Describimos un método para medir la velocidad de los fagosomas que se mueven hacia el centro celular en células vivas infectadas con o sin el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1, utilizando microscopía de fluorescencia confocal de disco giratorio para identificar células infectadas fluorescentes y microscopía de campo claro para detectar fagosomas.
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Artículo de método
Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1
En este artículo
Resumen
Resumen
Los macrófagos son células fagocíticas que desempeñan un papel importante en la encrucijada entre la inmunidad innata y la específica. Pueden ser infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1 y, debido a su resistencia a sus efectos citopáticos, pueden considerarse reservorios virales persistentes. Además, los macrófagos infectados por el VIH exhiben funciones defectuosas que contribuyen al desarrollo de enfermedades oportunistas.
Se desconoce el mecanismo exacto por el cual el VIH-1 altera la respuesta fagocítica de los macrófagos. Anteriormente habíamos demostrado que la absorción de diversos materiales particulados por parte de los macrófagos se inhibía cuando estaban infectados con el VIH-1. Esta inhibición fue solo parcial y se formaron fagosomas dentro de los macrófagos infectados por el VIH. Por lo tanto, nos centramos en analizar el destino de estos fagosomas. La maduración de los fagosomas se acompaña de la migración de estos compartimentos hacia el centro celular, donde se fusionan con los lisosomas, generando fagolisosomas, responsables de la degradación del material ingerido. Utilizamos glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgG como diana para la fagocitosis. Para medir la velocidad del movimiento centrípeto de los fagosomas en macrófagos individuales infectados por el VIH, utilizamos una combinación de microscopía confocal de campo claro y fluorescencia. Establecimos un método para calcular la distancia de los fagosomas hacia el núcleo, y luego para calcular la velocidad de los fagosomas. Las células infectadas por el VIH se identificaron gracias a un virus que expresa GFP, pero el método es aplicable a células no infectadas o a cualquier tipo de infección o tratamiento.
Introducción
Los macrófagos desempeñan un papel importante en el sistema inmunitario innato y en la homeostasis. Son fagocitos profesionales que internalizan y eliminan patógenos y desechos mediante un proceso llamado fagocitosis 1,2. El fagosoma, el compartimento cerrado que se forma después de la inmersión del material particulado, sufre una serie de eventos de fusión y fisión con compartimentos endocíticos, lo que conduce a un compartimento degradativo llamado fagolisosoma. Este compartimento tiene un pH ácido, debido a la adquisición de v-ATPasas que bombean protones, contiene enzimas hidrolíticas y está enriquecido en proteínas de membrana asociadas a lisosomales (....
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Protocolo
El protocolo tiene que ser llevado a cabo en estricta conformidad con las legislaciones nacionales e internacionales y reglamentos locales. La sangre de donantes sanos que dieron su consentimiento para donar sangre con fines de investigación se ha obtenido a partir de los centros de transfusión de sangre con la que las instituciones han firmado un acuerdo. protecciones especiales se deben tomar cuando se utiliza la sangre humana. Los experimentos con VIH-1 deberán efectuarse en un nivel de bioseguridad 3 o 2 (BSL-3 o 2) de laboratorio de acuerdo con la legislación local.
1. Preparación de macrófagos derivados de monocitos humanos (hMDMs) po....
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Resultados
Fagocitosis mediada por FcR hMDMs infectados por el VIH-1 y no infectados se describe aquí usando SRBCs opsonized-IgG como objetivos modelo (Figura 1). Los pasos críticos de este protocolo son la preparación de hMDMs y la infección con el VIH-1. De hecho, el rendimiento y la calidad de macrófagos diferenciados varía entre los donantes, así como la tasa de infección con eficiencias en el rango de 10-40%. Además, la preparación de IgG-opsonizado-SRBC también es importante .......
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Discusión
Esta técnica tiene varios pasos críticos. En primer lugar, la preparación de hMDMs y su infección por el VIH-1 es muy importante ya que el porcentaje de infección depende de los donantes. Es de destacar, que hemos decidido utilizar los macrófagos que no están polarizados in vitro antes de la infección, debido a que el estado de los macrófagos potencialmente encontradas por el virus in vivo no ha sido bien caracterizado hasta ahora. Se verificó la expresión de varios marcadores de la superficie, lo que .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Jamil Jubrail por leer el manuscrito. Este trabajo ha contado con el apoyo de subvenciones del CNRS, el Inserm, la Université Paris Descartes, la Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 incluyendo una beca doctoral para GLB) y la Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, incluyendo una beca postdoctoral para CD) a FN. A. Dumas ha sido apoyado por becas doctorales de la Université Paris Descartes y Sidaction.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo celular tratada con TC Falcon de 100 mm | Corning | 353003 | Para la producción viral |
| Placas con fondo de vidrio de 35 mm sin recubrimiento 1.5 | Corporación MatTek | P35G-1.5-14-C Caja | Para adquisición |
| Placas de cultivo de tejidos Falcon Thermo | Fischer Scientific | . Inc. 353934 | Para macrófagos derivados de monocitos humanos |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | un polisacárido hidrofílico neutro, muy ramificado, de alta masa, en solución para centrifugación por densidad |
| DPBS, sin calcio, sin magnesio | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, líquido (alta glucosa) | GIBCO, Sondas moleculares | 31966-021 | Conservado a 4 & grados; C ; para el cultivo de células HEK |
| RPMI 1640 medio GLUTAMAX Suplemento | Life technologies | 61870-010 | Conservado en 4 ° C; para la cultura de hMDMs |
| Fœ suero de pantorrilla (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conservado a -20 ° C ; |
| Penicilina-Estreptomicina descomplementada (10.000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conservado a -20 ° C ; para hMDMs cultivo |
| RPMI 1640 medio, sin rojo fenol (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar; para ensayo de fagocitosis |
| FuGENE6 Reactivo de transfección | Promega | E2692 | Conservado a 4 & grados; C ; para la producción viral |
| Glóbulos rojos de oveja (SRBC) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conservado en tampón Alsever a 4 & grados; C antes |
| de usar Glóbulos rojos anti-ovejas IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conservado a 4 & deg; C |
| Fracción de choque térmico de albúmina sérica bovina, pH 7, ≥ 98% | Sigma | A7906 | Conservado a -20 ° C |
| Microscopio invertido DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW láser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Lente de objetivo ; Aumento 100X ; Apertura numérica 1,40 ; Aceite de inmersión | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Cámara | Fotometría | Tamaño de píxel 6.45 y micro; m x 6,45 y micro; m ; Definición 1.392 x 1.040 ; Codificación de la imagen en el | |
| software Metamorph 7.7.5 | Molecular Devices | Para el control del microscopio | |
| Software | Para el análisis estadístico |
Referencias
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F.
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Reimpresiones y permisos
