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DOI:

10.3791/54592

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8 de diciembre de 2016

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1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un modelo murino in vitro de la barrera hematoencefálica que hace uso de la espectroscopia de células de impedancia, con un enfoque en las consecuencias sobre la integridad y permeabilidad de las células endoteliales al interactuar con las células T activadas.

Resumen

La ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB) es un paso crítico en el desarrollo de enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple (EM) y su modelo animal, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Este proceso se caracteriza por la transmigración de las células T activadas a través de las células endoteliales cerebrales (CE), los principales constituyentes de la BHE. Sin embargo, las consecuencias sobre la función cerebral de la CE tras la interacción con dichas células T son en gran medida desconocidas. Aquí describimos un ensayo que permite evaluar la función de la EC microvascular primaria del cerebro de ratón (MBMEC) y la integridad de la barrera durante la interacción con las células T a lo largo del tiempo. El ensayo hace uso de la espectroscopia celular de impedancia, una poderosa herramienta para estudiar la integridad y permeabilidad de la monocapa EC, mediante la medición de cambios en la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y la capacitancia de la capa celular (Ccl). En contacto directo con las CE, las células T estimuladas pero no ingenuas son capaces de inducir la disfunción monocapa de las CE, como se visualiza por una disminución de la TEER y un aumento de la Ccl. El ensayo registra los cambios en la integridad de la monocapa EC de forma continua y automatizada. Es lo suficientemente sensible como para distinguir entre diferentes intensidades de estímulos y niveles de activación de células T, y permite investigar las consecuencias de una modulación dirigida de la interacción entre las células T y la CE utilizando una amplia gama de sustancias como anticuerpos, reactivos farmacológicos y citocinas. La técnica también se puede utilizar como control de calidad para la integridad de la CE en ensayos de transmigración de células T in vitro. Estas aplicaciones lo convierten en una herramienta versátil para estudiar las propiedades de la BHE en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas.

Introducción

La barrera sangre-cerebro separa la circulación sistémica desde el sistema nervioso central (CNS) 1-3. Proporciona una barrera física que impide la libre circulación de las células y la difusión de las moléculas solubles en agua y protege al cerebro de los agentes patógenos y sustancias potencialmente dañinas. Además de su función de barrera, la acreditación permite la entrega de oxígeno y nutrientes a la parénquima cerebral, lo que garantiza el correcto funcionamiento del tejido neuronal. Propiedades funcionales de la BHE son altamente reguladas por sus componentes celulares y acelulares, con muy especializado EC siendo su principal elemento estructural. ECs de la BBB se caracterizan por la presencia de uniones estrechas (TJ) complejos, la falta de fenestraciones, extremadamente baja actividad de pinocitosis, y los mecanismos de transporte permanentemente activos. Otros componentes de la acreditación de la membrana basal CE, pericitos incrustar el endotelio, pies terminales astrocíticos y = par asociadoenchymal membrana basal también contribuir al desarrollo, el mantenimiento y la función de la BBB 2,4 - 6 y, junto con las neuronas y la microglia, forman la unidad neurovascular (NVU), que permite buen funcionamiento del CNS 7-9.

En una variedad de enfermedades neurológicas, tales como enfermedades neurodegenerativas, inflamatorias o infecciosas, la función de la BBB se ve comprometida 2,5,10. La desregulación de TJ complejos y mecanismos de transporte molecular conduce a una mayor permeabilidad de la BHE, la extravasación de leucocitos, la inflamación y el daño neuronal. Con el fin de estudiar BBB propiedades bajo tales condiciones fisiopatológicas, varios modelos de BBB in vitro han establecido 9,11,12. Juntos han proporcionado información valiosa sobre los cambios de la integridad de la barrera, permeabilidad, así como mecanismos de transporte. Estos modelos emplean células endoteliales de los humanos, de ratón, rata, porcino o b13 de origen ovino - 18; células endoteliales primarias o líneas de células son cultivadas, ya sea como un monocultivo o junto con los pericitos y / o los astrocitos en el fin de imitar más de cerca la BBB in vivo 19-25. En los últimos años, la medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) se ha convertido en una herramienta ampliamente aceptada para evaluar las propiedades de barrera endotelial 26,27.

TEER refleja la impedancia al flujo de iones a través de la monocapa celular y su disminución proporciona una medida sensible de la integridad de la barrera endotelial en peligro y, por consiguiente aumento de la permeabilidad. Varios sistemas de medida de TEER se han desarrollado, incluyendo epitelial Voltohmmeter (Evom), eléctrica de la célula-sustrato Impedance Sensing (IEM), y el análisis de células en tiempo real 15,28 - 30. TEER refleja la resistencia al flujo de iones entre ECs adyacentes (ruta paracelular) y es directamente proporcional a laintegridad de la barrera. En espectroscopía de impedancia 27,31, se mide la impedancia total del complejo (Z), que proporciona información adicional acerca de la integridad de la barrera midiendo CCL. Ccl se refiere a la corriente capacitiva a través de la membrana celular (ruta transcelular): la capa de células actúa como un condensador en el circuito eléctrico equivalente, la separación de las cargas en ambos lados de la membrana y es inversamente proporcional a la integridad de la barrera. Cuando se cultiva en insertos permeables, EC se adhieren, proliferan y se extiende sobre la membrana microporosa. Esto se opone a la corriente capacitiva de fondo del inserto (que a su vez actúa como un condensador) y conduce a una disminución de la capacitancia hasta que alcanza su nivel mínimo. Esto es seguido por el establecimiento de TJ complejos que sellar el espacio entre ECs adyacentes. Esto restringe el flujo de iones a través de la ruta paracelular, y TEER aumenta hasta que alcanza su meseta. Bajo condiciones inflamatorias, sin embargo, el endothelial barrera se ve comprometida: TEER disminuye como complejos de conseguir interrumpido TJ y Ccl aumenta a medida que el componente capacitivo de la pieza de inserción se eleva de nuevo.

Nuestra medición TEER utiliza el sistema automatizado de monitoreo de células 32: se sigue el principio de la espectroscopia de impedancia y se extiende sus aplicaciones anteriores. Aquí, se describe un modelo in vitro en la acreditación que permite el estudio de las propiedades de barrera, incluyendo la interacción de endotelio cerebral con células inmunes; en las células T activadas específicas. Tales condiciones fisiopatológicas se observan en las enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central, tales como la esclerosis múltiple y su modelo animal experimental la encefalomielitis autoinmune 33-37. Aquí, un paso crucial es la transmigración de las células T encefalitogénicas, específicas para la mielina a través de la barrera hematoencefálica. Esto es seguido por su reactivación en el espacio perivascular y entrada en el parénquima cerebral, donde se reclutan otras células inmunes y mela inflamación y la posterior desmielinización inme- 1,35,38. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la interacción entre tales células T y las células endoteliales, los principales constituyentes de la BBB, no están bien comprendidos. Nuestro protocolo pretende llenar este vacío y dar nuevos conocimientos sobre las consecuencias sobre las células endoteliales (es decir, integridad de la barrera y permeabilidad) tras su contacto directo y compleja interacción con células T activadas.

El protocolo descrito aquí hace uso de células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón primario, cultivadas como una monocapa en insertos permeables con membranas microporosas. Las células endoteliales son co-cultivadas con células T CD4 +, que se pueden pre-activadas policlonal o de una manera específica de antígeno. Co-cultivo de MBMECs con células T pre-activadas, pero no ingenua induce una disminución de la TEER y un aumento en Ccl, que proporciona una medida cuantitativa de la disfunción y la perturbación de la barrera MBMEC. La técnicaes no invasiva: utiliza una función de lugar de electrodos palillos, que impiden importante perturbación de la monocapa CE; que puede ser utilizado para controlar la función de barrera sin el uso de marcadores de células. Se realiza mediciones continuas de forma automatizada y permite una evaluación independiente de los dos parámetros de barrera (TEER y CCL) de forma simultánea en el tiempo. El método también es lo suficientemente sensible para distinguir entre diferentes niveles de activación de las células T y los efectos de tales células T en ECs.

Se puede utilizar en una amplia gama de ensayos funcionales: diferentes citocinas y / o quimiocinas implicadas en los procesos inflamatorios se pueden añadir a la co-cultivo de MBMECs y las células T; bloquea anticuerpos contra moléculas de adhesión celular ya sea en el lado de la CE o de células T se pueden utilizar; e inhibidores de los marcadores de activación de células T o de sus propiedades citolíticas se pueden añadir durante el cebado de células T o de su co-cultivo con ECs. El ensayo también es útil para la transmigración de las células Tensayos, ya que puede servir como un control de calidad de la integridad de la monocapa MBMEC antes de la adición de las células T. Todo esto hace que este método una herramienta versátil y fiable para estudiar la acreditación in vitro, con un enfoque en el efecto de las células T activadas en la integridad de la monocapa CE. Esto es de particular importancia para la comprensión de los mecanismos de la disrupción de la BHE en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes, como la esclerosis múltiple y su modelo animal de EAE, donde las células autorreactivas, encefalitogénicas T cruzan la barrera hematoencefálica y causan inflamación y daño neuronal.

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Protocolo

Para todos los experimentos, los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos en la instalación central de los animales en la Universidad de Münster, de acuerdo con las directrices alemanas para el cuidado de animales. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del comité de ética de los animales experimentales y aprobados por las autoridades locales de Renania del Norte-Westfalia, Alemania (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).

1. MBMEC Aislamiento y cultivo

NOTA: Aislar MBMECs como se ha descrito anteriormente en detalle 14 con las siguientes modificaciones:

  1. Sacrificar 20 adultos ratones C57BL / 6 (6-8 semanas de edad) mediante inhalación de CO2 y confirmar su muerte mediante la determinación de un paro cardíaco y respiratorio.
  2. Enjuague el ratón con un 70% de etanol y decapitar a ella con unas tijeras; quitar el cuero cabelludo con pinzas y tijeras. Hacer incisiones en el lado izquierdo y derecho del cráneo, a partir del foramen magnum. Levantar el cráneo de su lado caudal y take el cerebro con fórceps.
  3. Bajo una campana de flujo laminar, el uso de fórceps estériles para colocar el cerebro en una placa de Petri y quitar el tallo cerebral, el cerebelo y tálamo, manteniendo sólo la corteza.
    NOTA: El uso de un microscopio no es necesaria para cualquiera de estos pasos.
  4. Coloque la corteza en un pedazo de papel de Western Blot estéril y rodar suavemente con unas pinzas hasta las meninges ya no son visibles.
  5. Después de la digestión mecánica y enzimática (siguiendo el protocolo 14), recoger las células endoteliales de la gradiente de densidad mediante el uso de una aguja estéril de largo y un émbolo 5 ml. Las células endoteliales aparecen como una capa turbia por encima del anillo rojo con eritrocitos. Transferencia de 20 a 25 ml de esta capa en un nuevo tubo de 50 ml de la centrifugación; llenar el tubo con DMEM.
  6. Después de dos rondas de lavado 14, volver a suspender las células en 6 ml de medio MBMEC que contiene puromicina (4 mg / ml) y sembrarlos en seis pocillos recubiertos de una placa de 24 pocillos; dejarlos en un tejidoincubadora de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 (referido como 'incubadora' de aquí en adelante) durante tres días.
    NOTA: Para obtener información detallada de solución de revestimiento MBMEC, ver Tabla de Materiales.
  7. Cambiar el medio mediante la adición de 1 ml a cada pocillo de medio fresco sin MBMEC puromicina; poner la placa posterior a 37 ° C y 5% de CO2 durante dos días más.

2. La recolección MBMECs

  1. En el quinto día después del aislamiento MBMEC, pre-capa insertos permeables con MBMEC solución de revestimiento: añaden 80 l de solución por cada inserto y se dejan a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 3 horas.
  2. pipetear con cuidado de la solución de revestimiento y dejar que el aire seco insertos durante 30 minutos. Añadir 2 ml de la temperatura ambiente (RT) PBS a cada pocillo de la placa, utilizando MBMECs para lavar el medio; repita este paso. Añadir 0,05% de tripsina-EDTA (300 l por pocillo) y se deja la placa en la incubadora durante 5 a 10 min.
  3. Añadir 2 ml de medio MBMEC a cada pocillo para detenertripsinización. Transferencia de las células recogidas a un tubo de 15 ml centrifugación y centrifugar a 700 xg ellos durante 8 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio MBMEC sin puromicina.
  4. Contar las células; mezclar 10 l de suspensión de células con 90 l de 0,04% de azul de tripano (10X de dilución de las células). Pipeta de 10 l de esta mezcla entre la cubierta de vidrio y la cámara de recuento de células (hemocitómetro). Contar las células Trypan Blue-libres en los cuatro cuadrantes de la cámara (N) y determinar el número medio de células contadas (N ') de la siguiente manera: N' = N / 4.
  5. Calcular la concentración de células (en 10 6 células / ml) usando la siguiente fórmula: C = N 'x 10 4 x 10, donde 10 4 está dado por las dimensiones del hemocitómetro y 10 es el factor de dilución de la etapa 2.4.
  6. Seed 2 x 10 4 células en un volumen de 260 l por inserción. Añadir 810 l de medio MBMEC al compartimiento inferior de cada pocillo. Coloque la placa con inserciones en la incubadora hasta que esté listo para proceder con la sección 4.
    NOTA: Los volúmenes para el compartimiento superior e inferior son de inserción-específica y no funcionan para todos los formatos de 24 pocillos.

3. T CD4 + aislamiento de células y Estimulación

  1. Aislamiento de células T CD4 +
    1. Sacrificar a un ratón adulto (6-8 semanas de edad) mediante inhalación de CO2 y confirme su muerte mediante la determinación de un paro cardíaco y respiratorio.
    2. Coloca el ratón sobre su espalda en una tabla de disección limpia y enjuague con etanol al 70%; utilizar tijeras y pinzas estériles para abrir el peritoneo y quitar el bazo y los ganglios inguinales (, axilar, braquial y cervicales); finalmente, transferir el tejido en un tubo de 15 ml de la centrifugación que contiene 5 ml de PBS en hielo.
    3. Bajo la campana de flujo laminar, transferir el tejido por decantación PBS con el tejido en un tubo de centrifugación de 50 ml con un filtro de 70 micras de células en la parte superior; homogenizarel tejido presionando con un émbolo de 1 ml a través del filtro.
    4. Añadir 30 ml de tampón de FACS y se centrifuga que a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de tampón de FACS. Se filtra la suspensión a través de un filtro de células de 40 m, añadir otros 20 ml de tampón FACS para el tubo.
    5. Centrifugar que a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 500 l de tampón de FACS.
    6. Añadir 20 l de microperlas magnéticas ratón CD4, mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 ° C. Añadir 25 ml de tampón de FACS y se centrifuga que a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
    7. Mientras tanto, colocar una columna de separación de LS en el imán y enjuagarlo con 3 ml de tampón FACS. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 3 ml de tampón de FACS.
    8. Añadir células a la columna. Lavar la columna con 3 ml de tampón FACS tres veces. Retirar la columna del imán y colocarlo en un nuevo 15 ml centrifugation tubo. Añadir 5 ml de tampón FACS, eliminar las células marcadas con el émbolo de la columna y centrifugar a 500 xg durante 5 min 4 ° C.
    9. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 3 ml de medio de células T. Contar las células como se describe en 2.4 y semilla de 1 x 10 5 células en 100 l de medio por pocillo.
  2. Estimulación de células T CD4 +
    1. La estimulación de células T policlonales CD4 +
      1. Pre-recubrir una placa de 96 pocillos de fondo redondo con purificada anticuerpo anti-CD3 de ratón (clon 145-2C11) en PBS, a una concentración final deseada. Por ejemplo, para pre-capa de la placa llena con α-CD3 a 1 g / ml, mezclar 10 l de anticuerpo (concentración stock = 0,5 mg / ml) con 5 ml de PBS, vórtice y añadir 50 l de la mezcla de cada pocillo con una pipeta multicanal.
      2. Deja la placa en la incubadora durante 3 horas. Después de aislar las células T, se lava la placa pre-recubierto dos veces con PBS. Añadir anticuerpo anti-CD28 purificado (clon37,51) a células aisladas T a una concentración final deseada (por ejemplo, en 1 mg / ml); mezclar bien. Sembrar las células T y los dejan en la incubadora durante dos o tres días.
    2. La estimulación de las células T CD4 + específicas de antígeno con las células dendríticas (DC)
      NOTA: Si se utilizan los DC como células presentadoras de antígeno (APC), siga el Protocolo para el aislamiento de células T, con las siguientes excepciones:
      1. Antes de la homogeneización del bazo, inyectar con 1 ml de colagenasa tipo IA en PBS a 0,5 mg / ml y la transfiere a un tubo de centrifugación de 15 ml.
      2. Incubar en baño de agua a 37 ° C durante 15 minutos. Después de lavar con PBS, resuspender el precipitado en tampón FACS y se añaden 20 l de microperlas magnéticas CD11c ratón, en lugar de las microperlas de CD4.
      3. Utilice una columna de separación de la EM y los volúmenes apropiados: lavar la columna con 1 ml de tampón de FACS; Resuspender las células en 1 ml de tampón de FACS y se lava la columna con 1 ml de tampón FACS tres veces.
      4. Anunciod antígeno de elección a los DC (por ejemplo, glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG) aa 35 a 55 a 20 g / ml), mezclar bien y semillas 5 x 10 4 células en 100 l de medio de cultivo de células T por 96-round-bottom bien.
      5. Añadir 1 x 10 5 T células en 100 l de medio de cultivo de células T por 96-de fondo redondo de pocillos al final, como se describe en el Protocolo para el aislamiento de células T.
    3. La estimulación de células T CD4 + específicas de antígeno con las células B
      NOTA: Si se utilizan las células B como APC, seguir el Protocolo para el aislamiento de células T, con las siguientes excepciones:
      1. Utilice el bazo de los ratones transgénicos cuyas células B son antígeno-específica (por ejemplo, ratones, CIB MOG (Th), cuyas células B reconocen específicamente MOG 35-55).
      2. Utilizar las células T específicas de antígeno (por ejemplo, a partir de TCR MOG (2D2) ratones). Añadir 20 l de microperlas magnéticas CD19 de ratón en lugar de microesferas de CD4.
      3. Añadir el antígeno de elección para el cel Bls (por ejemplo, MOG 35-55 a 20 mg / ml), se mezclan bien y la semilla 5 x 10 4 células en 100 l de medio de cultivo de células B por 96-de fondo redondo de pocillos.
      4. Añadir 1 x 10 5 células T en 100 l de medio de cultivo de células T por 96 de fondo redondo, bueno, tal como se describe en el Protocolo para el aislamiento de células T.

4. Configuración y realización de Medición TEER

  1. Coloque el módulo de 24 pocillos del instrumento TEER bajo la campana de flujo laminar. Retire las tapas y colocar insertos con MBMECs en el instrumento utilizando fórceps.
  2. Pipetear 810 l de medio fresco para el compartimiento inferior de los pozos del módulo: añadir con cuidado entre la inserción y la pared del módulo también.
  3. Cierre las tapas y colocar el instrumento en la incubadora. Conectar el instrumento a su equipo; encienda el controlador del instrumento y abrir el software.
  4. Seleccione 'nueva medición "en la ventana emergente. Check 'mostrar TEER "y cajas" mostrar Ccl'; a continuación, pulse 'start'. Después de completar la primera medición, seleccione 'comprobar todos los pozos "en la pestaña" resultados "para ver todos los valores de TEER y CCL.
  5. Guarde el archivo: Archivo> Guardar como> 'el nombre de su archivo'.
    NOTA: Como TEER y CCL se miden continuamente de forma automatizada, monitorear sus valores durante un período de tres a cinco días. Cambiar el medio no es necesario, a menos que la viabilidad celular no es óptima, como se visualiza por una falta de aumento de la TEER.
  6. Elija el punto de tiempo para co-cultivo con células T MBMECs cuando Ccl es estable y menor que 1 mF / cm 2 y TEER ha alcanzado su nivel máximo.
  7. Inspeccione cuidadosamente los valores absolutos de TEER y CCL y excluir a los pocillos en los que no se han desarrollado MBMECs confluentes suficientes monocapas desactivando dichos pozos.
  8. Grupo el resto de los pozos: haga clic derecho en un pozo y seleccione 'poner así al nuevo pozo promedio ". Name en la ventana emergente; hacer lo mismo para todos los pozos individuales a agruparse.
  9. Compruebe todos los pozos promedio confirmar que todos ellos tienen las mismas condiciones iniciales antes de la co-cultivo. Si algunos tienen significativamente diferentes valores absolutos de TEER o TEER pistas, o los errores estándar son demasiado grandes, rehacer la agrupación.
    NOTA: La agrupación óptima de pozos proporciona una mínima variación en los valores de TEER, tanto dentro como entre los grupos experimentales.
  10. En la pestaña "experimento", presione "pausa", desconecte el instrumento y lo saca de la incubadora. Retire las tapas bajo la campana de flujo laminar.
  11. Preparar pre-activado y / o células T ingenuas, con o sin citoquinas, anticuerpos específicos u otras sustancias, según se desee: Por ejemplo: Mezcla purificada de rata NA / LE anticuerpo anti-ratón de IFN-γ (XGM1.2 clon) con preparados T células, en 20 mg / ml por pocillo de la TEER instrumento.
    NOTA: Si se utilizan sustancias como el inhibidor de la granzima B, que son unadded para el cultivo de células T al comienzo de la estimulación de células T: por ejemplo, granzima B Inhibitor II (Calbiochem) se mezcla con las células T aisladas a una concentración final de 10 mM en DMSO. Ver Materiales y Equipos para más detalles.
  12. Eliminar parte del medio de la inserción (el compartimiento del pozo superior): por ejemplo, cuidado de la pipeta 150 l (quitar todo el medio debe evitarse, como puede perturbar la monocapa MBMEC).
  13. Añadir las células T para MBMECs pipeteando cuidadosamente 150 ml de medio que contenía 2 x 10 5 células / inserto.
    NOTA: En la cosecha de células T pre-activadas, contar sólo la voladura, células de azul de tripano-libres.
  14. Cierre las tapas y colocar el instrumento de vuelta a la incubadora. Vuelva a conectar el instrumento y pulse 'reanudar mediciones'. Después de 24 horas, pulse "stop" en la pestaña "experimento" y guardar el archivo (Archivo> Guardar).

5. Exportación de datos y análisis estadístico

  1. Exportar los resultados seleccionando Archivo> Exportar.
  2. En la pestaña "Configuración" de la ventana emergente, seleccione ".dot" en la opción "separador decimal" y "tabulador" en la opción "delimitador de campo".
  3. En la pestaña "resultados de exportación", nombre del archivo, comprobar todos los pozos destinados a la exportación, y comprobar el "TEER" y cajas "Ccl" en la opción "elegir de datos".
  4. Pulse "exportar datos", abra el archivo exportado, y copiar los datos a una hoja de cálculo.
  5. Normalizar los datos exportados (ordenados por cada réplica, con valores de TEER y CCL dadas para cada ejecución (medición)): los valores Conjunto de TEER y CCL del último punto de tiempo antes de que el co-cultivo de 100% y modificar en consecuencia los valores de todos los demás carreras, con relación a la carrera '100%'.
  6. Copiar los datos normalizados a un software de elección para generar un gráfico, utilizando pozos individuales y mostrar el error estándar de la media para cada grupo de tratamiento.
  7. PAGealice de dos vías prueba estadística ANOVA con la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples, usando el software estadístico de elección.

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Resultados

La Figura 1 proporciona una visión general del modelo in vitro acreditación utilizado para estudiar la interacción entre las células T y las células endoteliales. El experimento consiste en tres pasos principales. El primer paso es el aislamiento de MBMECs primarios a partir de cortezas cerebrales y su cultura durante cinco días. Cuando alcanzan la confluencia en la placa de cultivo celular, MBMECs se tratan con tripsina y se sembraron de nuevo en insertos perme...

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Discusión

Varios pasos del protocolo descrito son esenciales para un experimento exitoso. Durante el aislamiento MBMEC inicial y la cultura, es crucial que el trabajo se realiza en condiciones estériles tanto como sea posible, para evitar la contaminación del cultivo celular con esporas de hongos o bacterias. Con el fin de obtener un cultivo puro de ECs, se recomienda el uso de un medio que contiene puromicina durante los tres primeros días, lo que permite la supervivencia de ECs, pero no otros tipos de células (especialmente per...

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Divulgaciones

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl y L. Klotz no tienen nada que revelar. H.-J. Galla es asesor científico de nanoAnalytics GmbH, el fabricante del monitor celular automatizado.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos a Annika Engbers y Frank Kurth por su excelente apoyo técnico y el Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) útil para los debates en relación con las mediciones de TEER. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 proyecto A03 a HW y LK, CRC TR128, proyecta A08; Z1 y B01 en LK y HW, y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (Facultad de Medicina de Münster) el número de concesión KL2 / 2015/14 en LK.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.comincluye: módulo de celda de 24 pocillos, controlador, PC con el software cellZscope v2.2.2 
UltracentrífugaThermo Scientificwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; para
citómetro de flujoBeckman Coulterwww.beckmancoulter.compara el análisis de la transmigración de células T
Software FlowJo7.6.5Tree Star www.flowjo.compara el análisis de la transmigración de células T
Tubos de centrífuga Oak Ridge, PCThermo Fisher Scientific3118-005050 ml; para aislamiento MBMEC
Insertos de membrana Transwell - tamaño de poro 0,4 y micro; mCorning3470para la medición de TEER como lectura principal Insertos
de membrana Transwell - tamaño de poro 3 y micro; mCorning3472para la medición de TEER como control de calidad antes del ensayo de transmigración de células T
placa de cultivo celular de 24 pocillosGreiner650 180de fondo plano; para cultivo MBMEC
placa de cultivo celular de 96 pocillosCostar3526de fondo redondo; para cultivo de células inmunitarias
Separador QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976para el aislamiento de células T y células B; soportes Columnas MACS LS
OctoMACS SeparadorMiltenyi Biotec130-042-109para el aislamiento de células dendríticas; soporta columnas MACS MS
Cámara de recuento NeubauerMarienfeldMF-0640010para el recuento de
células Filtro de células, 70 y micro; mCorning352350para el aislamiento de células inmunitarias
Filtro de células, 40 µ mCorning352340para el aislamiento de células inmunitarias
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303para el aislamiento de células inmunitarias
Columnas de separación MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401para el aislamiento de células T y B
Columnas de separación MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201para el aislamiento de células dendríticas
Ratón CD4 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-049-201para el aislamiento de células T CD4+
MicroBeads de ratón CD19Miltenyi Biotec130-052-201para el aislamiento de células B
Ratón CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-001para el aislamiento de células dendríticas
Colágeno tipo IV de placenta humanaSigmaC5533para solución de recubrimiento MBMEC
Fibronectina de plasma bovinoSigmaF1141-5MGpara solución de recubrimiento MBMEC
Colagenasa 2 (CSL2)WorthingtonLS004176para el aislamiento de MBMEC
Colagenasa/Dispasa (C/D)Roche11097113001para el aislamiento de MBMEC
DNasa ISigmaDN25para el aislamiento de MBMEC
Suero fetal bovino (FBS)SigmaF7524para el aislamiento de MBMEC
Albúmina sérica bovina (BSA)Amresco0332-100Gpara el aislamiento de MBMEC
PercollSigmaP1644-1Lpara el aislamiento de MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021para el aislamiento de MBMEC y el medio de cultivo MBMEC
Penicilina/estreptomicinaSigmaP4333para el aislamiento de MBMEC y el medio de cultivo MBMEC
tamponado con fosfato Solución salina (PBS)SigmaD8537para MBMEC y aislamiento de células inmunitarias
HeparinaSigmaH3393para medio de cultivo MBMEC
Factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos (bFGF)PeproTech100-18Bpara medio de cultivo MBMEC
PuromicinaSigmaP8833para medio de cultivo MBMEC; solo durante los tres primeros días
0,05% Tripsina-EDTAGibco25300-054para la recolección de MBMECs
Colagenasa tipo IASigmaC9891para el aislamiento de células dendríticas
Solución de azul de tripán, 0,4 %Thermo Fisher Scientific15250061para el recuento de células
EDTASigmaE5134para el aislamiento de células inmunitarias
IMDM + 1% L-GlutaminGibco21980-032para linfocitos T medio
de cultivo X-VIVO 15LonzaBE04-418Qproteger de la luz; para medio de cultivo de células B
β-mercaptoetanolGibco31350-010para medio de cultivo de células B
L-Glutamina (100x Glutamax)Gibco35050-061para medio de cultivo de células B
ratón MOG35— 55 BiotrendBP0328para la activación de linfocitos T
antígeno anti-ratón CD3 ABBioLegend100302clon 145-2C11; para la activación >de linfocitos T policlonales
anti-ratón NA/LE purificado CD28 AbBD Pharmingen553294clon 37.51; para la activación de linfocitos T policlonales
IFN-&gamma murino recombinante;PeproTech315-05para ensayos de transmigración de células T
TNF-& alfa murino recombinante;PeproTech315-01Apara ensayos de transmigración de células T
NA/LE purificado anti-ratón IFN-& anticuerpoBD Biosciences554408clon XMG1.2; concentración final recomendada: 20 µ g/ml
Granzyme B Inhibitor IICalbiochem 368055concentración final recomendada: 10 µ M
PE anticuerpo CD4 de ratónBiolegend116005clon RM4-4; para el análisis de la transmigración de células T
de aislamiento MBMEC específicos de

Referencias

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