Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.
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Artículo de método
Aislamiento y activación de los linfocitos murinos
En este artículo
Resumen
Resumen
células B y T, con sus repertorios de antígenos-receptores extremadamente diversos, tienen la capacidad de montar respuestas inmunitarias específicas contra casi cualquier patógeno invasor1,2. Es comprensible que estas intrincadas capacidades estén controladas por un gran número de moléculas implicadas en diversos procesos celulares paragarantizar respuestas inmunitarias oportunas y espacialmente reguladas. Aquí, describimos procedimientos experimentales que permiten el aislamiento rápido de linfocitos murinos altamente purificados utilizando tecnología de clasificación de células magnéticas. Los linfocitos purificados resultantes pueden ser sometidos a diversos ensayos funcionales in vitro o in vivo, como la determinación de la capacidad de señalización de los linfocitos tras la estimulación por inmunotransferencia4 y la investigación de las capacidades proliferativas mediante la incorporación de 3H-timidina o el marcaje de éster succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE)5-7. Además de comparar las capacidades funcionales de los linfocitos control y los linfocitos modificados genéticamente, también podemos determinar la capacidad estimuladora de las células presentadoras de antígenos (APC) in vivo, como se muestra en nuestros resultados representativos utilizando células T OT-I trasplantadas marcadas con CFSE.
Introducción
Los linfocitos maduros generalmente existen en estado de reposo si no hay infección o inflamación preexistente en el individuo. Por lo tanto, es importante mantener el estado previo de los linfocitos durante el proceso de aislamiento antes de realizar ensayos funcionales in vitro o in vivo. La clave para garantizar resultados consistentes y reproducibles es limitar cualquier manipulación innecesaria de las células.
La clasificación magnética de células utiliza anticuerpos y microperlas para etiquetar las células con el fin de enriquecer la población celular de interés. Con este enfoque, hay dos estrategias de purificación....
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Protocolo
Todos los ratones son criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos y todos los protocolos de ratón se llevan a cabo de acuerdo con las directrices del Comité para el Cuidado y Uso de Animales institucional.
1. Preparación de tampones y reactivos
- Preparar Memorial Institute completa Roswell Park (RPMI) medio (10% de suero inactivado por calor bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (100 UI / ml) / estreptomicina (100 mg / ml), 55 mM 2-mercaptoetanol ).
- Preparar 20x solución salina equilibrada (BSS) Lote 1 y 2, por separado.
- Preparar 20x BSS stock 1 (111 mM dextrosa, fosfato de p....
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Resultados
purificación celular magnética de linfocitos permite a los usuarios para purificar una población de células diana en un período relativamente corto de tiempo. Utilizando el protocolo de agotamiento, hemos sido capaces de aumentar el porcentaje de células T CD8 (OT-I en la recombinación de activación de gen-1 (RAG-1) ratones deficientes) de 72,8% (antes de la purificación) a 94,2% (después de la purificación; Figura 1 A) 4,5. Estos linfocitos purificados se pue.......
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Discusión
En este protocolo, se demuestra un procedimiento para la purificación de los linfocitos de los órganos linfoides. la purificación de células utilizando la clasificación perla magnética es un método rápido y simple que produce células diana viables, altamente purificados.
Los pasos críticos dentro del Protocolo
La viabilidad celular y el rendimiento celular
El mantenimiento de la viabilidad de las células del linaje hema.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El estudio es apoyado por el Ministerio de Educación, Singapur (ACRF Tier1-RG40 / 13 y Tier2-MOE2013-T2-2-038). El manuscrito fue editado por Amy Sullivan de Obrizus Comunicaciones.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales | |||
| RPMI 1640 (sin L-Glutamina) | Gibco | 31870025 | |
| Suero | Inactivado por el calor | ||
| L-glutamina | Gibco | 25030024 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | |
| Microperlas magnéticas anti-CD43 | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mezclar bien antes del uso |
| Microesferas de estreptavidina | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mezclar bien antes del uso |
| Perlas magnéticas anti-anexina V | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mezclar bien antes del uso |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Placa de cultivo estéril con fondo en U de 96 pocillos | Greiner Bio-one | 650180 | |
| Placa de cultivo estéril con fondo F de 96 pocillos | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μ m malla | Para esterilizar usando radiación UV uso previo | ||
| 0.2 μ m unidades de filtro desechables estériles | Nalgene | 567-0020 | Puede ser sustituido por cualquier dispositivo de filtro estéril |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV para abreviar; alternativa a CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY para abreviar; alternativa a CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR para abreviar; alternativa a CFSE |
| Tinte de proliferación celular eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 para abreviar; alternativa a CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternativa a CFSE |
| strong>Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrosa | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Fenol rojo | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Cloruro de calcio dihidratado | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Cloruro de potasio | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Cloruro de sodio | Merck Millipore | S7653 | Se puede utilizar de otras fuentes |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Sulfato de magnesio | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Cloruro de amonio | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimetilsulfóxido | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(y 6-) diacetato de carboxifluoresceína éster succinimidilo (CFSE) | Sondas moleculares | C-1157 | Reconstituir en DMSO |
| Forbol 12,13-dibutirato (PBDU, éster de Forbol) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Ionóforo de calcio) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comments |
| Anticuerpos y proteína recombinante | |||
| depleción de células T | |||
| CD11c biotina (clon N418) | Biolegend | 117304 | Cóctel de depleción de células T |
| Biotina Gr-1 (clon RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | cóctel de depleción de células T |
| Ter119 biotina (clon Ter119) | Biolegend | 116204 | cóctel de depleción de células T |
| TCR-γ δ biotina (clon GL-3) | Biolegend | 118103 | Cóctel de depleción de células T |
| CD19 biotina (clon 6D5) | Biolegend | 115504 | Cóctel de depleción de células T |
| B220 biotina (clon RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | Cóctel de depleción de células T |
| CD49b biotina (clon DX5) | Biolegend | 108904 | Cóctel de depleción de células T |
| CD4 biotina (clon GK1.5) | Biolegend | Cóctel de depleción de linfocitos T | |
| 100404 CD8 biotina (clon 53-6.7) | Biolegend | 100704 | Cóctel de depleción de linfocitos T |
| F(ab')2 IgM anti-ratón de cabra (recubierto de placa) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos) |
| Anti-ratón CD40 mAb (recubierto de placa) | Pharmingen | 553722 | 50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos) |
| IL-4 | ProSpec recombinante; | Cyt-282 | |
| LPS de E. coli Serotipo 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clon clon OKT3) (placa recubierta) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos) |
| Anti-CD28 (clon clon 37.51) (recubierto de placa) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos) |
| Albúmina recombinante IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| de clara de huevo de gallina, ovoalbúmina | Sigma Aldrich | A7641 |
Referencias
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoy....
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Reimpresiones y permisos
