Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen

9.3K vistas

⸱

DOI:

10.3791/54611

⸱

12 de noviembre de 2016

 ,  , 
1Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University, OARDC, 2Department of Plant Pathology, The Ohio State University, OARDC, 3Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University, OARDC, 4OARDC Metabolite Analysis Cluster, The Ohio State University, OARDC

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un método para la detección y cuantificación de ácidos orgánicos a partir de material vegetal utilizando electroforesis capilar zonal libre. Un ejemplo de la aplicación potencial de este método, la determinación de los efectos de una fermentación secundaria en los niveles de ácido orgánicos en semillas de café, se proporciona.

Resumen

Los ácidos carboxílicos son los ácidos orgánicos que contienen uno o más terminales carboxilo (COOH) grupos funcionales. ácidos carboxílicos de cadena corta (SCCAs; ácidos carboxílicos que contienen de tres a seis átomos de carbono), tales como malato y citrato, son fundamentales para el buen funcionamiento de muchos sistemas biológicos, donde funcionan en la respiración celular y pueden servir como indicadores de la salud de las células. En los alimentos, el contenido de ácido orgánico puede tener un impacto significativo en el sabor, con un aumento de los niveles de SCCA que resulta en un sabor "ácido" o amargo. Debido a esto, los métodos para el análisis rápido de los niveles de ácido orgánicos son de particular interés para las industrias de alimentos y bebidas. Desafortunadamente, sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados para la cuantificación SCCA dependen de protocolos consumen mucho tiempo que requieren la derivatización de las muestras con reactivos peligrosos, seguido de cromatografía costoso y / o espectrometría de masas. Este método detalla un método alternativo para la detección y cuantificación de orgAnic ácidos a partir de material vegetal y las muestras de alimentos utilizando electroforesis capilar de zona libre (CZE), a veces denominado simplemente electroforesis capilar (CE). CZE proporciona un método rentable para medir SCCAs con un bajo límite de detección (0,005 mg / ml). En este artículo se detalla la extracción y cuantificación de SCCAs a partir de muestras de plantas. Mientras que el método proporcionado se centra en la medición de SCCAs de granos de café, el método proporcionado se puede aplicar a múltiples materiales de alimentos de origen vegetal.

Introducción

Los ácidos carboxílicos son compuestos orgánicos que contienen uno o más grupos funcionales carboxilo terminales, cada uno unido a un grupo R que contiene uno o más carbonos (R-C[O]OH). Los ácidos carboxílicos de cadena corta y bajo peso molecular (ácidos carboxílicos de cadena corta, SCCA) que contienen entre uno y seis carbonos, son componentes esenciales de la respiración celular y funcionan en varias vías bioquímicas necesarias para el crecimiento y desarrollo celular. Las SCCA desempeñan un papel fundamental en el metabolismo celular1, la señalización celular2 y las respuestas de los organismos al medio ambiente (como la antibiosis3). Debido a esto, los SCCA pueden servir como indicadores útiles de interrupciones en el metabolismo celular, respuestas al estrés de las plantas4,5 y calidad de la fruta6,7. Hasta la fecha, las SCCAs se han cuantificado principalmente mediante técnicas cromatográficas como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o la cromatografía de gases-espectroscopia de masas (GC-MS). Si bien estos métodos son capaces de alcanzar límites de detección muy bajos, pueden ser costosos, requieren la derivatización de SCCA objetivo utilizando reactivos cáusticos y/o tóxicos, e incluyen largos ciclos de separación en el GC o HPLC. Debido a esto, el interés en el uso de la electroforesis capilar zonal libre (CZE), que no requiere derivatización de la muestra, para cuantificar los ácidos orgánicos ha aumentado constantemente8.

La electroforesis capilar se ha utilizado para detectar y cuantificar ácidos carboxílicos de cadena corta durante casi dos décadas13. El poder de resolución (especialmente para moléculas pequeñas y cargadas), el corto tiempo de ejecución y el bajo costo por muestra de los análisis CZE hacen de CZE una técnica ideal para la separación y cuantificación de SCCAs13. Este método presenta un protocolo para utilizar CZE para medir la concentración de ácidos orgánicos de los tejidos vegetales. Ejemplos de datos se generaron a través de la implementación exitosa de este protocolo para medir el cambio en los niveles de ácido orgánico en las semillas de café después de un tratamiento de fermentación secundaria. El protocolo detalla los pasos críticos y los errores comunes de la separación de SCCAs basada en CZEs, y discute los medios por los cuales este protocolo puede ser aplicado con éxito para cuantificar SCCAs en tejidos vegetales adicionales.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Preparación de muestras

  1. Montar las muestras para la extracción de ácido carboxílico de cadena corta (SCCA). Preparar 1,0 g de semillas de café a la vez para asegurar que la muestra lo suficientemente permanecerá después del procesamiento.
    1. Si las muestras se congelaron antes del proceso de molienda, mantener el tejido congelado en todo el procesamiento para evitar congelación / descongelación daño y la oxidación de la muestra. Retirar la muestra del congelador o el almacenamiento bajo cero sólo cuando sea necesario para la molienda.
    2. congelación de flash muestras frescas en nitrógeno líquido inmediatamente antes de probar la molienda. Para reducir al mínimo la manipulación de muestras, las muestras de congelación de flash colocándolos en un mortero pre-llena de nitrógeno líquido.
    3. Analizar muestras de líquido inmediatamente después de la generación, o la congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -20 ºC o -80 ºC hasta su análisis. Antes del análisis, extraer muestras congeladas de almacenamiento y permitir que se descongele. Para muestras líquidas continúe en el paso (3.5) para su procesamiento.
  2. Use aproequipos de protección individual proceda (por ejemplo gafas protectoras, guantes y bata de laboratorio) antes de trabajar con nitrógeno líquido.
  3. Muestras de tejido triple de molienda hasta obtener un polvo fino uniforme (es decir, del tamaño de partícula uniforme) en nitrógeno líquido utilizando un mortero y una maja de cerámica.
    NOTA: La consecución de un tamaño de partícula uniforme es esencial para maximizar la eficiencia de extracción de SCCA.
    1. Pre-enfriar el mortero y mortero con nitrógeno líquido antes de la adición de la muestra. Mantenga el mortero lleno de un pequeño volumen de nitrógeno líquido como se añade la muestra.
    2. Usando una cuchara, agregue suficiente nitrógeno líquido para el mortero para sumergir completamente la muestra.
    3. Añadir fácilmente muestras molidas, tales como hojas o el café tostado, al nitrógeno líquido y aplastar con un movimiento de molienda circular. Comenzar a moler muestras cuando el nivel de nitrógeno líquido ha disminuido hasta el punto en que apenas cubre las muestras.
    4. Añadir difícil de moler muestras, por ejemplo unas semillas de café crudos, a nitrógeno líquido y permita que se congelen durante 10-30 segundos (o hasta que el nitrógeno líquido deja hervir vigorosamente) antes de la molienda. Romper el tejido en fragmentos más pequeños con un movimiento de aplastamiento vertical, y el tejido continuación completa de molienda usando un movimiento circular de molienda.
    5. Repetir los pasos 1.3.2-1.3.4 dos veces más, por lo que las muestras se molieron con un total de tres veces. Típicamente, tres rondas sucesivas de molienda reducirán muestras a un polvo con una consistencia de harina similares.
    6. Si no se logra una consistencia de harina-como, repita los pasos 1.3.2-1.3.4 hasta que las muestras se reducen a un polvo de tamaño de partícula uniformemente pequeño (eficacia de la extracción es inversamente proporcional al tamaño de partícula).
  4. Transferir el polvo a viales de vidrio o tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Iniciar el procesamiento aguas abajo inmediatamente después de la molienda (recomendado), o las muestras almacenadas a -80 ºC hasta que las muestras están listas para la extracción.
    1. Si las muestras deben almacenarse antesanálisis, dividir la muestra en partes alícuotas de 500 mg (o 500 ml de alícuotas de muestras líquidas) y dividir entre varios tubos para el almacenamiento. Evitar someter las muestras a ciclos de congelación / descongelación repetidos, ya que pueden alterar la composición de la muestra e impactar negativamente en futuras mediciones de muestras.

2. Preparación estándar de ácido orgánico

  1. Montar patrones auténticos de los SCCAs de interés. Estos se pueden usar para crear soluciones estándar externos e internos para uso en la determinación de concentraciones de SCCA. Para muestras de café incluyen cítrico, málico, acético, y ácido láctico como ácidos de interés y ácido adípico como el estándar interno.
    1. Asegúrese de asegurarse de que el patrón interno seleccionado no se encuentra naturalmente en la muestra, y que la norma no co-eluyen con otros picos en el perfil de la muestra.
    2. Ejecutar las curvas de calibración para cada SCCA de interés, y determinar el intervalo de respuesta lineal para cada SCCA (véase la sección 4 para el funcionamiento de instjaleos). Asegúrese de hacer pasar las curvas de calibración para cada SCCA a medir en la muestra.
      NOTA: Las curvas de calibración se pueden ejecutar en cualquier tampón o el fondo de la muestra a ensayar. En el segundo caso ( "adición estándar"), los valores para el área del pico de cada punto de la curva estándar se determinan restando distancia el fondo de la muestra.
    3. Pre-etiqueta de todos los tubos necesarios y cristalería con el nombre de SCCA ácido, la concentración y la fecha del ensayo.
  2. Preparar soluciones madre para cada estándar a una concentración conocida (10 mg / ml) utilizando un matraz aforado para garantizar la precisión durante la preparación estándar.
    1. Disolver normas SCCA sólidos (ácido cítrico y ácido málico) en agua ultrapura (18,2 mO) para alcanzar la concentración deseada para la solución de reserva.
      1. Crear una 10 mg solución / ml de stock mediante la adición de 100 mg de estándar a un matraz volumétrico de 10 ml. Llenar el matraz hasta la marca de 10 ml con agua ultrapura para dissolve el ácido.
      2. Crear una menor concentración de ácido estándar o calentar suavemente los frascos para conducir difíciles de disolver las normas de SCCA, como el ácido adípico, en la solución.
    2. Diluir los estándares de ácido fase líquida (ácido acético y ácido láctico) en agua ultrapura para lograr la concentración deseada.
      1. Pre-llenar un matraz volumétrico con 5 ml de agua ultrapura. Añadir ácido suficiente para preparar una solución de 10 mg / ml (calculado utilizando la densidad del ácido proporcionado por el proveedor) al matraz, y luego añadir agua suficiente para llevar el volumen final de la solución a 10 ml.
  3. Transferir cada solución madre a un tubo de vidrio de 15 ml limpio, con un politetrafluoroetileno (PTFE) forrada gorra, y sellar con una película de plástico de parafina. Las soluciones madre se pueden almacenar en tubos sellados a 4 ºC durante 1 semana.
    1. Garantizar que las normas de SCCA no han precipitado en la solución antes de su uso si las soluciones madre han sido refrigerados después de preparación. Drive precipita de nuevo en solución a través de un calentamiento suave.
  4. Preparar la solución de extracción SCCA. Incluir el patrón interno a una concentración suficiente para la detección en las muestras (0,05 mg / ml). Preparar suficiente solución para extraer todas las muestras.
    1. Preparar 50 ml de solución de extracción SCCA por dilución de la solución madre de patrón interno a 0,05 mg / ml en agua ultrapura. Añadir 250 l de la solución madre de patrón interno (10 mg / ml) a 49,75 ml de agua.
    2. Si el extracto necesita ser diluida, ajustar la concentración de patrón interno en la solución de extracción de modo que la concentración final caerá dentro de los límites de cuantificación (dando un detectable, pero no sobre-saturado, pico, ver 5.2.2 más adelante) de la sistema de CE después de la dilución (0,05 mg / ml).
    3. Preparar la solución de extracción fresco para cada serie de extracciones (es decir, para cada serie experimental).
  5. Preparar muestras de la curva estándar(Una serie de diluciones apropiadas) para SCCAs de interés, utilizando un mínimo de al menos 5 puntos. Las concentraciones de la curva estándar empleadas tendrán que estar en el rango de respuesta lineal para un determinado SCCA, y abarcan las concentraciones de SCCA que se esperan de las muestras.
    1. Incluir el patrón interno seleccionado en las soluciones de la curva estándar para permitir la cuantificación del patrón interno en las muestras. El estándar interno se utiliza para ayudar en la identificación de los picos y calcular la eficiencia de extracción (sección 6).
    2. Diluir cada SCCA a las concentraciones determinadas anteriormente (0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 mg / ml; ver más arriba, 2.4.2) en nuevos tubos de microcentrífuga (uno para cada punto de la curva de concentración / estándar) usando agua ultrapura. Preparar 1 ml de solución para cada punto de concentración curva estándar. Asegúrese de que cada punto de concentración contiene las cuatro normas de ácido y el patrón interno en la concentración correcta.
    3. Preparar nuevos puntos de la curva estándar para cada conjuntode muestras que deben ejecutarse en el sistema de electroforesis capilar. Mantenga las muestras patrón de curva de SCCA a 4 ºC hasta su análisis, lo que ocurrirá después de la extracción de SCCAs de tejidos diana (sección 3).

3. Orgánica extracción ácida

  1. tubos de muestra Pre-etiqueta, la preparación de al menos un tubo para cada muestra a extraer.
  2. Eliminar las muestras que se extraen de almacenamiento y colocarlos en hielo, mientras que el pesado de material para la extracción.
  3. Pesar 100 mg de muestra para la extracción de SCCA.
    1. Después de pesar cada muestra, la transferencia de tejido a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml. Medir una cantidad de muestra de lo más cercano a la masa objetivo como sea posible para reducir la variabilidad.
    2. Realizar un seguimiento de la masa de cada muestra medida, ya que las cantidades de SCCAs detectados se normalizaron mediante la masa de la muestra (véase el apartado 6.5.2, a continuación).
  4. Después de sopesar todas las muestras, añadir 1 ml de solución de extracción (el tardíor + mezcla de patrón interno de la etapa 2.4) a cada uno de los tubos de muestra. Mantener la relación de solución de extracción de la masa de tejido de la misma a través de todas las extracciones (en este caso 1 ml de 100 ± 5 mg de tejido). Mezclar bien por vórtice durante 10 s.
  5. Dejar que las muestras en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Durante esta hora, la mezcla cada tubo cada 15 minutos como en el paso 3.4.
  6. Después de 1 h de extracción, mezclar las muestras una vez final y transferir tubos de muestra a una microcentrífuga. Centrifugar las muestras a 4 ° C, 10.000 xg durante 10 minutos para precipitar material sólido (paredes celulares, partículas, etc.).
    1. Al procesar muestras líquidas, añadir la concentración adecuada de patrón interno, brevemente y centrifugar la mezcla. Después de la centrifugación, el tratamiento de muestras líquidas de forma idéntica al extracto de muestras sólidas.
    2. Comprobar el pH de las muestras para confirmar que son compatibles con la gama de pH del tampón se ejecuta en el kit de detección (paso 4.6) o sistema tampón ser empLoyed. Como los volúmenes de muestra son por lo general bastante pequeñas, pH puede monitorizarse usando papel de pH.
  7. Prepárese para filtrar las muestras usando filtros de disco de jeringa montado en (3.8).
    NOTA: Evitar la pérdida de la muestra, asegurando que cada filtro está correctamente fijada a una jeringa antes de transferir el sobrenadante. Preparar una jeringa equipada con un filtro de disco para cada muestra a analizar (incluyendo muestras de la curva estándar).
  8. Después de la centrifugación de las muestras y preparación de los filtros de jeringa, transferir el sobrenadante de cada muestra a una jeringa de 3 ml equipada con un filtro de jeringa de 0,2 micras. Use un filtro nuevo y la jeringa para cada muestra. Filtro de todas las muestras, incluyendo muestras de la curva estándar y controles de tampón, antes de que se ejecuta en el sistema de CE.
  9. Filtrar la muestra directamente en un tubo de microcentrífuga limpio. Después de la filtración, el filtrado cerrar tubo que contiene el aparato y desechar la jeringa / filtro.
  10. Inmediatamente colocar muestras filtradasen el sistema de la CE para la detección de SCCA; o las muestras se almacenan a 4 ° C durante la noche. Si las muestras se almacenaron durante una noche, sellar los tubos con película de parafina de plástico para evitar el intercambio de gases y la evaporación de la muestra.
    1. Si las muestras se deben almacenar más de un día después de la filtración, extractos de congelación de flash en nitrógeno líquido o congelación a -20 ºC. Después de la descongelación, sin embargo, asegúrese de que cada muestra se examina para la formación de precipitado y el filtro si es necesario (como en el paso 3.6).

4. Ajuste de la detección Ejecutar SCCA

  1. Consulte el manual del usuario para obtener más detalles PROGRAMACION- CE y de control específicas de software.
  2. Preparar los viales de muestra de electroforesis capilar (CE) para la detección de SCCA. Asegurar viales se etiquetan, limpias y libres de defectos.
  3. Lavar y secar los tapones de los viales de la CE antes de su uso.
    1. Lavar las tapas sumergiéndolas en agua ultrapura y que les permite remojo la noche anterior. Después de remojar las tapas, desechar el remojoing solución y enjuague las tapas de dos veces más con agua ultrapura.
    2. Transferencia enjuaga tapas a una superficie de secado limpio forrado con paño libre de pelusa y permita que se seque al aire. Asegurar las tapas estén completamente secas antes de su uso para evitar fallos de presión.
  4. Transferir 1 ml de muestra a cada vial CE, teniendo cuidado de evitar salpicaduras de la muestra en el cuello del vial accidentalmente. Después de la transferencia, coloque una tapa de la CE en el vial.
    1. Si se necesita una dilución, diluir las muestras de semillas de café 1:10 o 1: 100 directamente en el vial CE usando agua ultrapura. Para diluciones superiores a 1: 100, crear una dilución intermedia para evitar los errores de pipeteo.
  5. Preparar un vial para cada punto de la curva estándar mediante la transferencia de las soluciones de la curva estándar (1,0 ml) de la Etapa 2.5 a viales de CE. Tapar cada tubo después de la transferencia.
  6. Preparar una solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 M mediante la adición de 0,04 g de NaOH a un vaso de precipitados que contiene 90 ml de agua ultrapura y permitiendo que los gránulos de to disolverse. Transferir la solución 0,1 M de NaOH a un matraz aforado de 100 ml y llevar el volumen total a 100 ml.
  7. Añadir 1 ml de solución de NaOH 0,1 M a un vial limpio CE y la tapa.
  8. Preparar viales tampón CE para cada lote de muestras que se ejecutan en el sistema de la CE. Kits de separación están disponibles o tampones personalizados se pueden utilizar 13.
    1. Preparar 1 vial con 1 ml de solución tampón de partida y la tapa.
    2. Preparar tres viales con 1 ml de cada una de ejecutar la solución tampón y la tapa. Sustituir el tampón de desarrollo antes de cada lote de muestras y puntos de la curva estándar, o después de 35 muestras, lo que ocurra primero.
    3. Llenar tres frascos adicionales con 1 ml de agua ultrapura y la tapa cada vial.
    4. Preparar 1 vial vacío "residuos" con el casquillo.
  9. Después de preparar los viales descrito en la etapa 4.8, la carga de los viales que contienen los tampones y el agua, así como los viales de residuos (de los pasos 4.8.2-5) en la bandeja de amortiguamiento de la electroforesis capilar sysTEM, según las instrucciones de fabricante 15. Con cuidado, tenga en cuenta la posición de cada vial para la programación muestreador automático.
  10. Cargar los viales que contienen los puntos de la curva estándar y los viales que contienen las muestras a ensayar en la bandeja de entrada de la muestra, como se describe en las instrucciones del fabricante. Tenga en cuenta la posición de cada vial para la programación muestreador automático (consulte los pasos 4.11.1 abajo).
  11. Preparar acondicionado y métodos de separación de muestra (programas para estos se proporcionan en las Tablas 1 y 2, respectivamente), y escribir un archivo de secuencia de la muestra según el manual de instrucciones del instrumento. Usar el método de separación se detalla en la Tabla 2: enjuagar la columna con iniciador (20 psi) durante 0,2 min; enjuague con acelerador (20 psi) durante 0,5 min, inyectar muestras (0,5 psi) en la columna de 0,09 min, muestras separadas a 20 kV durante 12 minutos, enjuague con NaOH (20 psi) durante 0,5 minutos, y finalmente enjuagar con agua ( 20 psi) durante 0,5 min.
    1. Using el software de control CE, escribir la secuencia de muestras en funcionamiento (es decir, la lista de trabajo; un archivo de lista que detalla el orden en el que se analizarán las muestras, y el método que se utilizará para separar cada muestra) mediante la interfaz de hoja de cálculo "secuencia". Cada fila en la hoja de cálculo corresponderá a una muestra de ejecución y producir un único archivo de datos.
      1. Asegúrese de que al escribir el archivo de secuencia, las muestras se identifican utilizando la posición correcta en la bandeja de muestreo. Asegúrese de que cada archivo de datos tiene un nombre único para evitar que el software sobrescribir los archivos anteriores. Programa de CE capilares acondicionado se ejecuta como una secuencia separada antes de realizar la secuencia que contiene el método de separación de muestras.
    2. Comience la secuencia de muestras correr con las soluciones de la curva estándar, seguido por las muestras de SCCA, y terminar con una segunda ejecución de las soluciones de la curva estándar. Esto permitirá un cálculo del grado de pérdida de señal que ocurren durante los análisis de la muestra.

    figure-protocol-1
    Tabla 1: Programa método acondicionado usado para preparar el capilar para la separación de cadena corta de ácido carboxílico a través de electroforesis capilar a.

    figure-protocol-2
    Tabla 2: Programa de Separación método utilizado para los análisis de ácidos carboxílicos de cadena corta mediante electroforesis capilar a.

    5. Detección de SCCA Run Ejecución y Recolección de Datos

    1. Comenzar las carreras de acondicionamiento capilar. Esperar para acondicionar el capilar dos o tres veces antes de la columna está lista para la separación de la muestra. Acondicionamiento de la columna debe realizarse como se describe en la Tabla 1. En pocas palabras, lavar la columna con NaOH 0,1 M (20 psi) durante 1 min, enjuagar con agua (20 psi) durante1 min, enjuague con iniciador (20 psi) durante 0,5 min, se aclaró con acelerador (20 psi) durante 0,5 min, acelerador por separado en 30 kV durante 10 minutos, enjuague columna con M NaOH 0,1 (20 psi) durante 0,5 min, y finalmente lavar la columna con agua (20 psi) durante 0,5 min.
      1. Condicionar el capilar antes de cada secuencia de muestras de ejecución. Lograr un acondicionamiento adecuado, manteniendo la tensión de separación es constante a lo largo de la carrera y la observación de una línea de base plana sobre la traza de red de fotodiodos.
    2. Después del acondicionamiento, iniciar la separación de la muestra, abra el menú "Control" en el software y la selección (es decir, al hacer clic en) "secuencia de ejecución." Monitorear la traza de red de fotodiodos (PDA) para asegurar la separación adecuada.
      1. Observar la primera traza y garantizar que cuenta con una línea de base plana y limpia resolvió (resolución de línea de base), los picos de ácido individuales. Más cargadas las muestras presentarán colas de largo pico, o colas de los picos, y tendrán que ser diluidos (figura 1).

    figure-protocol-3
    Figura 1:. Una comparación de los rastros de PDA destacando una muestra sobrecargado medida que aumenta la concentración de analito, la geometría pico individual puede empezar a ser asimétrica. En (a) 0,05 mg / ml, ácido acético presenta un pico bien definido, de forma bilateral simétrica. Como aumenta la concentración de ácido acético a (b) 0,07 mg / ml y (c) 0,10 mg / ml, se forma un pico de cola (flechas). Este colas de los picos es una buena indicación de que la muestra está sobrecargado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    1. Al término de la secuencia de ejecución, abra los archivos de datos de uno en uno en el software de análisis de la CE e integrar los picos.
      1. Integrar picos de muestra.
        1. Abre el primer archivoy establecer los pasos de integración automática para excluir la primera 3 min de la carrera (donde la tensión, y por lo tanto la dirección de flujo de la columna, se invierte tal como se describe en la Tabla 1). En el mismo menú, establecer criterios de selección de pico a una anchura de pico mínimo de 50 unidades y el área del pico de 100 unidades (o la configuración predeterminada por el fabricante) para proporcionar un nivel moderadamente alto de selectividad, que separa los picos de ácido del ruido de fondo en la traza.
      2. comprobar manualmente los límites máximos y líneas de base para cada traza PDA para asegurar la integración de picos adecuado. Picos inadecuadamente integrados (es decir, un pico SEAC ligeramente asimétrica que se ha integrado como dos picos separados por el software automatizado) tendrán que ser re-integrado de forma manual.
    2. Después de la integración, ver el informe de porcentaje de área, a continuación, seleccionar y copiar el informe de porcentaje de área y pegarlo en una hoja de cálculo separada. Repita este procedimiento para cada muestra para construir el pico repor carrera completat con cada fila representa un único pico (es decir., cada pico debe contener un solo compuesto, si la separación está funcionando bien).

    Análisis 6. Datos

    1. Preparar los datos para el análisis usando la hoja de cálculo construido en (5,4). Comienza el análisis mediante el etiquetado de los estándares de ácido para cada uno de los puntos de la curva estándar, incluyendo el patrón interno.
    2. Calcular un índice de retención de cada pico dividiendo el tiempo de retención para cada pico en la muestra por el tiempo de retención del patrón interno en la muestra. Clasificar los datos establecidos por el índice de retención resultante para identificar los picos de interés en cada muestra.
    3. Después de identificar el pico para cada ácido de interés, la construcción de las curvas de calibración para cada ácido usando los puntos de la curva estándar externos.
      1. Generar una curva estándar (concentración) para cada estándar SCCA mediante la determinación del área de pico para cada concentración de los estándares de SCCA, y que representa la concentración en el xaxis vs. área de pico en el eje y. Trazar la regresión lineal para cada curva estándar SCCA y definir la ecuación de la pendiente (y = mx + b).
      2. Asegúrese de que los valores de R 2 de las regresiones lineales son 0,90 o superior como las cuantificaciones se realizan con mayor precisión en el rango lineal de la curva estándar.
    4. Calcular la concentración de ácido para un determinado SCCA en una muestra usando el área del pico y la ecuación de la pendiente de la recta de regresión lineal de la curva estándar (calculado en 6.3.2 anterior). Brevemente, se divide el área de pico observada para un ácido dado por la pendiente de la línea de regresión para la curva estándar de que el ácido.
      1. Corregir los valores de concentración primas calculadas en el paso 6.4 para la pérdida de muestra durante el procesamiento utilizando el estándar interno (paso 6.5).
    5. Calcular el factor de corrección para cada muestra utilizando el patrón interno.
      1. Divida la concentración real de la norma interna (es decir, KNOcantidad wn añadido al inicio del experimento) por el valor observado del patrón interno en la muestra (es decir, la cantidad calculada mediante la ecuación de la pendiente de la curva estándar para el estándar interno). Multiplicar los valores de concentración de cada primas SCCA en la muestra por este factor de corrección.
      2. Divida el estándar interno corregido concentración SCCA por la masa de la muestra utilizada para la extracción para corregir cualquier variación en la masa de la muestra. Este cálculo produce cantidad de analito por masa de muestra (mg SCCA por mg café molido en este ejemplo), que luego se puede convertir a las unidades apropiadas para el estudio dado (mg / mg, mg / g, g / g, etc. ).
    6. Después de calcular las concentraciones de SCCA (normalizado a cualquiera de la masa [para muestras sólidas o líquidas] o volumen [para muestras líquidas]), utilizar estos valores para el análisis estadístico según las exigencias del diseño y las cuestiones de interés experimental.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Este protocolo ha sido utilizado con éxito para medir los efectos de los tratamientos de semillas sobre el contenido SCCA de las semillas de café verde. En este experimento, los seis tratamientos fueron: una suspensión microbiana saturada de Leuconostoc pseudomesenteroides GCP674 cepa en su medio de crecimiento (1), una suspensión acuosa de GCP674 microbios en agua (2), una solución acuosa de ácido acético y ácido láctico (0,15 y 0,4 mg / ml, respectivamente) (3), un tratamiento...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Al igual que con cualquier técnica analítica, hay varios factores críticos que pueden afectar significativamente la calidad y la fiabilidad de los datos generados. En primer lugar, es importante procesar las muestras de manera eficiente, con un mínimo de ciclos de congelación / descongelación. Congelación y descongelación repetida pueden comprometer la composición química de la muestra antes de su procesamiento o análisis. En segundo lugar, es fundamental para aplicar las medidas de este protocolo para todas las muestra...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el apoyo financiero de este proyecto por parte de la empresa J.M. Smucker.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Moarter and Mortle de cerámicaCoorstek60310
Beckman Coulter P/ACE MDQ CE systemBeckman CoulterVarios
viales de muestra de vidrioFisher Inc.033917D
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Fisher Inc.02-681-5
Agua de grado LC/MSFisher Inc.W6-1Milli-Q agua (18.2  MΩ · cm) también es aceptable
tubo de vidrio de 15 ml / tapa revestida de teflón Fisher Inc.14-93331A
Parafilm MFisher Inc.13-374-12
Kit de detección CElixirOA pH 5.4 Jeringas MicroSolv06100-5.4
BD Safety-LokFisher Inc.14-829-32
Filtro de jeringa de 17 mm, PTFEFisher Inc.
32 quilates, V. 8.0 software de controlBeckman Coulter285512
viales de muestra de electroforesis capilar (CE) Beckman Coulter144980
tapones para viales CE Beckman Coulter144648
Liquid NitrogenN/AN/AEl nitrógeno líquido está disponible en la mayoría de los servicios de las instalaciones
3377154

Referencias

  1. Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
  2. Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
  3. Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
  4. Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders. Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).
  5. López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils. Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).
  6. Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC. Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).
  7. Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis. J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).
  8. Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids. Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).
  9. Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples. Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).
  10. Klampfl, C. W. Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods. Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).
  11. Kenney, B. F. Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).
  12. Galli, V., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee. J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).
  13. Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384(2008).
  14. Chromatographic analysis of the environment 3rd ed. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).
  15. ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation. , Eatontown, NJ, USA. (2001).
  16. Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).
  17. Ibanez, A. B., Bauer, S. Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy. Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Cuantificaci n de cidos org nicoscidos carbox licos de cadena cortaextracci n de tejido vegetalan lisis de semillas de cafelectroforesis capilar de zona libredetecci n de SCCAprotocolo de preparaci n de muestrasdetecci n por arreglo de diodospreparaci n de la curva est ndar
Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.