Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.
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Artículo de método
Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón
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Resumen
Resumen
La angiogénesis es el proceso por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos existentes. El crecimiento de nuevos vasos requiere la proliferación, migración y alineación coordinadas de las células endoteliales para formar estructuras tubulares, seguidas del reclutamiento de pericitos para proporcionar soporte mural y facilitar la maduración de los vasos. Los enfoques actuales de cultivo celular in vitro no pueden reproducir completamente el complejo entorno biológico donde las células endoteliales y los pericitos interactúan para producir vasos funcionales. Presentamos una nueva aplicación del ensayo in vivo matrix gel plug para estudiar las interacciones endotelio-pericito y la formación de vasos sanguíneos funcionales utilizando ratones con mutaciones de inmunodeficiencia combinada graves (SCID). En resumen, el gel de matriz se mezcla con una solución que contiene células endoteliales con o sin pericitos, seguido de una inyección en la parte posterior de ratones SCID anestesiados. Después de 14 días, los tapones de gel de la matriz se retiran, se fijan y se seccionan para el análisis histológico. La longitud, el número, el tamaño y la extensión de la cobertura pericitaria de los vasos maduros (definida por la presencia de glóbulos rojos en el lumen) se pueden cuantificar y comparar entre grupos experimentales utilizando plataformas estadísticas comerciales. Más allá de su uso como ensayo de angiogénesis, este ensayo de tapón de gel de matriz se puede utilizar para realizar estudios genéticos y como plataforma para el descubrimiento de fármacos. En conclusión, este protocolo permitirá a los investigadores complementar los ensayos in vitro disponibles para el estudio de las interacciones endotelio-pericito y su relevancia para la angiogénesis sistémica o pulmonar.
Introducción
La angiogénesis es el proceso por el que los nuevos vasos sanguíneos se forman a partir de una red vascular preexistente 1 y es el foco de la investigación en curso a través de muchas áreas que van desde el desarrollo normal a la enfermedad. Este proceso dinámico implica la proliferación y migración de células endoteliales (EC) y el reclutamiento de pericitos para la construcción de un tubo vascular que se dirige hacia el sitio que necesita oxígeno y nutrientes 2. Para estudiar este proceso requiere un ensayo igualmente dinámico, lo más importante que puede recapitular la naturaleza tridimensional de la formación del tubo. Los ensayos <....
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Protocolo
Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford.
NOTA: Los animales están bajo anestesia con isoflurano al 3% vaporizador y suministro de 3% de gas O2. El uso de ungüento veterinario en los ojos puede ayudar a prevenir la sequedad, mientras que bajo anestesia.
1. Preparación de la célula
- Crecer cultivos de células endoteliales y pericitos humanos en placas de 100 mm con 10 ml del medio de comunicación adecuado. Reemplazar 10 ml de medio fresco cada 2 - 3 días hasta que las células....
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Resultados
Representante tinción H & E y de inmunofluorescencia de secciones tapón de gel de la matriz se muestran en la Figura 2. Secciones de la CE únicamente las clavijas muestran algunos vasos que en su mayoría no son perfundidos con sangre (Figura 2 arriba a la izquierda, flechas negras), mientras que los tapones que contienen tanto las EC y los pericitos mostrar varios perfundidos vasos de mayor diámetro y la cobertura de pericitos completa, como se evide.......
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Discusión
El ensayo de tapón de gel de matriz ha demostrado ser un método conveniente y potente para evaluar la regulación de genes en la angiogénesis, los compuestos angiogénicos y antiangiogénicos en vivo, y como complemento a las pruebas in vitro. A continuación, describimos en detalle un nuevo ensayo tapón de gel de la matriz de la angiogénesis humana que investiga la interacción entre las células endoteliales y pericitos durante la formación de los vasos.
Hay algunas me.......
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Divulgaciones
No se adjuntan intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
El Dr. K. Yuan recibió el apoyo de una Subvención de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón (15SDG25710448) y el Premio de Prueba de Concepto (SPO121940 de la Asociación de Hipertensión Pulmonar). El Dr. V. de Jesús Pérez recibió el apoyo de un premio de desarrollo profesional de la Fundación Robert Wood Johnson, un premio K08 HL105884-01 de los NIH, un premio de la Asociación de Hipertensión Pulmonar, un premio de investigación biomédica de la Asociación Americana del Pulmón y un premio de Investigación Traslacional y Medicina Aplicada de la Universidad de Stanford.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PBS (solución salina tamponada con fosfato) | Corning | 21-031-CV | |
| 0,25% Tripsina/0,53 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Kit de medios de células endoteliales (ECM) | Sciencell | 1001 | incluye medios, suplemento de crecimiento EC y penicilina/estreptomicina, cada uno suministrado al volumen adecuado para facilitar la mezcla |
| Kit de medios de pericitación (PM) | Sciencell | 1201 | incluye medios, suplemento de crecimiento de pericitos y penicilina/estreptomicina, cada uno suministrado en el volumen adecuado para facilitar la mezcla |
| células endoteliales microvasculares pulmonares humanas primarias | Iniciativa Innovadora de Hipertensión Pulmonar | Este tipo de célula también está disponible comercialmente. Células utilizadas en el paso 1-4 de | |
| los pericitos pulmonares humanos primarios | Iniciativa Innovadora de Hipertensión Pulmonar Este | tipo de célula no está disponible comercialmente, pero los paricitos cerebrales sí lo están. Células utilizadas en el paso 1-4 | |
| bFGF (factor de crecimiento básico de fibroblastos) | Peprotech | 100-18B | es de 50 μ g/ml en 0,1% BSA en PBS, alícuotas a 50 μ l y almacenado a -20 grados |
| Matrigel Membrana Basal Matrix | BD 356237 | ||
| 28 G 1 cc Jeringa Insluin | BD | 329410 | |
| SCID (Inmunodeficiencia Combinada Severa) ratones | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD. La cepa SCID IL2R gamma knockout es la mejor cepa; 4-6 semanas de edad |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, estériles | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Tubos de rosca de 15 ml, estériles | BD Biosciences | 352096 | |
| Pluma PAP | Life Technologies | 8899 | |
| hemocitómetro | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair crema depilatoria | Walmart | ||
| anti-humano anti-humano anti-anti-humano CD31 anticuerpo primario | LS-B4737 | Biosciences | es 1:50 |
| anti-humano Actina de músculo liso CY3 anticuerpo fluorescente primario | Sigma | C6198 | es 1:300 |
| anticuerpo secundario anti-conejo de cabra; 488/verde | ThermoFisher Scientific | A-11008 | es 1:250 |
| Célula de solución Prolong Gold DAPI | Portaobjetos | de señalización 8961S | |
| VWR | 48300-047 | ||
| n.º 1,5 cubreobjetos | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| tampón de citrato 10x | Millipore | 21545 | |
| tijeras quirúrgicas extrafinas | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| ) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| Casetes de papel tisú | Simport | M492-12 | |
| suero de cabra | Dako | X0907 |
Referencias
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E.
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Reimpresiones y permisos
