Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.
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Artículo de método
Aislamiento y activación de los linfocitos murinos
En este artículo
Resumen
Resumen
células B y T, con sus repertorios de antígenos-receptores extremadamente diversos, tienen la capacidad de montar respuestas inmunitarias específicas contra casi cualquier patógeno invasor1,2. Es comprensible que estas intrincadas capacidades estén controladas por un gran número de moléculas implicadas en diversos procesos celulares paragarantizar respuestas inmunitarias oportunas y espacialmente reguladas. Aquí, describimos procedimientos experimentales que permiten el aislamiento rápido de linfocitos murinos altamente purificados utilizando tecnología de clasificación de células magnéticas. Los linfocitos purificados resultantes pueden ser sometidos a diversos ensayos funcionales in vitro o in vivo, como la determinación de la capacidad de señalización de los linfocitos tras la estimulación por inmunotransferencia4 y la investigación de las capacidades proliferativas mediante la incorporación de 3H-timidina o el marcaje de éster succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE)5-7. Además de comparar las capacidades funcionales de los linfocitos control y los linfocitos modificados genéticamente, también podemos determinar la capacidad estimuladora de las células presentadoras de antígenos (APC) in vivo, como se muestra en nuestros resultados representativos utilizando células T OT-I trasplantadas marcadas con CFSE.
Introducción
Los linfocitos maduros generalmente existen en estado de reposo si no hay infección o inflamación preexistente en el individuo. Por lo tanto, es importante mantener el estado previo de los linfocitos durante el proceso de aislamiento antes de realizar ensayos funcionales in vitro o in vivo. La clave para garantizar resultados consistentes y reproducibles es limitar cualquier manipulación innecesaria de las células.
La clasificación magnética de células utiliza anticuerpos y microperlas para etiquetar las células con el fin de enriquecer la población celular de interés. Con este enfoque, hay dos estrategias de purificación: el enriquecimiento positivo y el agotamiento negativo. El enriquecimiento positivo enriquece la población celular de interés utilizando un anticuerpo que se une a las células diana. El agotamiento negativo, por otro lado, agota las células no objetivo, dejando la población celular de interés. En nuestro laboratorio, preferimos el agotamiento negativo al enriquecimiento positivo porque la unión de los anticuerpos a las células diana podría alterar las características y el comportamiento de la célula. De hecho, muchos marcadores de superficie celular establecidos adecuados para el aislamiento de una población celular particular también son receptores funcionales.
La clasificación de células magnéticas no solo produce poblaciones altamente puras de células diana viables, sino que también requiere menos tiempo y evita el estrés celular inducido por el flujo de alta presión utilizado en la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Al etiquetar las poblaciones celulares no deseadas y agotarlas mediante una columna de separación magnética, podemos realizar un aislamiento celular rápido sin comprometer la viabilidad de la población celular objetivo. En este protocolo, demostramos el uso de estrategias de depleción negativa para purificar células B o células T vírgenes.
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Protocolo
Todos los ratones son criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos y todos los protocolos de ratón se llevan a cabo de acuerdo con las directrices del Comité para el Cuidado y Uso de Animales institucional.
1. Preparación de tampones y reactivos
- Preparar Memorial Institute completa Roswell Park (RPMI) medio (10% de suero inactivado por calor bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (100 UI / ml) / estreptomicina (100 mg / ml), 55 mM 2-mercaptoetanol ).
- Preparar 20x solución salina equilibrada (BSS) Lote 1 y 2, por separado.
- Preparar 20x BSS stock 1 (111 mM dextrosa, fosfato de potasio 8,8 mM, 26,7 mM de fosfato dibásico de sodio en 1 L de agua estéril) y añadir 40 ml de 0,5% de rojo fenol 20x BSS stock 1 antes del ajuste del volumen final. Filtro estéril utilizando 0,2 micras filtro antes de guardar a 4 ° C.
- Preparar 20x BSS madre 2 (25,8 mM de cloruro de calcio dihidrato, 107 mM de cloruro de potasio, cap 2,73 M de sodioLoride, 19,6 mM de cloruro de magnesio hexahidratado, 16,6 mM de sulfato de magnesio en 1 L de agua estéril). Filtro estéril utilizando 0,2 micras filtro antes de guardar a 4 ° C.
- Para preparar 1x BSS para uso experimental, diluir 50 ml de BSS stock 1 y 50 ml de BSS madre 2, por separado, en 400 ml de agua estéril cada uno. Combinar ambas soluciones diluidas, se ajusta a pH 7, y se añaden 20 ml de FBS (2%). Completar hasta 1 litro con agua esterilizada y el filtro estéril usando 0,2 micras filtro.
NOTA: las soluciones madre del SRS se deben preparar por separado porque la mezcla de poblaciones concentradas directamente SRS podría dar lugar a la precipitación.
- De glóbulos rojos (RBC) Tampón de lisis
- Para preparar tampón de lisis RBC, la mezcla 9 partes de cloruro de stock de amonio (cloruro de amonio 155 mM en agua estéril) a 1 parte de la base Tris (Tris mM (hidroximetil) aminometano 130 en agua estéril, pH 7,65) antes de su uso.
NOTA: las tiendas de soluciones madre estériles de cloruro de amonio y Tris-base a 4 ° C. Preparar lisis bUffer fresco para asegurar la lisis eficiente de los glóbulos rojos.
- Para preparar tampón de lisis RBC, la mezcla 9 partes de cloruro de stock de amonio (cloruro de amonio 155 mM en agua estéril) a 1 parte de la base Tris (Tris mM (hidroximetil) aminometano 130 en agua estéril, pH 7,65) antes de su uso.
2. Generación de linfocitos Suspensión de bazo o los ganglios linfáticos
NOTA: Es importante preparar todos los reactivos y equipos necesarios para el experimento antes de la eutanasia y del ratón para generar suspensiones de células individuales de linfocitos tan pronto como sea posible para mantener la viabilidad celular por alto.
- La eutanasia experimental de ratón por dislocación cervical o asfixia con CO2.
NOTA: A partir de este paso en adelante, todos los procedimientos experimentales deben llevarse a cabo de forma aséptica. - Sumergir todo el ratón en etanol al 70% antes de hacer ninguna incisión. Extirpar el bazo y los ganglios linfáticos de manera aséptica 8, y colocarlos en distintos tubos de 15 ml que contienen 5 ml de RPMI / FBS enfriado con hielo (RPMI con FBS al 2%) o BSS / FBS (del paso 1.2.3).
NOTA: Como BSS impide eficiente lisis RBC, utilice RPMI para la preparación de la suspensión de células del bazo y cambiar a BSS faetlisis r RBC. - Para generar una suspensión de células de bazo o los ganglios linfáticos, coloque el órgano (s) entre dos piezas de malla de filtro de micras de células estéril 100 en una placa de Petri que contiene 2 ml enfriado en hielo RPMI / FBS o BSS / FBS. Usando el émbolo de una jeringa de 1 ml, triturar el órgano (s) hasta que se haya rasgado en partes muy finas.
- Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml y lavar la malla del filtro de células con helado de RPMI / FBS o BSS / FBS. Recoger la suspensión celular restante, añadirlo al mismo tubo de 15 ml y centrifugar a 453 g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
NOTA: Vuelva a suspender las células sedimentadas colocando el tubo con los dedos antes de la adición de tampón de lisis de glóbulos rojos o medio en los pasos posteriores. - Preparar temperatura ambiente tampón de lisis (RT) RBC durante la centrifugación de la suspensión celular (véase la etapa 1.3.). Después de la granulación de las células y eliminar el sobrenadante, volver a suspender las células con 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos por cada 10 8 células. Incubate la reacción de lisis a temperatura ambiente durante 3-4 min.
- Deja de lisis de glóbulos rojos con 14 ml de helado de BSS / FBS y centrifugar a 453 g durante 5 min a 4 ° C.
3. Purificación de células B y T
- La purificación de las células B
- Contar las células utilizando un hemocitómetro. Vuelva a suspender hasta 10 8 células esplénicas en 300 l BSS / FBS y se añaden 50 l anti-CD43 microbolas magnéticas 9,10. Para eliminar las células muertas, añadir 30 l perlas magnéticas Anexina V. Incubar la suspensión de células en un refrigerador 4 ° C durante 30 min.
- La purificación de las células T
- Contar las células utilizando un hemocitómetro. Vuelva a suspender hasta 10 8 células en no-T cóctel de anticuerpos agotamiento de las células (anticuerpos biotinilados contra CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 y CD4 o CD8 en función de la población de células diana a ser purificado), diluido 1: 200 en 200 BSS l / FBS 4,5. Incubar la suspensión de células en una4 ° C refrigerador durante 15 min.
- Después de la incubación, añadir 10 ml BSS / FBS para lavar las células y centrifugar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 165 l BSS / FBS con 30 microperlas de estreptavidina l y 15 l perlas magnéticas Anexina V. Incubar la suspensión de células en un refrigerador 4 ° C durante 30 min.
NOTA: Para asegurar incluso el etiquetado con las microperlas magnéticas, incubar las células con microperlas de 15 min, a continuación, mezclar la suspensión de células suavemente tocando el tubo de 15 ml y se incuba otros 15 minutos durante la etapa 3.1.1. o 3.2.2.
- Preparación de la columna de separación para la purificación de la célula
- Preparar una columna de separación no utilizado durante el etiquetado de microperlas de las células (paso 3.1.1. O 3.2.2.). Pre-caliente BSS (sin FBS) a TA y utilizar 2 ml de lavar y equilibrar la columna de forma aséptica. Después de equilibrar con BSS, la columna se lava no se debe permitir que se seque.
NOTA: Utilizamos el LS cOLUMNA lugar de la columna LD recomendada debido a su aptitud para la reutilización (véase el paso 3.4.). - Después del marcaje con las perlas magnéticas, añadir 14 ml BSS / FBS para lavar las células y centrifugar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1-3 ml de BSS RT.
- Adjuntar una aguja estéril 21 G a la punta de la columna para reducir la velocidad de flujo durante el proceso de purificación. Cargar la suspensión celular en la columna equilibrada y se recoge el flujo a través que contiene las células diana purificadas.
NOTA: Evitar la introducción de burbujas dentro de la columna durante la carga. - Lavar la columna una vez con 1 ml de BSS / FBS y se recoge el flujo a través que contiene las células diana purificadas. Actualizar la columna con el flujo a través una vez más. Recoger el flujo a través de después de la segunda carga en el mismo tubo de 15 ml.
- Lavar la columna 3 veces con 1 ml de BSS / FBS y se recoge el flujo a través que contiene las células diana purificadas. A partir de entonces, se añaden 5 ml de BSS / FBS a thcolumna de dirección y, con un émbolo, a eliminar las células marcadas magnéticamente fuera de la columna en un nuevo tubo de 15 ml.
- Comprobar la pureza de las células recogidas por citometría de flujo utilizando anticuerpos que se unen a antígenos de B purificada o células T 4,5 superficie.
- Preparar una columna de separación no utilizado durante el etiquetado de microperlas de las células (paso 3.1.1. O 3.2.2.). Pre-caliente BSS (sin FBS) a TA y utilizar 2 ml de lavar y equilibrar la columna de forma aséptica. Después de equilibrar con BSS, la columna se lava no se debe permitir que se seque.
- La reutilización de la columna de separación
NOTA: La columna LS se puede reutilizar hasta 4 veces sin afectar a la eficiencia de purificación.- Lavar la columna 3 veces con 5 ml de tampón fosfato salino (PBS) y 3 veces con 5 ml de agua destilada por la parte superior mediante el émbolo.
- Lavar la columna con 5 ml de etanol 70% y se seca la columna extensivamente usando un grifo de aire para evitar la acumulación de óxido en la columna.
- Para preparar una columna LS usado para un experimento de purificación por separado, lavar la columna de abajo hacia arriba con etanol 5 ml de 70% utilizando el adaptador de la jeringa. A continuación, lavar la columna de abajo hacia arriba dos veces con 5 ml de PBS estéril, seguido por 5 ml de PBS una vez desde la parte superior de la columna. Añadir 2RT ml de BSS para equilibrar la columna y luego proceder a la carga de la columna con células marcadas.
4. CFSE etiquetado y Estimulación
NOTA: Purificado células se pueden someter a una variedad de in vitro y en ensayos funcionales in vivo. Aquí, nosotros usamos las células T purificadas para determinar la capacidad de estimulación de células T de APC 5.
- solución de pre-calentamiento de etiquetado (0,1% de FBS en PBS) a 37 ° C antes de la CFSE de carga.
NOTA: El uso de un bajo porcentaje de FBS en PBS reduce la muerte celular durante la CFSE carga y reduce al mínimo la pérdida de células durante la centrifugación. Sin embargo, demasiado FBS pueden interferir con la carga CFSE. - Lavar las células purificadas dos veces con solución de etiquetado, a continuación, se resuspendieron a 2 x 10 7 células / ml en solución de etiquetado pre-calentado en un tubo de 15 ml.
- Preparar 10 solución CFSE mu M (1: 500 dilución de CFSE mM solución madre 5) en solución de etiquetado pre-calentado. CFSE solución debedebe prepararse cada vez para conseguir el marcaje óptimo.
- Para cargar las células con CFSE, añadir la suspensión de células de 1 parte a 1 M solución CFSE parte 10 en un tubo de 15 ml y se incuban en la oscuridad durante 10 min a 37 ° C. Una concentración final de 5 mM CFSE se utiliza para etiquetar 1 x 10 7 células / ml.
- Invertir el tubo cada 2 minutos para asegurar una mezcla homogénea de las células durante la CFSE de carga.
- Para detener la reacción, añade varios volúmenes de medio RPMI completo enfriado con hielo y centrifugar a 453 g durante 5 min a 4 ° C. Al éxito CFSE de carga, el sedimento celular aparecerá amarillento.
- Wash CFSE cargado células una vez más con medio RPMI completo enfriado con hielo y girar hacia abajo a 453 xg durante 5 min a 4 ° C antes de usar para el cultivo in vitro o la estimulación in vivo.
5. estimulación in vitro
- Preparar una solución 2x social de estímulos (2x estímulos solución madre) inmediatamente antes de su uso para que 100 l de solución de los estímulos de la 2x se puede añadir a 100 l de células a un volumen final de 200 l por pocillo en una placa de 96 pocillos.
- Si se requiere una placa recubierta con estímulos (IgM o CD40 para células B o CD3 y CD28 para las células T), diluir los estímulos en PBS y pre-capa de la placa de cultivo a 4 ° C durante la noche. Alternativamente, la placa de cultivo se puede recubrir a 37 ° C durante 1 hr en el día del experimento. Lavar la placa recubierta dos veces con PBS (No permita que la placa se seque en cualquier momento).
| Para las células B | |
| Los estímulos | La concentración final |
| F (ab ') 2 de cabra anti-IgM de ratón | 0,6 a 2,4 g / ml |
| Anti-ratón CD40 | 0,5-2 mg / ml |
| recombinanteratón IL-4 | 25 U / ml |
| lipopolisacárido | 0,1 a 10 mg / ml |
| (LPS) de E. coli serotipo 055: B5 | |
| Para las células T | |
| Los estímulos | La concentración final |
| Anti-CD3 (placa recubierta) | 2-10 g / ml |
| (50 l / pocillo para el recubrimiento) | |
| Anti-CD28 (placa recubierta) | 2 g / ml |
| Recombinante IL-2 | 40 U / ml |
| PDBu (éster de forbol) | 5-50 ng / ml |
| A23187 (ionóforo de calcio) | 250 ng / ml |
Tabla 1: Concentraciones de estímulos que se utilizan para estimular los linfocitos en cultivo in vitro.
- Para las células B marcadas con CFSE, vuelva a suspender a 3 x 10 6 células / ml en medio RPMI completo y la cultura, por triplicado, con 3 x 10 5 células / pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano de 72 horas.
- Para las células T marcadas con CFSE, volver a suspender a 0,5-3 x 10 6 células / ml en medio RPMI completo y la cultura por triplicado con 0,5-3 x 10 5 células / pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo de 48 o 72 horas .
6. En Vivo Estimulación
- Para la estimulación in vivo, la transferencia adoptiva de 4 x 10 6 células T marcadas con CFSE por ratón (por vía intravenosa (iv) en 200 l de PBS) en cada ratón receptor emparejado-MHC.
NOTA: En este protocolo, las células T marcadas con CFSE se pueden transferir de manera adoptiva utilizando vena de la cola o inyección retro-orbital que estas células se alberga órganos linfoides como el bazo y los ganglios. - Desafiar a los ratones receptores un día después con el antígeno.
NOTA:En este ejemplo, se utiliza la ovoalbúmina (proteína OVA, 50 g / ratón) como el antígeno porque específica de OVA, receptor de células T (TCR) las células T -transgenic se transfirieron adoptivamente en ratones receptores. Preparar la proteína OVA en PBS estéril e inyectar 100 l de proteína OVA / PBS o PBS control, a través de inyección subcutánea (IS), en cada ratón receptor 5. - Cosecha y generar suspensiones individuales de células de los órganos linfoides (ganglios linfáticos y el bazo) de los ratones receptores de 3 días después de la inmunización con la proteína OVA o PBS. ganglios linfáticos separadas en los ganglios linfáticos proximales (PLN), que incluye axilar, braquial y de los ganglios linfáticos cervicales superficiales) y los ganglios linfáticos distales (DLN), que incluye mesentérica, poplítea, inguinal, lumbar, y los ganglios linfáticos caudal. células de tinción de FACS utilizando los anticuerpos adecuados para detectar la proliferación de células T.
NOTA: En este experimento de seguimiento de células CFSE, CFSE marcado con las células T de ratones de control inyectados con PBS establecer una fluorescencia de línea de base para los no-diViding células. Divisiones celulares de proliferación, las células, marcadas con CFSE estimulados por antígenos se visualizaron mediante la medición de los picos de fluorescencia 12,13. Con el control de PBS, el número de divisiones celulares de la proliferación, las células T marcadas con CFSE se puede determinar 12,13. - Analizar los datos de proliferación de células CFSE marcado mediante la comparación del número de divisiones celulares o picos entre las muestras (Figuras 1 y 2).
NOTA: Por ejemplo, marcado con CFSE, las células T específicos de OVA adoptivamente transferidas en ratones receptores que recibieron el antígeno OVA se someterán a la proliferación activa en comparación con los ratones de control inyectados con PBS 5,12. Además, es digno de mención destacar que hay muchas maneras de analizar los datos de proliferación de células CFSE, como se demuestra por Hawkins y colegas 14.
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Resultados
purificación celular magnética de linfocitos permite a los usuarios para purificar una población de células diana en un período relativamente corto de tiempo. Utilizando el protocolo de agotamiento, hemos sido capaces de aumentar el porcentaje de células T CD8 (OT-I en la recombinación de activación de gen-1 (RAG-1) ratones deficientes) de 72,8% (antes de la purificación) a 94,2% (después de la purificación; Figura 1 A) 4,5. Estos linfocitos purificados se pue...
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Discusión
En este protocolo, se demuestra un procedimiento para la purificación de los linfocitos de los órganos linfoides. la purificación de células utilizando la clasificación perla magnética es un método rápido y simple que produce células diana viables, altamente purificados.
Los pasos críticos dentro del Protocolo
La viabilidad celular y el rendimiento celular
El mantenimiento de la viabilidad de las células del linaje hema...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El estudio es apoyado por el Ministerio de Educación, Singapur (ACRF Tier1-RG40 / 13 y Tier2-MOE2013-T2-2-038). El manuscrito fue editado por Amy Sullivan de Obrizus Comunicaciones.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales | |||
| RPMI 1640 (sin L-Glutamina) | Gibco | 31870025 | |
| Suero | Inactivado por el calor | ||
| L-glutamina | Gibco | 25030024 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | |
| Microperlas magnéticas anti-CD43 | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mezclar bien antes del uso |
| Microesferas de estreptavidina | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mezclar bien antes del uso |
| Perlas magnéticas anti-anexina V | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mezclar bien antes del uso |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Placa de cultivo estéril con fondo en U de 96 pocillos | Greiner Bio-one | 650180 | |
| Placa de cultivo estéril con fondo F de 96 pocillos | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μ m malla | Para esterilizar usando radiación UV uso previo | ||
| 0.2 μ m unidades de filtro desechables estériles | Nalgene | 567-0020 | Puede ser sustituido por cualquier dispositivo de filtro estéril |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV para abreviar; alternativa a CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY para abreviar; alternativa a CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR para abreviar; alternativa a CFSE |
| Tinte de proliferación celular eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 para abreviar; alternativa a CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternativa a CFSE |
| strong>Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrosa | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Fenol rojo | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Cloruro de calcio dihidratado | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Cloruro de potasio | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Cloruro de sodio | Merck Millipore | S7653 | Se puede utilizar de otras fuentes |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Sulfato de magnesio | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Cloruro de amonio | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimetilsulfóxido | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(y 6-) diacetato de carboxifluoresceína éster succinimidilo (CFSE) | Sondas moleculares | C-1157 | Reconstituir en DMSO |
| Forbol 12,13-dibutirato (PBDU, éster de Forbol) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Ionóforo de calcio) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comments |
| Anticuerpos y proteína recombinante | |||
| depleción de células T | |||
| CD11c biotina (clon N418) | Biolegend | 117304 | Cóctel de depleción de células T |
| Biotina Gr-1 (clon RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | cóctel de depleción de células T |
| Ter119 biotina (clon Ter119) | Biolegend | 116204 | cóctel de depleción de células T |
| TCR-γ δ biotina (clon GL-3) | Biolegend | 118103 | Cóctel de depleción de células T |
| CD19 biotina (clon 6D5) | Biolegend | 115504 | Cóctel de depleción de células T |
| B220 biotina (clon RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | Cóctel de depleción de células T |
| CD49b biotina (clon DX5) | Biolegend | 108904 | Cóctel de depleción de células T |
| CD4 biotina (clon GK1.5) | Biolegend | Cóctel de depleción de linfocitos T | |
| 100404 CD8 biotina (clon 53-6.7) | Biolegend | 100704 | Cóctel de depleción de linfocitos T |
| F(ab')2 IgM anti-ratón de cabra (recubierto de placa) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos) |
| Anti-ratón CD40 mAb (recubierto de placa) | Pharmingen | 553722 | 50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos) |
| IL-4 | ProSpec recombinante; | Cyt-282 | |
| LPS de E. coli Serotipo 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clon clon OKT3) (placa recubierta) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos) |
| Anti-CD28 (clon clon 37.51) (recubierto de placa) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos) |
| Albúmina recombinante IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| de clara de huevo de gallina, ovoalbúmina | Sigma Aldrich | A7641 |
Referencias
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