La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

Resumen

Muchas de las (fosfo)lipasas predichas están mal caracterizadas con respecto a sus especificidades de sustrato y funciones fisiológicas. Aquí proporcionamos un protocolo para optimizar las actividades enzimáticas, buscar sustratos naturales y proponer funciones fisiológicas para estas enzimas.

Resumen

Los microorganismos producen un amplio espectro de lipasas (fosfo) que son secretadas en el fin de hacer los sustratos externos disponibles para el organismo. Alternativamente, otros (fosfo) lipasas pueden estar asociadas físicamente con el organismo productor causando una facturación de lípidos intrínsecos y con frecuencia dando lugar a una remodelación de las membranas celulares. Aunque potenciales (fosfo) lipasas se pueden predecir con un número de algoritmos cuando la secuencia de gen / proteína está disponible, no ha sido obtenido con frecuencia prueba experimental de las actividades enzimáticas, especificidades de sustrato, y posibles funciones fisiológicas. Este manuscrito describe la optimización de las condiciones de ensayo de (fosfo) lipasas prospectivos con especificidades de sustrato desconocidos y cómo emplear estas condiciones optimizadas en la búsqueda para el sustrato natural de un respectivo lipasa (fosfo). El uso de sustratos cromogénicos artificiales, tales como derivados de p-nitrofenil, puede ayudar a detectar un menorla actividad enzimática de una lipasa predicho (fosfo) en condiciones estándar. Después de haber encontrado una actividad enzimática tal menor, los parámetros distintos de un ensayo enzimático se pueden variar con el fin de obtener una hidrólisis más eficiente del sustrato artificial. Después de haber determinado las condiciones en las que una enzima funciona bien, una variedad de posibles sustratos naturales deben ser analizadas para su degradación, un proceso que puede ser seguido empleando métodos cromatográficos diferentes. La definición de especificidades de sustrato de nuevas enzimas, a menudo proporciona hipótesis para un posible papel fisiológico de estos enzimas, que a continuación pueden ser probados experimentalmente. Siguiendo estas directrices, hemos sido capaces de identificar una fosfolipasa C (SMc00171) que degrada la fosfatidilcolina a fosfocolina y diacilglicerol, en un paso crucial para la remodelación de las membranas en la bacteria Sinorhizobium meliloti de las condiciones de fósforo limitante del crecimiento. Para dos predijo patatin-como fosfolipasas (SMc00930 y SMc01003) del mismo organismo, podríamos redefinir sus especificidades de sustrato y aclarar que SMc01003 es una lipasa diacilglicerol.

Introducción

Lípidos basados en glicerol tales como triglicéridos y fosfolípidos (glicero) constituyen importantes y probablemente las clases de lípidos más conocidos ^1. Triglicéridos (TG) son grasas o aceites, que por lo general funcionan como lípidos de almacenamiento, y por lo tanto, como posibles fuentes de energía y de carbono. Las etiquetas pueden ser degradadas por las lipasas, que con frecuencia son secretadas por el organismo productor de digerir variables externas y ponerlos a disposición como fuentes de carbono. Además, las lipasas se han estudiado ampliamente en los últimos años debido a sus importantes aplicaciones biotecnológicas ^2.

Protocolo

1. Clon y sobreexpresan gen estructural de la lipasa predicha

1. El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ¹⁴ y oligonucleótidos específicos (Tabla 1) ^15, amplificar el gen de interés (smc01003, smc00930, o smc00171), predijo para codificar una lipasa o fosfolipasa, a partir del ADN genómico del organismo huésped (es decir, , S. meliloti).
   1. Introducir sitios de restricción específicos (con la secuencia diseñada de los oligonucleótidos). Digerir el fragmento de ADN amplificado con las enzimas de restricción correspondientes y clonar en un vector de expresió....

Resultados

Actividad de la fosfolipasa-PC específico C SMc00171 con Bis- fosfato de p-nitrofenil

Extractos libres de células obtenidas a partir de E. coli BL21 (DE3) pLysS x, que tenían smc00171 expresaron, fueron estudiados por su capacidad para hidrolizar ésteres de fosfato-nitrofenil bis- p, utilizando un ensayo enzimático espectrofotométri.......

Discusión

Durante los últimos 20 años, los genomas de muchos organismos se han secuenciado y aunque una gran cantidad de datos de secuencia del genoma se ha generado, la interpretación funcional es la zaga, y por consiguiente, dificulta nuestra comprensión de la función del genoma. las funciones de genes en los genomas son a menudo asignados basándose en la similitud de los genes de función o la aparición de motivos conservados conocido. Sin embargo, la función exacta de un gen dado es a menudo no se conoce. Especialmente, predij.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloroformo	JT Baker	9180-03	TLC análisis & Extracción de lípidos
Metanol	JT Baker	9070-03	Análisis TLC & Extracción de lípidos
Ácido acético	JT Baker	9507-05	Análisis TLC & Extracción de lípidos
Hexanes	JT Baker	9309-02	Análisis TLC & Extracción de lípidos
Diethylether	Sigma	32203	Ensayos enzimáticos
agua bidestilada	CUALQUIER&	nbsp; NA	Ensayos enzimáticos
Tris Base	Sigma	T-1503	Ensayos enzimáticos
HCl	Baker	9535-02	Ensayos enzimáticos
NaCl	Baker	3624-01	Ensayos enzimáticos
Triton X-100	Sigma	X-100	Ensayos enzimáticos
LB caldo	ANY	NA	Crecimiento bacteriano, 10 g de triptona + 5 g de extracto de levadura + 10 g de NaCl por litro de agua bidestilada
triptona	Becton Dickinson and Company	211705	de crecimiento bacteriano
	Becton Dickinson and Company	212750	Crecimiento bacteriano
Caldo TY	ANY	NA	Crecimiento bacteriano, 8 g de triptona + 3 g de extracto de levadura + 66 mg de CaCl2· 2H2O por litro de agua bidestilada
CaCl2· 2H2O	Baker	1332-01	Ensayos enzimáticos
isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG)	Invitrogen	15529-019	Crecimiento bacteriano
Dietanolamina	Sigma	D-8885	Ensayos enzimáticos
MnCl2	Sigma	221279	Ensayos enzimáticos
Fosfolipasa A2 serpiente veneno	Sigma	P0790	Ensayos enzimáticos
Fosfolipasa C Clostridium perfringens	Sigma	P7633	Ensayos enzimáticos
Bis-p-nitrofenilo fosfato	Sigma	07422AH	Ensayos enzimáticos
p-nitrofenilo estearato	Sigma	N3627	Ensayos enzimáticos
p-nitrofenilo dodecanoato	Sigma	61716	Ensayos enzimáticos
p-nitrofenilo decanoato	Sigma	N0252	Ensayos enzimáticos
p-nitrofenilo palmitato	Sigma	N2752	Ensayos enzimáticos
p-nitrofenilo butirato	Sigma	N9876	Ensayos enzimáticos
p-nitrofenil octanoato	Sigma	21742	Ensayos enzimáticos
Ácido acético, sal sódica [1-14C]	Perkin Elmer	NEC084	Crecimiento bacteriano
dimetilsulfóxido (DMSO)	JT Baker	9224-01	Ensayos enzimáticos
Gel de sílice HPTLC de aluminio 60 placas. Placas de gel de sílice HPTLC tamaño 20 x 20 cm, 25 hojas.	Merck	105547	TLC análisis &
Espectrómetro de extracción de lípidos UV/VIS Lambda 35	Perkin Elmer	NA	Ensayos enzimáticos
Storm 820 Phosphorimager	Molecular Dynamics	NA	Escáner de luminiscencia fotoestimulable
Contador de centelleo multipropósito	Beckman Coulter	NA	Cuantificación de radiactividad
Célula de presión francesa	ThermoSpectronic	NA	Rotura de células
papel de cromatografía 3MM Chr	Whatman 3030917		TLC analysis
Sinorhizobium meliloti 1021nuestra	referencia 11		cepa estudiada
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Células competentes	Novagen	69451	cepa de expresión de proteínas
vector pET9a	Novagen	69431	vector de expresión de proteínas
vector pET17b	Novagen	69663	vector de expresión de proteínas
poliestireno estéril tubo de fondo redondo (14 ml) Falcon	Becton Dickinson	352057	radiomarcaje de cultivos bacterianos tubos de
microcentrífuga de polipropileno (1,5 ml)	Eppendorf	30125.15	Ensayos enzimáticos
1,2-dipalmitoil-sn-glicerol	Sigma	D9135	patrón lipídico
L-&alfa;-fosfatidilcolina, dipalmitoil	Sigma	P6267	patrón lipídico
DL-α-monopalmitina	Sigma	M1640	patrón
lipídico ácido palmítico	Sigma	P0500	patrón lipídico

Extracto de levadura