Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1

Los macrófagos desempeñan un papel importante en el sistema inmunitario innato y en la homeostasis. Son fagocitos profesionales que internalizan y eliminan patógenos y desechos mediante un proceso llamado fagocitosis ^1,2. El fagosoma, el compartimento cerrado que se forma después de la inmersión del material particulado, sufre una serie de eventos de fusión y fisión con compartimentos endocíticos, lo que conduce a un compartimento degradativo llamado fagolisosoma. Este compartimento tiene un pH ácido, debido a la adquisición de v-ATPasas que bombean protones, contiene enzimas hidrolíticas y está enriquecido en proteínas de membrana asociadas a lisosomales (LAMP). La maduración de los fagosomas se acompaña de su migración en los microtúbulos ^3,4 hacia el centro celular para llegar a una localización perinuclear donde se acumulan los lisosomas.

Se ha reportado que muchos patógenos secuestran la maduración del fagosoma, incluyendo bacterias con estilos de vida intracelulares que modifican el ambiente vacuolar donde residen ⁵. El Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)-1 se dirige a los macrófagos además de a las células T. Como los macrófagos son resistentes a los efectos citopáticos del virus, a diferencia de las células T, pueden considerarse como un reservorio del virus. Además, los macrófagos infectados con el VIH-1 muestran funciones fagocíticas defectuosas y contribuyen a la aparición de enfermedades oportunistas. En particular, la enfermedad invasiva grave por Salmonella no tifoidea causada por Salmonella Typhimurium ST313 ha sido prevalente durante las últimas tres décadas en niños o adultos del África subsahariana infectados por el VIH ⁶. Se ha estimado que el riesgo de contraer tuberculosis es más de 20 veces mayor en las personas que viven con el VIH que en las que no están infectadas por el VIH.

Por todas estas razones, es importante definir mejor los mecanismos moleculares que subyacen a los defectos fagocíticos en los macrófagos infectados por el VIH. Hemos demostrado que la absorción de material particulado, partículas opsonizadas, bacterias u hongos, se inhibió en los macrófagos infectados por el VIH ⁷. Dado que esta inhibición es parcial, nos propusimos analizar el destino de los fagosomas internalizados en macrófagos humanos infectados por VIH ⁸. Debido a que la maduración del fagosoma está estrechamente relacionada con la migración al centro celular y la fusión con los lisosomas, un defecto en la maduración del fagosoma puede deberse a modificaciones de las modalidades de tráfico en la célula infectada. El método descrito aquí utiliza glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgG (IgG-SRBC) como modelo para dirigirse a la fagocitosis mediada por receptores y, en particular, a los receptores de la porción Fc de las inmunoglobulinas (FcR). Estas partículas son más fáciles de visualizar en campo claro (BF) que las perlas de látex porque los SRBC extracelulares e intracelulares muestran ^{diferentes propiedades de} refracción. Para medir la velocidad de los fagosomas que se mueven hacia el núcleo en los macrófagos infectados por el VIH, utilizamos un virus fluorescente ¹⁰ y establecimos un método de seguimiento manual simple que se describe aquí. El método no requiere programación avanzada y simplemente utiliza ImageJ. Es susceptible a las células adherentes y a cualquier tipo de partícula o patógeno que pueda visualizarse con microscopía de campo claro o con imágenes fluorescentes.

El protocolo tiene que ser llevado a cabo en estricta conformidad con las legislaciones nacionales e internacionales y reglamentos locales. La sangre de donantes sanos que dieron su consentimiento para donar sangre con fines de investigación se ha obtenido a partir de los centros de transfusión de sangre con la que las instituciones han firmado un acuerdo. protecciones especiales se deben tomar cuando se utiliza la sangre humana. Los experimentos con VIH-1 deberán efectuarse en un nivel de bioseguridad 3 o 2 (BSL-3 o 2) de laboratorio de acuerdo con la legislación local.

1. Preparación de macrófagos derivados de monocitos humanos (hMDMs) por centrifugación en gradiente de densidad y selección por adherencia

1. Comience con la sangre fresca de donantes sanos (9 ml). Diluir todo el volumen de la sangre fresca con 1x estéril salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca2 ⁺ y Mg2 ⁺ para obtener un volumen final de 70 ml y añadir suavemente la sangre diluida en dos tubos de 50 ml cónicos (35 ml por tubo) , en la parte superior de 15 ml de unaeutral, muy ramificado, de gran masa, polisacárido hidrófilo en la solución ya está en cada tubo.
2. Centrifugar los dos tubos de sangre en 537 xg durante 20 min a 20 ° C sin freno. Luego recoger las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) contenidos en el anillo de células nublado en la interfase y transferirlos a un nuevo tubo de 50 ml que contiene 15 ml de 1x PBS sin Ca2 ⁺ y Mg2 ^+.
3. Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C y resuspender el precipitado en 45 ml de 1x PBS sin Ca2 ⁺ y Mg2 ^+.
4. Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, resuspender el precipitado en 10 ml de 1x PBS sin Ca2 ⁺ y Mg2 ^+, y recuento de las células mediante la dilución a una dilución final de 1/200 en Trypan Blue.
5. Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C y resuspender el sedimento en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina y 100 mg / ml Penicillin-estreptomicina tener 7 x 10 ⁶ PBMCs por pocillo en 2 ml de medio en cada pocillo de una placa de pocillos 6.
6. Incubar las placas a 37 ° C con 5% de _CO2 durante 2 hr. Después de 2 horas los monocitos se han adherido al plástico.
7. Para permitir aislados recién monocitos de diferenciarse en hMDMs, aspirar el medio y lo reemplazan con 2 ml HMDM medio (RPMI 1640, 10% descomplementado suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina) suplementado con colonias de macrófagos factor estimulante (RHM-CSF) a una concentración final de 10 ng / ml.
8. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 11 días (Figura 1).
9. En el día 11 se elimina el medio y se lava 2 veces con 2 ml de medio HMDM frío por pocillo. A continuación lavar cada pocillo 2 veces con 1 ml de PBS 1x frío.
10. Para separar hMDMs completamente diferenciadas, lavar cada vez que el pozo 1 con 1 ml de PBS frío 1x con ácido ethylenediaminetetraacetatic 2 mM (EDTA) e incubar las células en 2 ml de PBS frío 1x con EDTA 2 mM por pocillo durante 15 a 60 min a 4 ° C.
    NOTA: Los métodos alternativos para desprender las células existen (por ejemplo, tripsina o actividades similares a la tripsina) que podrían dar buenos resultados ^11.
11. Después de la separación (terminado pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo en el pozo), recoger las células y los puso en un tubo de 50 ml en hielo que contiene 10 ml de medio HMDM frío.
12. Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, resuspender el precipitado en 10 ml de medio HMDM frío y el recuento de las células mediante la dilución de 1/20 en Trypan Blue.
13. Sembrar las células a 1 x 10 ⁶ hMDMs por microscopía de cristal del grado 35 mm placa de fondo y se incuban las placas a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 1 día.

2. Producción y cuantificación de VIH-1 reservas virales

NOTA: NLR4.3 VIH-1 Gag-IGFP (proteína verde fluorescente) que lleva un sobre R5-trópico, obsequio de M. Schindler ¹⁰ se usa para infectar a los macrófagos y para ver las células infectadas en tiempo real.

1. Producir reservas virales mediante la transfección de las células humanas embrionarias de riñón 293T (2 x 10 ⁶ en 100 mm de plato) con 6 g de ADN proviral correspondiente usando un reactivo de transfección comercial.
2. Cuantificar la infectividad de las reservas de virus usando las células indicadoras HeLa TZM-bl (que llevan el gen de ß-galactosidasa bajo el control del VIH-1 LTR) utilizando diluciones seriadas de las reservas de virus, seguido de una coloración ß-galactosidasa de las células y contando de células azules ^12.

3. La infección de hMDMs con VIH-1

1. Añadir el virus a una multiplicidad de infección (MOI) 0,02 a 0,03 en 1 ml de medio de HMDM a hMDMs (células en placas en 1,13). Para los pocillos de control sólo añadir 1 ml de medio de HMDM e incubar los platos a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 2 días (Figura 1).
2. En el día 2 se lavan las células con HMDM medIUM 3 veces y se añade 1 ml de medio fresco HMDM por plato. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 6 días (Figura 1).

4. La opsonización de ovejas Glóbulos rojos

1. Para la preparación de 7 x 10 ⁶ SRBCs por placa, lavar los SRBC dos veces en 100 l de solución que contenía 0,1% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS 1x con centrifugación a 600 xg durante 4 min.
2. Resuspender las SRBC lavadas en 500 l de 1x PBS / BSA 0,1% con IgG de conejo anti-SRBC a una concentración sub-aglutinantes por 5 l de SRBC y se incuba con la rotación a TA durante 30 min.
   NOTA: Para determinar la concentración sub-aglutinantes de IgG anti-SRBC, se preparan diluciones seriadas de la IgG (concentración de reserva a 13,1 mg / ml) a partir de 1/50 a 1 / 25.600 en 20 l en una placa de 96 pocillos. Añadir 2 x 10 ⁶ SRBCs en 20 l en cada pocillo y colocar la placa en una habitación oscura durante varias horas. La concentración sub-aglutinante es ladilución de la bien justo antes de la aglutinación bien con (+ SRBCs IgG formación de una red).
3. Después de la rotación, centrifugar los eritrocitos de cordero-opsonized-IgG a 600 xg durante 4 minutos y se lava con 100 l de 1x PBS / BSA 0,1% con centrifugación a 600 g durante 4 min.
4. Resuspender las-SRBC opsonizadas-IgG en un medio de pre-calentado libre de rojo fenol RPMI suplementado con 2 mM L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina (1 ml / placa).

5. Ensayo en vivo de la célula microscopía de vídeo fagocitosis

1. Utilice un sistema de imagen confocal, tal como un sistema de disco giratorio equipado con una cámara de calentamiento a 37 ° C con CO ₂ pasa a través de una botella con agua para la humidificación.
2. Encienda la cámara de calentamiento antes del experimento para tener la platina del microscopio a 37 ° C antes del comienzo del ensayo de fagocitosis. Encienda el microscopio y el ordenador, y cargar el software de imágenes.
3. Optimizar los ajustes de imagen como la velocidad de exploración, magnífication, la resolución, etc. para tener al menos una célula por campo y a la imagen un fotograma cada minuto entre 60 a 120 min.
   NOTA: En este caso, la muestra se forma la imagen de un marco de cada minuto durante 60 min con 63x lente.
4. Coloque el recipiente de formación de imágenes en la platina del microscopio. Ajustar el enfoque y la ubicación para encontrar sólo un conjunto de VIH-1 de macrófagos infectados en el campo. Use la configuración de excitación / emisión apropiados basados ​​en el sistema de imagen utilizado y la sonda. Incluir un canal brillante campo (BF) para observar los fagosomas (Figura 1II). Optimizar la aparición de las diferentes imágenes del canal ajustando el porcentaje de tiempo de la luz y la exposición transmitida.
   NOTA: En este caso, NLR4.3 VIH-1 Gag-IGFP estaba excitada usando un láser de 491 nm con 50 ms de tiempo de exposición con 20% de láser (Figura 1i).
5. Retirar la cápsula de imágenes y añadir 1 ml de suspensión de SRBC en 7 x 10 ⁶ / ml a SRBC el plato (Figura 1).
6. Centrifugar a 500 xg durante2 min a TA para sincronizar la fagocitosis, registrar el tiempo al final de esta centrifugación y devolver el plato a la etapa.
7. Optimizar la GFP enfoque y la captura y las imágenes BF en Z-pilas (en todo el espesor de la celda con un paso a la distancia de 0,3 m - por lo general 20 aviones) cada minuto durante al menos 1 hr. Guardar el vídeo de lapso de tiempo en el formato de archivo nativo del sistema de imagen utilizado.
   NOTA: En este caso, las películas a intervalos fueron salvados en el formato nativo, archivos * .stk.

6. Análisis de las películas a intervalos

1. Para la edición de vídeo, haga clic en el menú desplegable "Aplicaciones" y en la ficha "Revisión multidimensional de datos" en el software de edición de vídeo.
   1. Para abrir el archivo, haga clic en "Seleccionar archivo de la base", luego en "Seleccionar directorio". En el "conjuntos de datos", seleccione la adquisición de analizar (en formato .nd) y haga clic en "Ver". Los datos se representan en una tabla con el tiempo en una columnad Z de planta en la línea.
   2. Representar a la infección en un Z-proyección (Figura 2, paneles de la izquierda), seleccione 491 nm de longitud de onda en el cuadro de "Las longitudes de onda" y haga clic en la pestaña "proyección Z" con "todos los planos".
   3. Para analizar una secuencia de tiempo, seleccione la longitud de onda de BF en el cuadro de "Las longitudes de onda" y seleccione el plano óptima en el eje Z para distinguir los eritrocitos de cordero externos (Figura 2, punta de flecha roja), SRBC internos (Figura 2, círculo rojo) y el núcleo ( La figura 2, círculo azul).
   4. Para guardar los montajes de vídeo, haga clic en la pestaña "Selección [X]" y después en "Load Image (s)". Por último, guardar las imágenes cargadas en formato tif y abrirlos al lado en el software ImageJ.
2. Utilizar el plugin "Tracking Manual" en el software ImageJ para medir la posición del núcleo y las diferentes fagosomas observados en el canal BF (Figura 3).
   1. Download el plugin "Manual de seguimiento" en la página web ImageJ. En ImageJ, abren el plugin y la secuencia de imágenes a analizar (figura 3, paso 1 y 2).
   2. Introduzca los ajustes tales como "Intervalo de tiempo", que representa la cantidad de tiempo entre tramas adyacentes, y la "x / y de calibración", que representa la distancia por píxel (figura 3, paso 3).
      NOTA: Aquí, guardar la secuencia de imágenes con un intervalo de tiempo de 1 min entre cada fotograma y x / y de calibración de 0,205 micras porque se utilizan el zoom 63X y una cámara con tamaño de píxel de 6,45 x 6,45 m ^2.
   3. Para iniciar el seguimiento, haga clic en "Añadir pista" (figura 3, paso 4) y hacer clic en un centro de SRBC en el primer momento en que se internaliza. La siguiente trama aparece automáticamente.
   4. Continúe haciendo clic en el centro de SRBC en todos los marcos que tienen diferentes posiciones durante el tiempo (figura 3, paso 6 en el cuadro rojo).
      1. Comenzará a realizar el seguimiento del núcleo que su posición en todos los marcos haciendo clic en su centro. Tema siguiente los fagosomas (haciendo clic en su centro), uno por uno en el momento (marco) de su internalización, diferentes en función de los eritrocitos de cordero. Para una mayor comodidad para ver SRBC en el canal BF, utilice la ventana de "Brillo y contraste" durante el seguimiento (figura 3, paso 5).
   5. Entre cada SRBC de seguimiento, haga clic en "Añadir pista" (figura 3, paso 4) para tener una nueva pista. El número de seguimiento será cambiado en la segunda columna, "Pista n °" de la tabla de resultados (figura 3, paso 6).
   6. Guardar los datos en una hoja de cálculo para continuar con el siguiente paso del análisis.
3. Utilice el software de hoja de cálculo para calcular la distancia recorrida de los fagosomas que contienen SRBCs hacia el núcleo y la velocidad de los fagosomas durante los primeros 5 minutos después de la internalización de los eritrocitos de cordero (Fifigura 4).
   1. Abra la tabla de hoja de cálculo y un nuevo archivo de hoja de cálculo. Transferencia en este nuevo archivo sólo los siguientes parámetros, el tiempo, la X e Y de coordenadas del núcleo y todos los SRBC (figura 4A).
   2. Para calcular la distancia entre SRBC y el núcleo con sólo sus coordenadas, considere el núcleo y un SRBC en un plano de coordenadas xy (Figura 4B).
      NOTA: La distancia entre dos puntos es la longitud de la trayectoria de conectarlos. En el plano, la distancia entre SRBC y el núcleo está dado por el teorema de Pitágoras.
      1. Si c (la distancia entre el núcleo y el SRBC) denota la longitud de la hipotenusa y a y b indican las longitudes de los otros dos lados, expresar el teorema de Pitágoras como la ecuación de Pitágoras:
         
         NOTA: Al mismo tiempo, en la ortonormal, la distancia horizontala es (x -x _{núcleo SRBC)} y la distancia vertical b es (y _núcleo -y _SRBC).
      2. Por lo tanto, calcular la distancia entre el núcleo y el SRBC (Figura 4A, caja púrpura) por:
         
         NOTA: Multiplicar el valor de la distancia obtenida (en píxeles) por x / y de calibración para tener la distancia en micras. Aquí, el x / y de calibración es 0,205 m.
      3. En cada tiempo, se resta la distancia entre el núcleo y el SRBC a la distancia inicial (Figura 4C).
      4. Trazar la medición en función del tiempo para los primeros 5 minutos. Aplique una línea de tendencia lineal (Figura 5A) a la trama y determinar la pendiente de la línea de tendencia lineal que representa la velocidad fagosoma hacia el núcleo durante los primeros 5 minutos después de la internalización SRBC.
      5. Cotejar los datos para calcular el error medio y estadístico delos valores de velocidad y representarlos en una forma apropiada con el software adecuado (Figura 5B).

Fagocitosis mediada por FcR hMDMs infectados por el VIH-1 y no infectados se describe aquí usando SRBCs opsonized-IgG como objetivos modelo (Figura 1). Los pasos críticos de este protocolo son la preparación de hMDMs y la infección con el VIH-1. De hecho, el rendimiento y la calidad de macrófagos diferenciados varía entre los donantes, así como la tasa de infección con eficiencias en el rango de 10-40%. Además, la preparación de IgG-opsonizado-SRBC también es importante para evitar daños en los eritrocitos, porque esto podría inducir su reconocimiento y captación como los desechos en lugar de por fagocitosis mediada por FcR. opsonización óptima se asegurará de fagocitosis eficaz.

movimiento fagosoma en vivir los macrófagos infectados por el VIH se analiza en tiempo real con el canal de BF en un microscopio confocal de disco giratorio en el laboratorio BSL-3. Los ajustes del canal BF son t críticoo ver el núcleo (Figura 2, círculo azul) y para discriminar el exterior (Figura 2, las puntas de flecha rojos) a partir de los SRBC internalizadas (figura 2, círculos rojos). La microscopía de BF se considera como la técnica de iluminación microscopía óptica simple suficiente para ver los fagosomas, que son menos refringente de los SRBC externos.

El primer paso después de la adquisición de secuencias de imágenes es el seguimiento manual del software ImageJ (Figura 3). Este punto puede ser particularmente largo y tedioso, ya que es preferible realizar un seguimiento de cada fagosoma, uno por uno para todas las secuencias de imágenes y se considera que los experimentos necesitan ser repetidas con al menos 3 donantes por condición para llegar a un tamaño de la muestra lo suficientemente grande para análisis estadístico (por lo menos 30 fagosomas con 3 donantes diferentes).

El segundo paso es el análisisen una hoja de cálculo para calcular la velocidad fagosoma durante los primeros 5 minutos después de la internalización por cada SRBCs internalizados (Figura 4). Para ello, se traza para cada fagosoma la distancia recorrida durante los primeros 5 minutos para el tiempo. Un ejemplo representativo se muestra en hMDMs no infectados en la figura 5A. Siguiente se obtiene la velocidad del fagosoma, que es la pendiente de la curva de regresión lineal. Se encontró una velocidad de 0,5384 m / min para este fagosoma.

Es de destacar que es posible analizar la velocidad fagosoma durante los primeros minutos después de la internalización, tal como se describe aquí o en Dumas et al. 8, o más tarde mediante el análisis de la velocidad en escalas de tiempo más largos. En nuestro estudio, se observó que la velocidad fagosoma durante los primeros 5 minutos después de la internalización en hMDMs infectados por el VIH es menor en comparación con hMDMs no infectadas (Figura 5B).

Figura 2. adquisición en tiempo real durantefagocitosis por el control representativo y hMDMs infectados por el VIH. hMDMs se preparan y se infectaron como se describe en la Figura 1. Se detectan las células NLR4.3 VIH-1Gag-IGFP infectadas con el láser de 491 nm. Z-pilas de disco giratorio confocal de imágenes se adquieren y se analizaron mediante el software de adquisición de microscopio y ImageJ (paneles de la izquierda). Galerías de imágenes BF representan un (paneles superiores correspondientes a la película 1) no infectadas y un NLR4.3 VIH-1Gag-IGFP infectados (paneles inferiores correspondientes a la película 2) celular durante una adquisición de 45 min (46 imágenes con el tiempo indicados como hh : mm). La membrana celular (línea de puntos negro), el núcleo (círculo azul), los eritrocitos de cordero externos (algunos de ellos indican con flechas rojas) y los eritrocitos de cordero internos (algunos de ellos indican con círculos rojos) son detectables en las imágenes BF. Bar = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Los pasos de manejo para el análisis de imágenes con el plugin Seguimiento manual en ImageJ. Después de abrir el plugin "Manual de Seguimiento" (1) y cargar el video de lapso de tiempo en el canal de BF (2), entran en los parámetros de la adquisición (3). Haga clic en "Añadir pista" (4) e inicie la medición del seguimiento haciendo clic en uno fagosoma (5) para obtener una nueva ventana con las posiciones X e Y del fagosoma elegido (6, caja roja). Para seguir el fagosoma en la secuencia de tiempo por conveniencia, variar el brillo y el contraste (5 '). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Los pasos de manejo para el análisis de datos de velocidad de migración fagosoma en el software de hoja de cálculo. (A) Montar la posición X e Y del núcleo y cada fagosoma (cuadro rojo) en una tabla de hoja de cálculo. En otra columna (caja púrpura), calcular la distancia entre el fagosoma y el núcleo con el teorema de Pitágoras, donde c representa la longitud entre el núcleo y la SRBC y a y b de las longitudes de los otros dos lados de un triángulo rectángulo ( B). (C) Finalmente, se calcula la distancia recorrida por los fagosomas en cada momento (caja verde) restando la distancia entre el SRBC y el núcleo en un momento dado de la distancia inicial en el momento 0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. La cuantificación de la velocidad de migración fagosoma en el control y hMDMs infectados por el VIH. (A) Para cada SRBC y justo después de la internalización SRBC, la distancia recorrida hacia el núcleo se mide y se representa frente al tiempo. Su velocidad durante los primeros 5 minutos se calcula mediante regresión lineal en el software de hoja de cálculo. Un experimento representativo se muestra (la SRBC interna de la figura 3-4). (B) Todas las velocidades durante los primeros 5 minutos se miden durante 66 fagosomas en (5) donantes no infectados y 60 fagosomas en las células infectadas por el VIH (4 donantes). Los datos representan la media ± SEM (t de Student no pareada con corrección de Welch; **, P <0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 2: movimiento Fagosoma en un macrófago infectado por el VIH representativa. (Haga clic derecho para descargar). VIH-1 (VIH-1 NLR4.3 Gag IGFP) infectados por macrófagos fueron identificados después de la iluminación con el láser 491. Se detectó el movimiento de las células rojas de la sangre en el canal opsonizadas BF durante 45min de la fagocitosis con una imagen por minuto (46 imágenes con el tiempo indicados como hh: mm). Bar = 10 micras.

Los autores no tienen nada que revelar.