La esporulación eficiente de Saccharomyces cerevisiae En un formato de 96 multipocillos

Resumen

Aquí, la esporulación de Saccharomyces cerevisiae se lleva a cabo en un formato de 96 pocillos múltiples.

Resumen

Durante épocas de estrés nutricional, Saccharomyces cerevisiae sufre gametogénesis, conocida como esporulación. Las células de levadura diploides que están hambrientas de nitrógeno y carbono iniciarán el proceso de esporulación. El proceso de esporulación incluye meiosis seguida de formación de esporas, donde los núcleos haploides se empaquetan en esporas resistentes al medio ambiente. Hemos desarrollado métodos para la esporulación eficiente de levadura en gemación en 96 placas de pocillos múltiples, para aumentar el rendimiento de las células de levadura de cribado para fenotipos de esporulación. Estos métodos son compatibles con el cribado con plásmidos que contienen levaduras que requieren selección nutricional, cuando se utilizan medios mínimos adecuados, o con el cribado de levaduras con alteraciones genómicas, cuando se utiliza un régimen de preporulación rico. Encontramos que para este método, la aireación durante la esporulación es crítica para la formación de esporas, y hemos ideado técnicas para asegurar una aireación suficiente que sean compatibles con el formato de placa multipocillo 96. Aunque estos métodos no logran el nivel típico de esporulación de ~ 80% que se puede lograr en experimentos basados en matraces de gran volumen, estos métodos lograrán de manera confiable un nivel de esporulación de alrededor del 50-60% en placas de pocillos múltiples de pequeño volumen.

Introducción

La esporulación en la levadura en ciernes ha sido estudiado para proporcionar información sobre muchos aspectos de la biología, incluyendo el control de la segregación de cromosomas durante la meiosis ^1, los mecanismos de recombinación genética ^2, el control del desarrollo de células de señalización ^3, control nutricional de desarrollo ^4, la transcripción regulación del desarrollo ^5, y el examen de la formación de esporas ^6. La formación de esporas incluye una novela caso la división celular que implica la formación de nuevos compartimentos de membrana dentro de la célula madre seguido de la deposición de una pared de la espora de protección ^6. Estos estudios que examinan células esporuladas a menudo se aprovechan de la cepa de levadura rápida esporulación SK1, que puede someterse al proceso de esporulación en aproximadamente 24 hr de una manera relativamente eficiente ^7,8. Aunque optimización de las condiciones de esporulación de levadura en ciernes se han descrito ^9-13, estos experimentoss examinó la esporulación en medios sólidos o en cultivos líquidos de mayor escala, donde la esporulación se lleva a cabo utilizando tubos de cultivo o frascos.

Aquí se describe un método para la esporulación de levadura en un formato de placa de múltiples pocillos 96. Encontramos que para este método, la aireación es crítica para la esporulación síncrono y eficiente, y hemos ideado técnicas para asegurar la suficiente esporulación un formato de múltiples pocillos de pequeño volumen. Esporulación en un formato de 96 placa de múltiples pocillos permite para las células para ser examinadas usando técnicas de alto rendimiento optimizados y reactivos para un formato de placa de múltiples pocillos, como la detección de altos supresores de copias deseado con una biblioteca de azulejos ^14-16.

Protocolo

1. Preparación para la esporulación

Nota:. Los medios descritos en este protocolo se realizan utilizando las recetas y los métodos estándar ^13,17 La tabla 1 muestra la formulación de 1 l de los diferentes medios utilizados en este protocolo.

	Bacto peptona	Extracto de levadura	Bacto Agar	Dextrosa	Acetato de potasio	Glicerol	ddH2O
placas YPG	20 g	10 g	20 g	-	-	30 ml	970 ml
placas de YPD	20 g	10 g	20 g	20 g	-	-	1.000 ml
líquido YPD	20 g	10 g	-	20 g	-	-	1.000 ml
líquido YPA	20 g	10 g	-	-	20 g	-	1.000 ml
medios de esporulación	-	-	-	-	10 g	-	1.000 ml

Tabla 1:. Formulaciones de medios montos son dados con 1 l de medio. Específicamente acerca de los mediosingredientes se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.

1. Si todas las células en esporulación será el mismo genotipo, siga este procedimiento:
   1. Descongelar la cepa de levadura que se utiliza en una placa de YPG (YPGlycerol). Crecer la levadura de 12-16 horas a 30 ° C. Es importante destacar que también están preparados células SK1 esporular, por lo cepas SK1 no se deben dejar demasiado tiempo en placas YPG, o pueden esporular en el plato.
      Nota: Se prefiere una cepa recientemente descongelado crecido en YPG, como la utilización de glicerol como fuente de carbono requiere la fosforilación oxidativa, y por lo tanto selecciona para células que tienen ADN mitocondrial funcional. células SK1 tienen una tendencia a perder el ADN mitocondrial funcional y convertirse petites. se necesita ADN mitocondrial funcional para la esporulación.
   2. levadura consecutivas de la placa YPG sobre una placa de YPD (YPDextrose) para colonias individuales. Crecer la levadura en la placa YPD 24-28 horas a 30 ° C.
   3. Después de alrededor de 36-48 h de crecimiento en YPD medios sólidos, iniciar un cultivo de 25 ml de YPD utilizando una sola coloniade la placa de YPD. Crecer este cultivo hasta que las células son aproximadamente _DO600 = 4,0 a 7,0. Realice este paso a 30 ° C durante la noche en una incubadora con agitación, agitando a 220 rpm.
   4. A partir del cultivo YPD, utilice una cantidad adecuada de células para iniciar 1.000 ml de YPA cultivo (YPAcetate) que es OD ₆₀₀ = 0,1 para cada necesidad placa de 96 pocillos en la Sección 2. crecer la levadura en una incubadora de agitación 30 ° C (con agitación a 220 rpm) hasta que el cultivo OD ₆₀₀ es entre 1,3 a 1,5.
      Nota: inocular 100 ml de cultivo YPA para cada placa de múltiples pocillos 96 que se proyectarán en la Sección 2. Por ejemplo, si el examen de cuatro placas de múltiples pocillos 96, serán necesarios 400 ml de cultivo YPA. A partir de 10% volumen extra en la cultura YPA es necesaria para proteger contra la pérdida de volumen por evaporación. Por lo general, se tardará entre 12-16 horas para que las células alcanzan la densidad óptica apropiada _600; la cantidad de tiempo puede variar dependiendo del genotipo de la cepa de levadura. YPA es los medios de comunicación presporulation. Pregrowthen acetato de ayuda a inducir la expresión de genes (como IME1) necesarios para la esporulación eficiente y síncrono ^6.
   5. Centrifugado a 1.800 xg en una centrífuga de mesa durante 5 minutos para sedimentar las células cultivadas en YPA. Lavar las células 1 vez con 0,5 volúmenes de agua desionizada estéril tratada en autoclave. Girar de nuevo, y desechar lavar. Resuspender las células en medios volumen esporulación 1x. Continúe con la Sección 2.
2. Si el uso de células de esporulación que son de diferentes genotipos, (es decir, transformadas con plásmidos diferentes o que contienen diferentes mutaciones, normalmente obtenidos y almacenados como reservas congeladas), células de agrupación de los diferentes genotipos en un formato de múltiples pocillos 96. A continuación, siga este procedimiento:
   1. Use un frogger 96 puntas estériles para transferir las células procedentes de las existencias congeladas descongeladas en placas de 96 pocillos (s) de múltiples pocillos en medios sólidos YPG. Crecer durante la noche de levadura a 30 ° C.
   2. El uso de un frogger 96 prong estéril, la transferencia de células de YPG medios sólidos en medios sólidos YPD o selectivamedios sólidos (es decir, medios mínimos sintéticos carece de los aminoácidos, si las células contienen plásmidos que requieren la selección). Crecer levadura a 30 ° C hasta que las colonias se forman para cada cepa, típicamente 1 día en YPD y 2 días si los medios de comunicación selectiva es necesario.
   3. Alícuota de 1,2 ml de medio líquido YPD o medios líquidos selectivos en cada pocillo de una placa de múltiples pocillos de 96 profundas 2 ml. La transferencia de células a partir de medios sólidos en medios líquidos utilizando un frogger, cubrir con una tapa de plástico en su lugar por cinta, y crecen durante la noche a 30 ° C agitador, agitación a 220 rpm.
      Nota: Para minimizar la contaminación, placas de cubierta utilizando las tapas de plástico de una placa de Petri rectangular. Mantenga las tapas en su lugar con un trozo de cinta, por lo que la circulación de aire está restringido mínimamente.
   4. placas de centrifugar a 1800 xg durante 5 min, utilizando una cubeta oscilante centrífuga con adaptadores para acomodar placas de 96 pocillos. Retirar los medios de comunicación de las células; añadir 500 YPA l a cada pocillo y resuspender las células sedimentadas en el YPA. Cubrircon tapa de plástico en su lugar por cinta.
   5. Se cultivan las células durante 15 horas a 30 ° C en una incubadora con agitación, agitando a 220 rpm. Continúe con la Sección 2.

2. Las células esporuladas en un formato de 96 multipocillos

1. Añadir o bien un talón sólida estéril 3 mm de vidrio o una estériles 5 mm x 2 mm barra de agitación magnética en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con 1,3 ml pozos. (Ver resultados representativos de abajo para una discusión sobre la conveniencia de utilizar un cordón o una barra de agitación.)
2. Si todas las células que se proyectarán son del mismo genotipo, ir a 2.2.1. Si las células que se proyectarán son de diferentes genotipos, ir a 2.2.2.
   1. Tomar células de la etapa 1.1.5 y alícuota de 500 l de células más medios de comunicación en cada pocillo de la placa de múltiples pocillos 96. Cubra con una tapa de plástico en su lugar por cinta. Proceder a 2,3.
   2. Centrifugar las células que se encuentran en YPA de 1.2.4 a 1800 xg durante 5 min, utilizando una cubeta oscilante centrífuga con adaptadores para acomodar placas de 96 pocillos. verter def medios de las células. Añadir 500 l de medios de esporulación a cada pocillo y resuspender las células sedimentadas en los medios de esporulación. Cubra con una tapa de plástico en su lugar por cinta. Proceder a 2,3.
3. Si se utiliza una cuenta de vidrio, colocar las muestras en una incubadora de agitación a 30 ° C y agitar a 220 rpm durante la esporulación. Si se utiliza una barra de agitación magnética, colocar las muestras en una placa de agitación en el interior de una incubadora a 30 ° para la esporulación.
   Nota: La velocidad de agitación exacto para las barras de agitación magnéticas no es muy importante, siempre y cuando todas las barras se mueven con energía y la cultura se airea.
4. Para controlar la progresión a través de la esporulación, retirar muestras de la cultura de esporulación para la visualización, Añadir 6 l de células de los cultivos a las 24 esporulación l de medios de esporulación en una placa de 96 pocillos cubreobjetos (dilución 1: 5). Deja células que conformarse con 5 min antes de examinar las células usando un microscopio invertido.
   Nota: En las células de tipo salvaje SK1, esporas maduras compactos formarán un 36 horas después de la transferencia al medio de esporulación. La progresión a través de esporulación puede ser monitoreada por microscopía utilizando marcadores fluorescentes, tales como un marcador nuclear (es decir, HTB2-mCherry ¹⁸⁾ para examinar la división meiótica o un marcador de membrana prospore (es decir, G20 ¹⁹⁾ para examinar la morfogénesis de esporas. Alternativamente, la formación de esporas refráctiles se puede ver usando microscopía de Nomarski DIC a partir de 12 h después de la transferencia al medio de esporulación.

Resultados

Para evaluar este protocolo, las eficiencias de esporulación obtenidos de esporulación las células en placas de pocillos múltiples (como se describió anteriormente) se compararon a las células esporulados utilizando volúmenes más grandes en matraces (Tabla 2). El uso de placas de múltiples pocillos no alcanzó la alta eficiencia se ve cuando esporulación en frascos, donde la eficiencia ~ 80% se puede ver de forma rutinaria. Esporulación en placas de pocillos múltiples con...

Discusión

Aquí se presenta un protocolo para la esporulación de levadura SK1 en un formato de múltiples pocillos 96. La aireación es clave para la esporulación eficiente, que requiere el uso de cualquiera de una barra de agitación o una perla de vidrio en cada pocillo. Cuando las células son esporulados en una placa de múltiples pocillos 96 en una incubadora de agitación sin ya sea un cordón o una barra de agitación, las células no esporulan eficiente. Sólo un pequeño aumento en la eficiencia de la esporulación se ve cuando se es...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nunc 1,3 ml Placas	DeepWell ThermoScientific 260251		Utilizado para la esporulación
Nunc 2,0 ml Placas DeepWell	ThermoScientific	278743	Se utiliza para el crecimiento de la presporulación, paso 1.2.3
Perla de vidrio de 3 mm	Fisher	11-312A	Utilizada para la esporulación
Barra agitadora de 5 mm x 2 mm, paquete de 12	Fisher	14-511-82	Utilizado para la esporulación
96 pozo frogger	V& P Scientific	VP407	necesario para la
copiadora de biblioteca	V& P Scientific	VP381	necesario para el paso 1.2; para ser utilizado con la
placa de Petri rectangular	Frogger ThermoScientific	264728	necesario para el paso 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	necesarios para los medios
Extracto de levadura	BD	212750	necesario para los medios
Bacto Agar	BD	212750	necesarios para los medios
Dextrosa	Fisher	D16-3	necesario para los medios
Acetato de potasio	Fisher	P171-500	necesario para los medios
Glicerol	Fisher	G33-500	necesario para los medios
Placa inferior de vidrio negra de 96 pocillos	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	necesaria para el paso 2.4