Medida de In Vitro Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

Resumen

Este informe describe un ensayo in vitro para medir la actividad de integración asociada al complejo de preintegración (PIC) del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en los extractos citoplasmáticos de células infectadas agudamente. La integración del ADN del VIH-1 asociado a PIC en el ADN diana heterólogo se cuantifica mediante el uso de una estrategia de reacción en cadena de la polimerasa anidada en tiempo real.

Resumen

proteínas del VIH-1 del sobre se involucran receptores afines en la superficie de células diana, lo que conduce a la fusión de membranas de células viral seguido por la liberación del núcleo de la cápside viral (CA) en el citoplasma. Posteriormente, el viral transcriptasa inversa (RT), como parte de un complejo de nucleoproteína homónimo denomina la transcripción inversa Complex (RTC), convierte el genoma de ARN de una sola hebra viral en una copia de ADN de doble cadena (ADNv). Esto conduce a la biogénesis de otro complejo de nucleoproteína, llamado el complejo de pre-integración (PIC), compuesto por el vDNA y proteínas del virus asociados y los factores del huésped. La integrasa viral PIC-asociado (IN) orquesta la integración del ADNv en el ADN cromosómico del huésped en un proceso de dos pasos regulado temporal y espacialmente. En primer lugar, en los procesos de la los extremos 3 'de la ADNv en el citoplasma y, segundo, después de que el PIC trafica al núcleo, que media la integración del ADNv procesado en el ADN cromosómico. Los PIC aisladosde las células diana infectadas de forma aguda con VIH-1 son funcionales in vitro, ya que son competentes para integrar el ADNv asociado en un ADN diana heterólogo añadido exógenamente. Tal integración en ensayos in vitro basados en PIC han contribuido significativamente a delinear los detalles de la mecánica de la integración retroviral y para el descubrimiento de inhibidores de la IN. En este informe, se elabora sobre un ensayo de VIH-1 PIC actualizada que emplea una estrategia basada en anidada en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para medir la actividad de integración in vitro de los PIC nativas aisladas.

Introducción

VIH-1 de replicación en la célula diana implica varios pasos, en términos generales, agrupadas en dos fases: eventos tempranos y tardíos. Los primeros eventos comienzan cuando el VIH-1 secuencialmente une a la superficie de la célula diana receptor CD4 y uno de los dos co-receptores (CCR5 o CXCR4) ^1. En consecuencia, el fusible membranas virus-célula, y la cápside viral (CA) de núcleo se libera en el citoplasma ^2. El núcleo CA contiene el ARN viral genómico de cadena sencilla (ssRNA) y varias proteínas, tanto virales y celulares de origen. Las proteínas virales CA-asociados incluyen la transcriptasa inversa (RT) y la integrasa (IN), dos enzimas que median pasos críticos durante los primeros eventos en la replicación viral. El RT y EN la función en el contexto de complejos de nucleoproteína, a saber, la transcripción inversa Complex (RTC) y el complejo de pre-integración (PIC), respectivamente ^{3, 4, 5 , 6. Los extremos del genoma viral de ARN de cadena simple terminal del puerto de repetición (R) elementos adyacentes a la U5 secuencias únicas (en el extremo 5 ') y U3 (en el extremo 3'). El RTC convierte el genoma ARN de cadena simple viral en un (ds) de copias de ADN de doble cadena (ADNv). Este proceso de transcripción inversa también da lugar a la duplicación de las secuencias U5 y U3, generando así repeticiones terminales largas (LTR) en ambos extremos de la ADNv 7, 8. Posteriormente, el IN PIC-asociado cataliza dos reacciones bioquímicas secuenciales que permiten la integración de la ADNv en el cromosoma huésped 9, 10, 11. En primer lugar, en el citoplasma, IN multímeros participar ambas LTRs 12 y escindir un dinucleótido de cada uno de los extremos 3'-terminales. Este procesamiento extremo 3 'genera un grupo hidroxilo en cada extremo 3' (CA _OH) de la ADNv.A continuación, PIC trafica al núcleo, en el que en el ADNv utiliza CA _OH como nucleófilo para cortar ambas cadenas del ADN cromosómico de una manera escalonada. Simultáneamente, en empalmes coordinadamente ambos extremos del ADNv a los enlaces fosfodiéster resultantes en cadenas opuestas del ADN cromosómico. Después de esta etapa de transferencia de cadena, la maquinaria de la célula huésped elimina los dos nucleótidos no apareados en los extremos 5 'de la vDNA y reparaciones de las brechas de cadena sencilla consiguientes en la unión del sitio de integración. Así, los primeros eventos culminan con la creación de una copia de ADN integrado (provirus) del genoma del VIH-1. El provirus proporciona un entorno adecuado para la expresión génica viral eficiente, que inicia los eventos posteriores, incluyendo la expresión de las proteínas codificadas por el virus; ensamblaje del virus inmaduro; y en ciernes, la liberación y la maduración en viriones infecciosos 13.}

Retroviral recombinante purificada EN es competente parallevar a cabo, in vitro, tanto en las actividades de procesamiento y el capítulo de transferencia del extremo 3 'de ADN exógena suministrados sustrato LTR-similares. Los estudios bioquímicos utilizando dicha purificado en recombinante han puesto de manifiesto los aspectos críticos de la integración ADNv ^{14, 15, 16, 17.} Sin embargo, a diferencia de la infección natural, esta reacción bioquímica in vitro no es compatible con la integración concertada de ambos extremos del sustrato de ADN en el ADN objetivo. Por el contrario, PICs retrovirales aisladas de células infectadas de forma aguda se integran concertada ambos extremos de la ADNv endógeno en el ADN diana heterólogo. Esto condujo a la adopción generalizada y posteriores refinamientos de ensayos in vitro de Integración (IVI) E n el uso de los PIC nativas aisladas.

En la primera informado ensayo retroviral IVI, extractos citoplasmáticos de células infectadas con un recombinante murinoVirus de la leucemia (MLV) que alberga el gen E. coli supF en su LTR sirvió como la fuente de la actividad de IN, y el ADN de un fago lambda mutante defectuoso en el crecimiento lítico fue suministrado exógenamente como el ADN diana. La integración exitosa del ADN recombinante MLV copia en el ADN del fago y la consiguiente p F expresión condujo a la restauración de la capacidad formadora de placa de los fagos recombinantes. Sin embargo, esta estrategia experimental es laborioso y medidas de integración de una manera indirecta. Para hacer frente a estas advertencias, un ensayo de marcaje terminal indirecto basado en la transferencia de Southern, que cuantifica la actividad IVI PIC-asociado como una medida de la ADNv endógeno integrado en el ADN exógeno phiX174 bacteriófago linealizado, se desarrolló ^{6, 7, 18.} Aunque este método proporciona una medida directa de eventos de integración, se requieren cantidades relativamente altas de preparación PIC, que sigue siendo un desafío técnicoesfuerzo. Para evitar esto, ensayos basados en PCR anidados que requieren sólo cantidades modestas de PICs se desarrollaron ^{4, 5, 19.}

En este informe se describe una versión actualizada de una PCR anidada-basado en el método in vitro ideado para recapitular la actividad de integración mediada PIC VIH-1 se produce durante la infección natural. Este método utiliza los extractos citoplasmáticos de las células diana infectadas por VIH-1 como fuente de actividad endógena PIC, que se mide con un tiempo real de la polimerasa cuantitativa reacción en cadena (qPCR). Los procedimientos para el aislamiento de los PIC y la medición de sus actividades de integración se adaptan, con modificaciones, a partir de los protocolos publicados por el laboratorio Engelman ^20. En este método, la actividad de integración PIC-asociado se inicia proporcionando una diana de ADN exógeno lineal ^21, y los productos de ADN resultantes deesta reacción integración se purifican y se utiliza como material de partida para la cuantificación basada en la PCR subsiguiente. En la primera ronda de PCR convencional, las uniones de ADN viral diana se amplifican mediante el uso de cebadores apropiados. En la segunda ronda qPCR, cebadores LTR-específicos se utilizan para enriquecer específicamente a la población a partir de los vDNA primera ronda productos de PCR. Por favor, vea la sección de protocolo para una descripción detallada de este método.

Los estudios in vitro con PICs retrovirales han dado lugar a avances significativos en nuestra comprensión del mecanismo de integración del ADN retroviral y en el desarrollo de inhibidores de la IN. Sobre la base de la reciente mayor enfoque en la cartografía del VIH-1 sitios de integración, la determinación del papel de los factores virales y del huésped en el VIH-1 la integración y desarrollo de nuevos fármacos antivirales para combatir la resistencia a los medicamentos, prevemos un aumento del interés y el uso generalizado de los ensayos de IVI , como el descrito en este informe. Esto, a su vez, dará lugar afuturas mejoras en el método, diversificando de esta manera el alcance de sus aplicaciones.

Protocolo

1. Virus de Producción

NOTA: Para generar altos títulos de VIH-1 infeccioso, transfectar la línea celular de riñón embrionario humano (HEK) 293T con un clon molecular infeccioso de VIH-1 usando un reactivo de transfección a base de dendrímero activado. Se ha observado que el método de fosfato de calcio transfección produce resultados comparables.

1. En un laboratorio de bioseguridad de nivel 2 (BSL2), semilla de 3 x 10 ⁶ 293T células por placa de 10 cm en 8 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), penicilina, y estreptomicina. Cultivar las células en un incubador a 37 ° C y 5% de CO ₂ O / N.
2. El día siguiente, para la transfección de células en cada placa de 10 cm, diluir 8 g de plásmido ADN pNL4-3 (ver Tabla de Materiales) a un volumen final de 300 l de DMEM carente de suero y antibióticos. Añadir 80 l de la reactivo de transfección, mezclar bien pipeteando, y se incuba a TA durante5-10 min para la formación de complejos de transfección.
3. Retire el medio de las placas por aspiración y 7 ml por placa de DMEM fresco que contenía suero y antibióticos.
4. Añadir 1 ml de DMEM que contenía suero y antibióticos para el complejo de transfección, mezclar con la pipeta, y añadir esta mezcla a las células. Hacer girar suavemente el plato para facilitar la distribución uniforme de los complejos de transfección.
5. Inmediatamente transferir las células al laboratorio BSL3, lugar en un incubador a 37 ° C y 5% de CO _2, y cultivar las células durante 48 h.
6. Recoger el sobrenadante de cultivo de tejidos que contiene el virus con una pipeta y luego transferirlo a un tubo de centrífuga. Se centrifuga a 300 g durante 5 min para sedimentar las células y los residuos, y después se filtra el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras de tamaño de poro.
7. Para eliminar cualquier ADN plásmido remanente en esta preparación de virus libre de células, el tratamiento con DNasa 1 (20 mg / ml) a 37 ° C durante 1 h.
8. Para cuantificar laVIH-1 título, utilice el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas p24-específico (ELISA), ya que es un método rápido y susceptible para el uso rutinario ^22.
   NOTA: Se debe señalar que la p24 ELISA mide el título físico (número de partículas de virus). Como alternativa, la medición de la actividad asociada al virus RT (RT ensayo exógena) o la infectividad del virus (ensayos de infectividad basados ​​en la línea celular indicadora TZM-bl) proporcionará lectura exclusiva de partículas virales infecciosas.

2. infección por el virus de las células Sup-T1 (NBS3 Lab)

1. En un laboratorio BSL2, mantener las células Sup-T1 entre 1,0 x 10 ⁶ y 2,0 x 10 ⁶ células / ml en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complementado con 10% FBS inactivado por calor, penicilina y estreptomicina (relación de división de 1 : 2 cada 2 - 3 d). Se combinan las células Sup-T1 a partir de los frascos de cultivo, mezclar bien con la pipeta, y determinar el recuento de células viables utilizando un hemocitómetro y la exclusión de azul de tripano staining método.
   1. Prepare el número necesario de alícuotas de 80 x 10 ⁶ células (por infección por el virus) en 50 ml tubos cónicos de centrífuga.
   2. Centrifugar las células en un rotor oscilante-cubo en 500 xg y 25 ° C durante 5 min. Sin retirar el medio de cultivo celular, la transferencia de los tubos que contienen células sedimentadas al laboratorio BSL3 para su posterior procesamiento. aspirar cuidadosamente el medio de cultivo celular a partir de tubo sin alterar el sedimento celular.
2. Añadir una cantidad apropiada de inóculo de virus tratado con DNasa I a las células en el tubo y mezclar bien pipeteando suavemente. Durante 80 x 10 ⁶ células, utilizar 30 ml de virus tratado con DNasa I (50 g de virus de la p24-equivalente).
   NOTA: El aislamiento de PICs funcional requiere la infección de las células diana con muy altas multiplicidades de infección (MOI).
3. Distribuir la mezcla en partes iguales entre dos placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (es decir, 12 x alícuotas de 2.5 mL, el uso de 2 planchas por Infection).
4. Para espinoculación, colocar las placas de cultivo en portadores de placas y de centrífuga usando un rotor de cubeta oscilante a 480 xg y 25 ° C durante 2 h.
5. Se incuban las células spinoculated a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 5 h.

3. La recolección y lisis de las células infectadas (laboratorio NBS3)

1. Reunir las células correspondientes a cada infección de las placas de cultivo en un tubo de 50 ml de centrífuga cónico (~ 30 ml en total).
2. Recoger las células por centrifugación a 300 xg y 25 ° C durante 10 min. aspirar cuidadosamente el sobrenadante del tubo (alternativamente, utilizar una pipeta).
3. Para eliminar las partículas virales residuales, lavar cada sedimento celular mediante la adición de 2 ml de tampón de K ^{- / -} (KCl 150 mM, HEPES 20 mM, pH 7,6, 5 mM MgCl ₂₎ y centrifugando la muestra a 300 xg y 25 ° C durante 10 minutos. Entonces, sin alterar el sedimento, retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración o mediante el uso de una pipeta.
4. REPEAt paso 3.3.
5. Con cuidado, retire cualquier tampón residual mediante el uso de una micropipeta. Resuspender cada sedimento de células en 2 ml de helado de tampón de lisis K ^{+ / +} (tampón K ^- / ^- suplementado con 0,025% de digitonina, DTT 1 mM, 20 mg / ml de aprotinina), mezclar el contenido por pipeteo suave, y la transfiere a una 2 ml tubo de microcentrífuga.

4. Preparación de los PIC citoplasmáticos (laboratorio NBS3)

1. Roca las muestras en un agitador rotatorio a TA durante 10 min.
2. Centrifugar las muestras, con el rotor enfriado previamente a 4 ° C, a 1500 xg y 4 ° C durante 4 min.
3. Sin perturbar el sedimento, transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo y se centrifuga a 16.000 xg y 4 ° C durante 1 min.
4. transferir con cuidado el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo. Añadir RNasa A (20 mg / ml) a una concentración final de 20 mg / ml (2 l durante 2 ml de PICs) y se incuba el contenido a temperatura ambiente durante 30 min (sin balanceo).
5. Añadir sacarosa (60% w / v en tampón K ^{- / -)} a una concentración final de 7% y mezclar bien pipeteando suavemente. Preparar alícuotas (por ejemplo, 200 l) de los PICs en tubos de microcentrífuga, flash-congelación en nitrógeno líquido, y colocar en un congelador -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.

5. Integración In Vitro (IVI) ensayos que utilizan VIH-1 PICs

1. Preparar el ADN diana usado en el ensayo IVI mediante la amplificación de una región de 2,0 kb a partir del plásmido de ADN phiX174 con PCR usando los cebadores a medida, phiX174-F y phiX174-R.
   1. Montar la mezcla de PCR como se describe en la Tabla 1. Realizar PCR en un ciclador térmico usando las condiciones de ciclos térmicos recomendados en la Tabla 2. Gel-purificar el producto de la PCR usando un kit de purificación en gel (siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante), y almacenar el ADN diana purificada como alícuotas a -80 ° C hasta su uso.
2. Añadir 600 ng de ADN diana de 200 - & #181; L alícuota de los PIC, se mezcla bien y se incuba a 37 ° C durante 45 minutos.
   Nota: Las reacciones IVI omitiendo ADN diana o incluyendo un inhibidor de la integrasa (por ejemplo, raltegravir) se recomiendan las reacciones de control.
3. Detener la reacción mediante la adición de IVI SDS, EDTA y proteinasa K a concentraciones finales de 0,5%, 8 mM, y 0,5 mg / ml, respectivamente. Mezclar los contenidos de la reacción a fondo y incubar durante la noche a 56 ° C.
4. El día siguiente, purificar el ADN total de la reacción IVI mediante extracción con fenol / cloroformo y precipitación con etanol. Llevar a cabo todas las etapas de centrifugación a 16.000 xg y RT.
5. Añadir un volumen igual de fenol a la muestra desproteinizado, mezclar vigorosamente por agitación, y se centrifuga durante 2 min. Retire cuidadosamente la fase acuosa superior y la transfiere a un tubo nuevo.
6. Repita el paso 5.5. Transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
7. Añadir un volumen igual de 1: 1 de fenol: cloroformo mezcla, mezclar enérgicamente con el vórtex y centrifugar for 2 min. Transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
8. Añadir un volumen igual de cloroformo, la mezcla vigorosamente por agitación, y se centrifuga durante 2 min. Transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
9. Para precipitar el ADN, añadir glucógeno a una concentración final de 0,1 g / l, 3 M de acetato de sodio a una concentración final de 0,3 M, y 2,5 volúmenes de etanol al 100% (enfriado en hielo). Mezclar en vórtex, centrifugar brevemente para recoger el contenido, y colocar el tubo a -80 ° CO / N.
10. Al día siguiente, centrifugar la muestra durante 30 min a 16.000 xg y 4 ° C durante 30 min. Retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
11. Añadir 500 l de etanol al 80% (enfriado en hielo) al sedimento y se centrifuga a 16.000 xg y 4 ° C durante 10 min. El aire seco de la pastilla de ADN a temperatura ambiente y completamente volver a suspender en 50 l de agua libre de nucleasa. Almacenar las muestras de ADN a -20 ° C.

6. Las pruebas de PCR para cuantificar la actividad de CFP

NOTA: El número de copias de VIH-1 de ADN integrado en el ADN diana se cuantifica mediante una estrategia de PCR anidada que emplea 2 juegos de cebadores y 2 rondas secuenciales de PCR.

1. Realizar la primera ronda de PCR convencional utilizando cebadores dirigidos a la LTR viral y el ADN phiX174 (LTR y PhiX174 cebadores, respectivamente) para amplificar las uniones del VIH-1 de ADN integrado.
   1. Montar la mezcla de PCR de primera ronda como se describe en la Tabla 3. Montar una mezcla maestra de todos los componentes excluyendo el ADN molde, dispensar alícuotas de 45 mu l en tubos de PCR separadas, y añadir 5 l de ADN plantilla o agua libre de nucleasa (control).
   2. Realizar PCR en un ciclador térmico usando las condiciones de ciclos térmicos recomendados en la Tabla 4.
2. Realice la qPCR segunda ronda usando cebadores que flanquean una región corta de la LTR viral (LTR-R y cebadores LTR-U) para amplificar selectivamente las secuencias vDNA integrados de la primera rodadaproductos und PCR. Para determinar los ADNv integrados número de copias, generar una curva estándar mediante el uso de 10x diluciones seriadas de número de copias conocidos (por ejemplo, 10 ⁰ - 10 ⁸⁾ del clon molecular del VIH-1.
   1. Montar la mezcla de segunda ronda qPCR como se describe en la Tabla 5. Montar una mezcla maestra de todos los componentes excluyendo el ADN molde, cuidadosamente dispensar 25 alícuotas en el número apropiado de pozos en un pozo de 96 placa de reacción de PCR, y luego añadir 5 l de la no purificado de primera ronda de los productos de PCR o agua libre de nucleasa (controlar). Llevar a cabo todas las reacciones de qPCR por triplicado.
   2. Cargar la placa de PCR en tiempo real instrumento de PCR y qPCR realizar utilizando las condiciones de los ciclos recomendados en la Tabla 6.
   3. Analizar los datos utilizando un software adecuado.

Resultados

Aislamiento de VIH-1 PICs

Un esquema del protocolo utilizado para el aislamiento de VIH-1 fotografías de células Sup-T1 infectadas de forma aguda se representa en la Figura 1. Este protocolo se deriva de los métodos descritos por Engelman et al. ^{19, 20.} VIH-1 PICs son complejos de nucleoproteína que se ensamblan en las células...

Discusión

Los análisis bioquímicos de los PIC retrovirales han proporcionado ideas fundamentales sobre el mecanismo de integración del ADN retroviral. Medición de la actividad de integración de PICs retrovirales se puede lograr mediante ensayo en placa formación, análisis de transferencia Southern, y anidada qPCR. La estrategia experimental de ensayo de placas es laborioso y utiliza un método indirecto para medir la integración ^{6, 7, 18.}...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suero fetal bovino (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Suero fetal bovino inactivado por calor (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio 1640	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1x)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Tripsina-EDTA (0,25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Solución de penicilina-estreptomicina (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
células HEK293T (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
clon molecular proviral del VIH-1 pNL4-3	Programa de Reactivos de Investigación y Referencia del SIDA de los NIH	114
Reactivo de transfección PolyFect	Qiagen	301107
DNasa 1	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Sup-T1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2 - 7.5 < p>(solución lista para usar)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Solución de cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich<	p>60142
2	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinina	Sigma-Aldrich <8/p>	A6106
Digitonina	Sigma-Aldrich	D141
RNasa A	Invitrogen	12091-021
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Forma replicativa 1 ADN	Promega	D1531
PhiX174-F imprimación: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R cebador: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3'	Invitrogen y/o IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick kit de extracción de gel	Qiagen	28706
Agua destilada ultrapura	Invitrogen	10977-015
tampón Tris-EDTA (TE) (100x)	Sigma-Aldrich	T9285
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ácido etilendiaminotetraacético, solución de sal disódica (EDTA), 0,5 M, pH 8,0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinasa K (20 mg/ml solución lista para usar)	Qiagen	19131
Fenol (equilibrado con 10  mM Tris HCl, pH  8.0 y 1  mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Cloroformo	Sigma-Aldrich	288306
Glucógeno (solución de 5 mg/mL)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Acetato de sodio (3 M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	S7899
etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Primera ronda LTR primer: 5'-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3' Primera ronda phiX174 primer: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3'	Invitrogen y/o IDT-DNA	---
Segunda ronda LTR-R primer: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' Segunda ronda LTR-U cebador: 5'-CTGACTAAAAAGGGTCTGAGG-3' Segunda ronda de la sonda Taqman:   5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3'	Invitrogen y/o IDT-DNA	---
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862