Aquí demostramos cómo inducir y monitorizar la regeneración en la anémona de mar estrellada Nematostella vectensis, un antozoo cnidario modelo. Demostramos cómo amputar y categorizar la regeneración utilizando un sistema de estadificación morfológica, y utilizamos este sistema para revelar un requisito para la autofagia en la regeneración de estructuras de pólipos.
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Artículo de método
Inducir completa Pólipo regeneración de la aboral Physa de la anémona de mar Starlet Vectensis Nematostella
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Resumen
Resumen
Cnidarios, y en concreto Hydra, fueron los primeros animales indicado para regenerar estructuras dañadas o cortadas, y de hecho podría decirse que este tipo de estudios en marcha la investigación biológica moderna a través de la obra de Trembley hace más de 250 años. En la actualidad el estudio de la regeneración ha visto un resurgimiento usando ambos organismos regenerativas "clásicos", como la hidra, planaria y Urodeles, así como un espectro ensanchamiento de las especies que abarcan la gama de metazoos, a través de las esponjas mamíferos. Además de su interés intrínseco como un fenómeno biológico, la comprensión de cómo funciona la regeneración en una variedad de especies nos informará acerca de si los procesos regenerativos comparten características y / o especies comunes o mecanismos celulares y moleculares específicas del contexto. La anémona de mar estrella, Nematostella vectensis, es un organismo modelo emergente para la regeneración. Al igual que Hydra, Nematostella es un miembro de la antigua phylum, cnidarios, pero dentro de tque anthozoa clase, un clado hermano a la hidrozoos que es evolutivamente más basal. Así, los aspectos de la regeneración en Nematostella será interesante comparar y contrastar con los de Hydra y otros cnidarios. En este artículo, presentamos un método para dividir en dos, observar y clasificar a la regeneración del extremo aboral del adulto Nematostella, que se llama el Physa. El Physa sufre naturalmente fisión como medio de reproducción asexual, y, o bien la fisión natural o amputación manual de la Physa desencadena re-crecimiento y la reforma de morfologías complejas. Aquí hemos codificado estos cambios morfológicos simples en un Sistema de estadificación Nematostella Regeneración (la NRSS). Usamos la NRSS para poner a prueba los efectos de la cloroquina, un inhibidor de la función lisosomal que bloquea la autofagia. Los resultados muestran que la regeneración de estructuras de pólipos, en particular los mesenterios, es anormal cuando se inhibe la autofagia.
Introducción
La observación de la regeneración en un solo hydra fue el evento seminal en el advenimiento de la biología como un 1,2 ciencia experimental. La regeneración sigue siendo un fenómeno extraordinariamente amplia de apelación al biólogo y laico por igual. La posibilidad de que los biólogos del desarrollo, médicos, científicos e ingenieros biomédicos de tejido para comprender y superar los límites de la regeneración humana hace que la biología de regeneración más intrínsecamente interesante.
Ahora, con el uso de las tecnologías emergentes, tales como la secuenciación del genoma y la ganancia y pérdida de función de las herramientas, el campo está a punto de burlarse de los mecanismos regenerativos aparte y para entender en última instancia cómo varias especies pueden regenerarse mientras que otros no pueden. El grado de coincidencia en las respuestas moleculares, celulares y morfológicos que queda por esclarecer, pero hasta el momento parece que las respuestas básicas entre los animales que pueden regenerar es más similar que habría sido ImagiNed hace sólo una década 3.
Cnidarios en particular, son fácil a la regeneración casi todas las partes del cuerpo en medio de un amplio espectro de diversidad morfológica. Desde el pólipo solitario agua dulce, Hydra junto con los pequeños pólipos marinos que construyen inmensos arrecifes de coral, a los sifonóforos coloniales complejos, tales como el portugués Man-O-War, la regeneración es a menudo un modo de reproducción, además de un mecanismo para la reparación o la reforma de las partes del cuerpo dañados o perdidos como resultado de la lesión y la depredación. Si las diversas especies de cnidarios utilizan mecanismos similares o diferentes para la regeneración es una pregunta interesante, fundamentalmente, 4-6.
Nosotros, y otros han estado desarrollando la anthozoan, Nematostella vectensis como modelo para la regeneración 7-17. Recientemente hemos desarrollado un sistema de clasificación para describir la regeneración de un cuerpo entero de un pedazo de tejido morfológicamente uniforme dividido en dos de los ABORAl final del pólipo 10. Mientras que los pólipos Nematostella pueden regenerarse cuando queda dividido en dos en cualquier nivel, se optó por cortar los adultos en una posición aboral en la región más morfológicamente simple, el Physa, en parte porque este está cerca del plano normal de la fisión asexual natural de 18 años, y también porque permite la observación y análisis moleculares de cómo un cuerpo entero se vuelve a montar a partir de los componentes morfológicos simples.
El sistema de estadificación Nematostella Regeneración (NRSS) proporciona un conjunto relativamente simple de los puntos de referencia morfológicas que podrían ser utilizados para marcar el progreso de cualquier aspecto de la regeneración por un Physa amputada, en condiciones de cultivo normales o experimentalmente perturbado situaciones tales como tratamientos de molécula pequeña, la manipulación genética o alteración ambiental. Como se preveía, el NRSS se está adoptado como un andamio morfológica en la que puede hacer referencia a los eventos celulares y moleculares de la regeneración10.
Finalmente nuestro método de corte produce un enorme agujero de varios órdenes de magnitud mayor que la punción punto de terminales que se utiliza en un estudio reciente 17, sin embargo, ambas heridas se curan en torno a 6 horas. Documentación de las fases visualmente llamativas y distintas de cierre de la herida debe sugerir enfoques experimentales para explicar la aparente independencia del tamaño de una herida y el tiempo que toma para cerrar. Por lo tanto, una comprensión visual más profunda del proceso de amputación aboral, proporcionada por este protocolo, ayudará a nuevas investigaciones sobre este sistema de regeneración de modelo y de ampliar la aplicación de este sistema de estadificación usando Nematostella vectensis.
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Protocolo
1. Acondicionamiento de animales con la temperatura, la nutrición y la Luz del ciclo oscuro /
- Obtener adultos Nematostella vectensis de uno de los numerosos laboratorios de todo el mundo Nematostella, o un proveedor sin fines de lucro (Tabla 1)
- Mantener Nematostella a temperatura constante (típicamente entre 18 y 21 ° C) en la oscuridad, en "1 / 3x" Artificial Agua de Mar (ASW) a una salinidad de 12 partes por mil (ppt). Mantener los cultivos en placas de cultivo simples vidrio de sosa-cal, por lo general de 250 ml o 1,5 capacidad de 11 l.
Nota: Estas condiciones de cultivo simples se usan comúnmente entre los laboratorios que estudian Nematostella, pero el cuidado de cultivo también pueden automatizarse 19. - Alimentar Nematostella Artemia recién nacidas nauplios 2 - 4x por semana. Hatch Artemia quistes en toda su fuerza (36 ppt) o 1 / 3x ASW a 30 ° C, en un recipiente de vidrio rectangular poco profunda 20 o encualquiera de una serie de pequeña escala, los criaderos de camarón de salmuera comerciales o caseros. Si una incubadora no está disponible, camarones eclosionan a temperatura ambiente, pero lo hacen más lentamente.
Nota: Esto requiere a menudo más de 24 horas para su finalización. - Cambie el agua de cultivo anémona al menos una vez a la semana. Para obtener la mejor salud de los adultos, completamente limpio (sin jabón), el cultivo cuencos una vez por semana de las secreciones mucosas acumuladas, que cubra el recipiente y pueden atrapar los alimentos no consumidos y los residuos, y enredar a los animales.
2. Selección y relajación de los Animales Nutricionalmente acondicionado
- Seleccione los pólipos de tamaño con ajuste de aproximadamente la misma longitud (3 - 5 cm, cuando, naturalmente, relajado) y colocarlos en un recipiente separado de la colonia durante tres días antes de la amputación.
Nota: El número de animales seleccionados para el corte será determinado por el experimento está llevando a cabo, por supuesto, pero en general se recomienda un mínimo de cinco animales por punto de muestreo con seis repeticiones. Así,En un experimento típico de un mínimo de 30 animales se preselecciona. En general, es aconsejable seleccionar más que el número mínimo (30), ya que las amputaciones que son irregulares (véase más adelante) puede afectar a más de puntuación. - Retirar la cápsula de animales seleccionados de la incubadora en la luz de la habitación al menos una hora antes de la amputación.
Nota: La exposición a la luz de la sala y las vibraciones de la manipulación probablemente hará que los animales se contraigan, por lo que necesitan ser adaptados o "relajado" por incubación en la mesa de laboratorio. Los animales serán refractarios al tacto ya la exposición a la luz y en ese momento puede ser movido por pipeteo suave. - Opcional: Anestesie los animales mediante la adición de 7,5% de MgCl2 (en 1 / 3x ASW). Añadir suavemente la solución de MgCl2 en el recipiente con un plástico de 5 ml pipeta estándar.
Nota: Aunque los animales con el tiempo habituado a la luz y a la manipulación física, puede ser ventajoso para anestesiar a los animales para mantener o "arreglar" tse relajó estado después de que se han convertido en 16,21,22 alargada. - Utiliza una amplia perforación (> 0,5 cm) pipeta de plástico para transferir (en 1 / 3x ASW) de cinco animales de la piscina a ser amputada, en el fondo de un plato de corte de vidrio estéril de 100 mm de diámetro que contiene 12 partes por mil ASW. Coloque el plato en el escenario de un microscopio estereoscópico con aumento variable entre 10 - 40X.
Nota: Si los animales no han sido anestesiado y relajado para el corte, aún pueden responder al tacto y la iluminación estereoscopio y por lo tanto puede necesitar unos minutos para convertirse relajado de nuevo.
3. La amputación
- Con un bisturí estéril, amputar la Physa aboral de cada pólipo, con el objetivo de obtener una sección de la Physa que es aproximadamente el tiempo que es ancho y que no contiene mesenterio.
Nota: El sitio de corte ideal es sólo aboral a la terminación del mesenterio. En el plano de corte hay una transición de mesenterio adecuada para diluir lines correspondiente a cada inserción mesenterial (véase la Figura 1, las flechas). La ausencia de mesenterio es crítica, ya que produce mucosa que pueden facilitar 'tapar' el agujero 17,30.- Coloque la hoja de bisturí en contacto con el animal en el sitio deseado de la amputación. Para ello, sin necesidad de asistencia (a pulso), o agarrando suavemente el cuerpo del animal con unos fórceps # 5 (estilo Dumont o similares).
- Cortar a través del tejido mediante el aprovechamiento de la hoja curva del bisturí en un movimiento de "oscilación" a través del cuerpo.
Nota: El tejido debe cortar limpiamente como el bisturí se sacudió y liberar la sección deseada de Physa del donante. Sin embargo, si una pequeña porción de tejido sigue conectando el cuerpo y el Physa, cortar con el bisturí. No intente separar las piezas conectadas tirando, ya que esto puede dañar el Physa.
- Retire cada pólipo "donante" amputada del plato y devolverlo a una SEPAtazón dosis de etiqueta 'amputados puestas en común »; la fecha, el cuenco y devolverlo al cultivo de reserva.
Nota: Los pólipos amputados se cura la herida aboral en un día y luego pueden ser alimentados normalmente. Ellos se regenerarán un Physa aspecto normal dentro de dos semanas y en ese momento la Physa puede ser amputada de nuevo si lo desea. - Enjuague el Physa extirpado que permanecen en el plato de corte en 12 ASW ppt, a continuación, transferir cada Physa a un pocillo estéril independiente en una placa de cultivo celular de múltiples pozos que ya cuenta con 10 ml de 12 partes por mil ASW en cada pocillo.
Nota: En este ejemplo se utiliza una placa de seis pocillos, cada pocillo con la celebración de 10 ml de agua de mar y cinco Physa extirpado. En general, el agua de mar que debe cubrir los Physa lo suficiente como para evitar la exposición al aire debido al movimiento en el manejo y la evaporación potencial. La placa o pozos deben tener una tapa. - Repita los pasos 03.01 a 03.03 para recoger al menos 5 Physa en cada pocillo reservada para cada tratamiento experimental.
- Incubar la Physa a una temperatura que provide la mejor tasa de regeneración de los interrogatorios experimentales planificadas. Colocar la placa que contiene el Physa en una incubadora de temperatura regulada, a una temperatura fija determinada por la velocidad deseada de regeneración.
Nota: El Physa regenerará tejidos que faltan y formar un pólipo completo cuando se incuban a temperaturas entre 15 y 27 ° C. La tasa de regeneración es dependiente de la temperatura a excepción de las dos primeras etapas. El día medio para llegar a la etapa 4 para todas las temperaturas es de 7 d después del corte y esto también coincide con la regeneración a 21 ° C. A 27 ° C, Etapa 4 se alcanza alrededor de 3 días antes y a 15 ° C, Etapa 4 se retrasa en aproximadamente 3 días, en comparación con la regeneración a 21 ° C (también véase la referencia 10).
4. La evaluación de la regeneración con el sistema de clasificación de Nematostella Regeneración (NRSS)
- Anotar el Physa usando un microscopio estéreo-compuesto con magnífica variablesación (10 - 80X). Anotar el Physa Nematostella recién cortada que en la Etapa 0 y continuar anotando al mismo tiempo cada día después de la amputación (dpa) utilizando el NRSS 10.
Nota: Para los criterios clave de parada y los detalles se refieren referencia 10.- Puntuación Physa que en la Etapa 0 (herida abierta) si un Physa recién cortada aparece como una masa en forma de copa se asemeja a un globo flácida, con una zona de la herida abierta es probable visible.
Nota: Los bordes de la herida también podrían permanecer juntos desde el principio, pero estarán colapsado el tejido y la falta de rigidez. Los bordes de la herida abierta se pueden observar de someterse a la contracción radial como la herida se cura. - Puntuación Physa que en la Etapa 1 (herida cerrada) si la herida de la amputación aparece cerrado.
Nota: La ubicación de la herida se corresponderá con el futuro polo oral. La superficie exterior en torno al futuro polo oral puede comenzar a mostrar arcos distintos que corresponden a las inserciones subyacentes mesenterial endodermales radialmente simétrica. - ph puntajeYSA que en la Etapa 2 (de los arcos radiales) si la superficie del polo oral parece infla, revelando ocho arcos elevadas dispuestas en un patrón radialmente simétrica y separadas por ranuras. Observe ampollas pequeñas, hemisféricas en el vértice de los arcos. Ellos serán casi tan alto como ancho transitoria, probablemente, e inicialmente compuesto por una sola capa de células ectodérmicas.
Nota: En algunos casos, las vesículas de doble capa pueden estabilizarse. Nota: En esta etapa hacia adelante una capa mucosa puede parecer que encapsular el Physa (Figura 2) en una 'vaina' membranosa. Este material de encapsulación se debe quitar para facilitar la puntuación. - Puntuación Physa que en la Etapa 3 (tentáculo) si los brotes de los tentáculos que contienen capas de tejido endodérmico y ectodérmicas se forma estable formado en el extremo oral de al menos algunos arcos radiales.
Nota: Los tentáculos son más largos que anchos y están mínimamente móviles. El Physa mostrarán un aumento, pero la inflación variable de modo que rudimentos mesenterio puede llegar a ser visIble que se extiende desde la inserción mesenterial en la cavidad corporal (celenteron). - Puntuación Physa que en la Etapa 4 (mesenterios lineal) si el Physa contiene ocho mesenterios distintas, visibles que se extienden en la celenteron de inserciones en la pared del cuerpo, con longitudes orales-aboral que son más del doble de su anchura radial medida desde donde aparecen para conectar a la faringe en su extremo aboral (enterostome).
Nota: Cuatro o menos mesentenos tienen bordes libres internos "plisados". La faringe es visible. Más de ocho tentáculos son visibles, móviles y, a veces se contraen en el cuerpo. - Puntuación Physa que en la Etapa 5 (Predominio plisados mesenterio) si el Physa tiene más de cuatro mesenterio con plisado, y el plisado es más completa y sinuoso que en la Etapa 4. El animal tiene una apariencia casi adulta "normal", pero no hay visibles células gonadales.
- Puntuación Physa que en la Etapa 0 (herida abierta) si un Physa recién cortada aparece como una masa en forma de copa se asemeja a un globo flácida, con una zona de la herida abierta es probable visible.
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Resultados
La progresión de los acontecimientos morfológicos durante la regeneración en Physa cortada se muestra en la Figura 1A, que incluye vistas representativas de Physa en cada etapa NRSS. El sitio típico Physa corte se indica en el adulto (puntas de flecha). Las fotografías muestran en la Figura 1A regeneración progresiva de las estructuras orales y corporales de Physa recién cortada a través de pólipos completamente formado. Figura 1B, C mue...
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Discusión
El uso de Nematostella como modelo de curación y regeneración de la herida se está convirtiendo cada vez más popular. Por lo tanto, es importante ser capaz de visualizar los patrones morfológicos de un protocolo particular antes de los análisis celulares y moleculares eficaces pueden ser asignados y comparación. Nematostella tener un alto grado de regeneración "flexibilidad", siendo capaz de reformar casi cualquier estructura que falta amputada en cualquier lugar, en las etapas posteriores a ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una de Células Madre de Nueva York Ciencia (NYSTEM C028107) Subvención a GHT.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nematostella vectensis, adultos | Laboratorio de Biología Marina (MBL) | sin fines de lucro | |
| Plato de cultivo de vidrio, 250 mL | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 mL |
| Plato de cultivo de vidrio, 1,500 mL | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 mL |
| Pipeta de transferencia de polietileno, 5 mL | USA Scientific | 1022-2500 | diámetro estrecho, graduado |
| Pipeta de transferencia de polietileno, cónica | Samco | 202-205 | cortado 1 pulgada de punta para hacer un diámetro ancho |
| Bisturí desechable | Feather Safety Razor Co. Ltd | n.º 10 | La hoja debe ser curva# |
| 5 Pinzas de punta fina Dumont | Roboz | RS5045 | proveedores alternativos disponibles |
| Placa de Petri Pyrex, 100 mm de diámetro | Corning | 3160 | puede sustituir a otras placas de Petri de vidrio |
| Placa estéril de 6 pocillos | Corning Falcon | 353046 | o similar de otro fabricante |
| Placa estéril de 12 pocillos | Nunc | 150628 | o similar de otro fabricante |
| Placa estéril de 24 pocillos | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | o similar de otro fabricante |
| Kit de sombrero de camarones en salmuera | Bahía de San Francisco; drsfostersmith.com | CD-154005 | Opción para el cultivo de camarones en salmuera |
| Plato para hornear Pyrex | común en las tiendas | Opción para el cultivo de camarones | |
| en salmueramezcla de agua de mar artificial de 50 galones o más | Océano instantáneo; drsfoster-smith.com | CD-116528 | otras marcas pueden ser suficientes |
| Tina de plástico para la preparación de ASW | varios | comunes Bote de basura de plástico de 25 galones OK | |
| Garrafón de polipropileno | Carolina Suministro Biológico | 716391 Para stock de trabajo de ASW @ 12 ppt | |
| Vaso de precipitados, graduado, 4,000 mL | Laboratorios de Fitotecnología | B199 | Para dilución de 36 ppt ASW a 12 ppt |
| Microscopio estereoscópico y fuente de luz | varios | con aumento continuo de 1 a 40X |
Referencias
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