehido es tóxico y sólo debe ser utilizado de la campana de humos.
  22. Lavar las células dos veces in tampón FACS, centrifugación en el medio. Resuspender las células en tampón de FACS. Continuar con las células del paso o almacenar en el refrigerador próximos protegida de la luz durante un máximo de tres días.
  23. centrifugar las células, eliminar el sobrenadante, y se lavan las células dos veces con 150 ml de 1x permeabilización / tampón de lavado (tampón / lavado Perm), centrifugando en el medio. El / tampón de lavado Perm se prepara de una reserva de 10 veces mediante la dilución de 1: 9 (v / v) en ddH 2 O.
  24. Después del segundo lavado, resuspender las células en 150 l de Perm / Wash Buffer y se incuba durante 15 min a 4 ° C en la oscuridad.
  25. Centrifugar las células de nuevo y luego aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 50 l de 1 x tampón Perm / Wash que contienen anti-IFN-γ e incubar durante 1 hora a 4 ° C en la oscuridad.
  26. Lavar las células dos veces con 1 x tampón Perm / Wash, centrifugación en el medio. Resuspender las células en 250 l de tampón de FACS y luego transferir las células a tubos de FACS.
  27. Proceder a la adquisición de la citometría de flujo utilizando un flujo cytometer que tiene un conjunto de configuración láser y filtro adecuado para discriminar fluorocromos utilizados en el panel de tinción se describe en la Tabla 2 29. Recoge al menos 200.000 eventos por muestra y 10.000 eventos para los controles de compensación.
  28. Aplicar matriz de compensación y analizar datos utilizando el software de análisis de citometría de flujo 30.

7. Medición de la carga bacteriana en el bazo y el hígado en el momento de la infección máxima

NOTA: Todos los pasos se llevan a cabo dentro de un BSC a menos que se indique lo contrario.

  1. Inoculan los ratones ip con 2 x 10 4 UFC del patógeno utilizando los procedimientos descritos en el Procedimiento 4.
  2. En días después de la infección 3, la obtención de 1.5 ml tubos de microcentrífuga estériles, que contienen cada uno 500 l de helado estéril 0,1% de Triton X-100 en PBS 1x y 0,2 - 0,3 g de 1,5 - perlas de vidrio estéril lavado con ácido 2 mm. Pesar cada tubo.
    NOTA: Las cuentas de vidrio son lavadas con ácido por incurendido en ácido acético al 10% en un vaso de precipitados sobre un agitador magnético durante 1 hr. Estas perlas se lavaron exhaustivamente con ddH 2 O para eliminar el ácido, se secan al aire, y luego en autoclave antes de su uso.
  3. La eutanasia a los ratones por exposición al CO 2.
  4. Para la disección de los órganos, poner el animal en su parte posterior en una tabla de disección y el pin de las extremidades del ratón a la placa utilizando 25 g de agujas. Desinfectar la piel humedeciendo con un 70% de etanol.
  5. Con unas tijeras de corte difíciles estéril practicar una incisión en la línea media en la piel desde la ingle hasta la mitad del pecho y luego a partir de mediados de la ingle hacia cada rodilla y desde el pecho hacia mediados de cada codo. disección roma y refleja de nuevo la piel, clavándolo abrirá mediante 25 g de agujas.
  6. Desinfectar capa muscular mojándolo con un 70% de etanol y luego con unas tijeras finas estériles hacen una incisión en la línea media en la pared peritoneal. Coge el proceso xifoides con unas pinzas. Luego, usando las mismas tijeras finas, hacer recortes en la pared peritoneal del proce xifoidesss lateralmente en cada lado, a raíz de la caja torácica, justo por debajo del diafragma para revelar el hígado.
  7. Cortar un trozo mg ~ 100 del hígado (utilizar el mismo lóbulo para todos los ratones) con unas tijeras estériles y colocarlo en un tubo de microcentrífuga previamente pesado de 1,5 ml.
  8. El uso de fórceps para empujar suavemente a un lado los órganos en el lado izquierdo de la cavidad peritoneal para visualizar el bazo. agarrar suavemente el bazo con un par de pinzas y liberarlo de la cavidad peritoneal cortando el tejido conectivo circundante.
  9. Coloque el bazo en el tubo previamente pesados ​​de 1.5 ml contiene perlas. Transporte tejidos al laboratorio en un recipiente que contenga hielo a prueba de fugas. Volver a pesar de los tubos que contienen los órganos para determinar los pesos de los tejidos en mg.
  10. Homogeneizar los tejidos por agitación de los tubos usando un molino homogeneizador de microesferas durante 3 min a una frecuencia de 30 Hertz.
    NOTA: Se prefiere el método de molino de bolas para la homogeneización, ya que es susceptible de procescantar un gran número de muestras y crea menos lío y la posible exposición al patógeno. Sin embargo, homogeneizadores automáticos o en autoclave 2 ml homogeneizadores de tejidos de vidrio manual pueden ser utilizados como una alternativa.
  11. Preparar una serie de diluciones de 10 veces de los homogeneizados en 0,1% Triton-X-100 en PBS 1x, que van desde (que van desde sin diluir a 10 -7).
  12. Extender 100 l de cada homogeneizado diluido en una placa de agar BHI (por duplicado) utilizando un esparcidor estéril. placas de transferencia a una incubadora a 37 ° y se incuban durante la noche.
  13. Mantener las placas que contienen entre 30 y 300 colonias / placa, desechar el resto. Recuento de las colonias en cada placa y determinar el número medio de colonias para los diferenciales de duplicados.
  14. Calcular la CFU / mg según la siguiente ecuación:
    CFU / mg = CFU / ml en el homogenado, multiplicado por los ml de homogeneizado preparado, dividido por el peso mg del tejido homogeneizado.
    NOTA: Por ejemplo, si una media de 30 colOnies fueron contados después de la siembra de 100 l de 10 -2 homogeneizado diluido preparado a partir de una pieza de 120 mg de hígado que se homogeneizó en 0,5 ml, el cálculo sería el siguiente:
    CFU (factor de dilución) / ml = 30 colonias x 100 / 0,1 ml (volumen de cálculo) = 30.000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30 000 CFU / ml x 0,5 ml de homogeneizado / 120 mg de tejido = 125 CFU / mg.

8. Efectos de L. monocytogenes sobre las respuestas de IFN-gamma por las células CD4 + y CD8 + células

NOTA: Este procedimiento describe cómo medir la producción de IFN-γ por esplénica CD4 + y células efectoras T CD8 + cosechada en el momento del pico de la respuesta adaptativa inmune (~ 7 días post-infección) mediante dos métodos: (1) el flujo de citometría para medir IFN gamma por CD4 + y CD8 + por tinción intracelular de citoquinas, y (2) ELISA para medir los niveles totales de IFN-γ producidos por los esplenocitos (incluye todas las células T). procedimientosse llevan a cabo dentro del BSC.

  1. Infectar los ratones mediante la inyección ip con 2 x 10 4 CFU del patógeno usando los procedimientos descritos en el Procedimiento 4.
  2. En el día 7 después de la infección, la eutanasia a los ratones mediante inhalación de CO2 de acuerdo con las directrices institucionales.
  3. Diseccionar el bazo (como se describió anteriormente) y se coloca en un tubo cónico de 15 ml que contenía 1x estéril PBS. Transportar los tubos al laboratorio en un recipiente que contenga hielo a prueba de fugas.
  4. Procesar los bazos en una suspensión de células individuales, la lisis de las células rojas de la sangre tal como se describe en la sección 6, y luego volver a suspender las células en medio RPMI completo que contenía 10% de FCS. Recuento de células utilizando un hemocitómetro.
  5. Creados culturas para la medición de las respuestas de IFN-gamma. Por estas células de dispensación (4 x 10 6 en 1 ml / pocillo) en placas de 24 pocillos y junto con el mismo número (4 x 10 6 o 1 ml / pocillo) de L. monocytogenes descongelados muertas por calor (preparado en el Procedimiento 5) . La transferencia de células a un 37° C incubadora.
  6. Después de 20 horas de incubación, añadir 0,66 l / ml de inhibidor de la proteína de transporte de pozos y continuar incubaciones.
  7. Cuatro horas más tarde, la transferencia de placa a BSC y recoger 500 l de sobrenadante de cultivo y la congelación (a -80 ° C) para la medición posterior de los niveles de IFN-gamma utilizando un kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima comercial (ELISA) 31. A continuación, recoger las células en un tubo estéril de 15 ml. Lavar los pocillos con PBS 1x y poner en común este lavado junto con las células recogidas.
  8. Llevar a cabo la tinción de la superficie celular y la tinción intracelular para IFN-γ en CD4 + y CD8 + como se describe en el Procedimiento 6, salvo el uso del panel de tinción descrito en la Tabla 3. Continúe con el citómetro de flujo adquisición (recogida de 200.000 eventos / muestra) y analizar los datos 29 utilizando citometría de flujo software de análisis 30.

9. Medición de ratón La supervivencia a los puntos finales después de L. monocytogenes Infección

NOTA: Este procedimiento describe el efecto de un agente de supervivencia de los ratones a los puntos finales después de la infección con la dosis DL50 modificada del patógeno. Todos estos procedimientos se llevan a cabo en el BSC en las instalaciones de animales.

  1. Inyectamos ratones IP con la dosis DL50 modificada de L. monocytogenes como se describe en el Procedimiento 4. Esto se determinó que era de 10 5 UFC (para hombres) o 1,5 x 10 5 UFC (para mujeres) 31.
  2. Siga los ratones dos veces al día en busca de signos clínicos y registrar estas señales y los pesos corporales de los animales en un cuaderno de laboratorio. La eutanasia a los ratones si muestran una pérdida del 20% en el peso corporal o dos signos clínicos de listeriosis (letargo, pelo erizado, postura encorvada, dificultad para respirar, los ojos apagados o hundidos).
  3. Después de 14 días, la eutanasia a los ratones supervivientes a través de inhalación de CO2.
  4. Preparar gráficos de Kaplan-Meier de los datos representando el porcentaje de supervivencia de cada grupo contra el tiempo 32.
    NOTA: Si los ratones sucumben a la infección (cumplir criterios de valoración descritos en la Declaración de Ética), lo que normalmente ocurre durante el día 5 después de la infección (Figura 7).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La Figura 3 presenta un poco de flujo típico de citometría de tinción de IFN-γ en las células NK y NKT esplénicas a las 24 horas después de la infección con 10 5 CFU del patógeno. Esta figura también ilustra la estrategia de gating para el panel de tinción descrito en la Tabla 2. La Figura 4 muestra algunos datos representativos que se obtuvieron en un experimento donde los ratones macho se trataron con el antagonista de PPAR ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Aquí se describe un protocolo sobre cómo llevar a cabo una infección experimental básico con la cepa EGD de L. monocytogenes en 25 ratones C57BL / 6J macho o hembra. Este protocolo se creó con el fin de estudiar el efecto de una novela pequeña molécula IS001 en la producción de IFN-γ por los linfocitos innata y adaptativa in vivo 31. Mediante el control de la eliminación bacteriana y la supervivencia después de la infección, se adquirieron conocimientos sobre cómo estos cambios en...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

No hay conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

El desarrollo de este protocolo fue apoyado por una subvención operativa de CIHR (MOP97807) a SED.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Caldo de infusión Brain Heart, ModificadoBD299070cualquier marca debe ser apropiada
AgarBD214010cualquier marca debe ser apropiada
Triton X-100Sigma-AldrichX100cualquier marca debe ser apropiada
1x PBSSigmaD8537cualquier marca debe ser apropiada
TissueLyser IIQiagen85300cualquier marca debe ser apropiada
Cloruro de amonio (NH3Cl)cualquier marca debe ser apropiada
KHCO3cualquier marca debe ser apropiada
Na2EDTAcualquier marca debe ser apropiada
RPMI 1640Gibco22400089cualquier marca debe ser apropiada
Suero fetal bovino Gibco12483Antes de usar, inactive el calor a 56 & grados; C durante 30 min
L-glutaminaGibco25030cualquier marca debe ser apropiada
Aminoácidos no esencialesGibco11140cualquier marca debe ser apropiada
Penicilina/estreptomicinaGibco15140cualquier marca debe ser apropiada
GolgiStop Inhibidor del Transporte de Proteínas (que contiene Monensina)BD554724Uso 4 μ l en 6 ml de cultivo celular
16% ParaformaldehyeElectrónica Microscopy Sciences15710Diluido a 4% PFA en ddH2O o 1x PBS
10x Tampón de permeabilidad/lavadoBD554723Diluido 1x en ddH2
O bloque Fc, Anti-Ratón CD16/CD32 PurificadoeBioscience14-0161Diluido 1:50
Tinte de viabilidad fijable eFluor 506eBioscience65-0866Diluir 1:1.000 (también hemos utilizado tintes de viabilidad de Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)eBioscience15-0041El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, esto debe valorarse antes de su uso.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)eBioscience11-0081El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, este debe ser valorado antes de su uso.
PBS57/mCD1d tetrámero-APCNIH Tetramer Core FacilityN/AObtenido como regalo de la instalación
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)eBioscience25-5961El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, esto debe valorarse antes de su uso.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)eBioscience47-3351El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, este debe ser valorado antes de su uso.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)eBioscience25-0451El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, este debe ser valorado antes de su uso.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2)eBioscience12-7311El fabricante recomienda un cierto tamaño de prueba; sin embargo, este debe ser valorado antes de su uso.
OneComp eBeadseBioscience01-1111Use una gota por tinción
Kit de ELISA gamma IFN para ratoneseBioscience88-7314Se utiliza para medir el interferón gamma en el sobrenadante
cultivo Tubos ventilados de 50 ml para cultivoUtilizado para el cultivo de bacterias, cualquier marca debe ser apropiada
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml cualquiermarca debe ser apropiada
placas de Petricualquier marca debe ser apropiada
2 ml de Cyrovialscualquier marca debe ser apropiada
Espectrómetrocualquier marca debe ser apropiada
agujas de ingeniería demarca debe ser apropiada
C57BL/6JLaboratorios JacksonStock#000664Ordene para llegada a las 7 semanas
LejíaPara la descontaminación
70% EtanolPara la descontaminación
Perlascualquier marca debe ser apropiada
Rotor centrífugo, cubos, tapas de cubos.
Microcentrífuga:cualquier marca, debe ser apropiada
Glicerolcualquier marca, debe ser apropiada
Puntascualquier marca, debe ser apropiada
Pipeta: cualquier marca
coladorescualquier marca, debe ser apropiada
jeringacualquier marca, debe ser apropiada
Pistolacualquier marca, debe ser apropiada
Las unidadescualquier marca, debe ser apropiada
Azuldiluido de 1 a 9 en ddH2O, cualquier marca debe ser apropiada
Hemocitómetrode cualquier marca debe ser apropiado
Placas de fondo redondo decualquier marca debe ser apropiada
Tubos FACsFisher Scientific14-959-5
BD LSR IIBDCualquier citómetro de flujo puede ser utilizado para la adquisición que tenga una configuración de láser apropiada y un conjunto de filtros para discriminar los fluorocoromas
Flowjo softwareTreestarSe utiliza para el análisis de datos. Otros tipos de software de análisis de datos también serán apropiados
Pipeta multicanal (0 - 300 y micro; l)EppendorfSe utiliza para lavar células y agregar anticuerpos durante la tinción con citometría de flujo
ÁcidoSe utiliza para lavar perlas de vidrio, cualquier marca debe ser apropiada
Sistema de preservación bacteriana de microbancoDiagnósticoSe utiliza como alternativa a las reservas de glicerol para el almacenamiento a largo plazo de bacterias
de bacterianas UV seguridad cualquier de vidrio de estéril, . de pipeta, . ., de 3 ml, de pipetas, . de filtración, . de tripán . acético Pro-lab

Referencias

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
  30. Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
  31. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  32. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  33. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  34. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  35. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  36. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  37. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  38. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381(2013).
  39. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  40. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  41. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  42. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  43. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  44. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  45. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  46. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Interferón gammainfección en ratonescitometría de flujocarga bacterianabazohígadorespuestas de IFN-gammapatógenos intracelularesinmunidad del huéspedensayo de supervivencia
La infección experimental con
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.